大粒徑磺酸基固相萃取填料的制備及其對弱堿性非法添加物的吸附性能評價

李爽,文湘郡,滕鑫,丁星宇,李壹,熊曉輝

(南京工業大學 食品與輕工學院,江蘇 南京,211816)

β-受體激動劑,俗稱瘦肉精,包括鹽酸克侖特羅、特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺等在內的十幾種化合物[1-2]。將此類藥物添加在動物飼料或飲水中能有效促進禽畜生長,提高胴體瘦肉率[3],但其殘留物被人體過量攝入后,會出現胸悶、頭痛、四肢麻木等諸多不良反應,長期食用還可誘發惡性腫瘤[2-4],因此我國農業部第176號公告已經明令禁止在飼料和動物飲用水中使用β-受體激動劑。三聚氰胺,是一種三嗪類含氮雜環有機化合物,化學式為C3N3(NH2)3,被廣泛用作化工原料,不可被添加到食品當中[5],但因其較高的氮含量(66%左右),被一部分不法商販惡意添加進奶制品中冒充蛋白質[6-7]。這些食品安全問題受到社會各界的廣泛關注,而如何高效快速地檢測出食品中可能存在的有害物質也成為研究的熱點。

目前常用于β-受體激動劑和三聚氰胺的檢測方法主要有液相色譜串聯質譜法[8-9]、氣相色譜串聯質譜法[10-11]、拉曼光譜法[12-13]、免疫分析法[14-15]等。目前液相色譜串聯質譜法是在定量檢測β-受體激動劑和三聚氰胺中應用最廣泛的方法。但由于食品樣品基質的復雜性,往往使得直接測定樣品中微量、痕量污染物較為困難,不僅準確度難以達到要求,對于儀器的損害也較大[16-17]。因此,在用儀器對樣品進行檢測之前的前處理過程就顯得格外重要[18]。固相萃取技術(solid phase extraction,SPE)以其高效、便捷和實用等眾多優點,在樣品前處理方式中占據了重要的位置[19-21]。

隨著檢測分析行業對固相萃取的使用需求不斷增加,固相萃取填料呈現多元化發展,其中以聚苯乙烯(polystyrene,PS)為代表的有機高分子聚合物基質固相萃取填料,因其比表面積大、表面反應力強、吸附能力強及性質穩定等優點[22-23],自出現以來就倍受分析者們的青睞。已有的磺酸基陽離子固相萃取填料大多采用濃硫酸磺化聚苯乙烯的方法,LI等[24]在用均勻的磺化聚苯乙烯微球作為模板制備可生物降解的殼聚糖中空微球時發現,用濃硫酸作為磺化劑,PS表面的磺酸基經過20 h的反應才飽和。WENG等[25]發現以濃硫酸為磺化劑的反應,需過量的硫酸才能反應完全。該方法耗費反應試劑,通常需要過量硫酸才能與聚苯乙烯反應完全[26],反應時間較長,反應溫度較高；且填料粒徑多在60～100 μm,進行固相萃取時耗時長,經常因樣品基質黏稠堵塞柱管。本研究以聚苯乙烯微球為基質,以氯磺酸為磺化劑對其表面進行磺化修飾,得到磺酸基陽離子固相萃取填料,即磺化的聚苯乙烯(sulfonated polystyrene,SPS),并對填料的粒徑、磺酸基擔載量進行優化。結合高效液相色譜聯用質譜法,用β-受體激動劑和三聚氰胺評價其吸附性能,對其在實際樣品中的應用能力進行評價,并結合Miscellaneous設計和響應面法,找到應用于實際樣品時,滿足檢測要求的材料最佳擔載量。本研究對制備大粒徑磺酸基陽離子固相萃取填料時節約試劑用量、節省反應時間、降低反應溫度,前處理時有效縮短固相萃取時間等方面具有重要實際意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Pure掃描電子顯微鏡,荷蘭Phenom公司；Vario ELcube元素分析儀,德國Elemental公司；Mastersizer 3000超高速智能粒度分析儀,英國Malvern公司；Nicolet IS5傅立葉紅外光譜儀、UItiMate3000高效液相色譜-TSQ Quantum Access MAX三重四極桿質譜聯用儀,美國Thermo Fisher公司。

PS微球(平均粒徑：170 μm),南京麥科菲高效分離載體有限公司；PS微球(平均粒徑：40 μm),無錫知益微球科技有限公司；空固相萃取柱(規格：3 cc/60 mg),深圳逗點生物技術有限公司；鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、克侖特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、三聚氰胺標準品,壇墨質檢國家標準物質中心；甲醇和甲酸(色譜純),美國Sigma-Aldrich公司；氯磺酸、四氯化碳(CCl4)、乙醇、四氫呋喃(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

3種β-受體激動劑及其同位素內標分別用甲醇配制成100 μg/mL的單標標準貯備液,-18 ℃避光保存；分別吸取適量的單標標準貯備液,用甲醇逐級稀釋成1 μg/mL的混合標準液,-18 ℃避光保存。三聚氰胺標準品用甲醇配制成1 μg/mL的單標標準貯備液,-18 ℃避光保存。

1.2 SPS的制備

采用超純水、乙醇和四氫呋喃洗滌PS微球,以除去PS表面的懸浮劑、單體和低分子物質,然后用乙醇洗滌5次,并真空干燥至恒重。將干燥的PS-DVB微球(2 g)添加到四頸燒瓶中,用CCl4(20 mL)溶脹3 h后,邊攪拌邊加入一定量的氯磺酸。在一定溫度下反應結束后,將材料依次用乙醇和超純水洗濾至中性,然后在水中浸泡過夜。次日,將材料用水洗濾至中性,用乙醇洗濾5次,并真空干燥24 h。

1.3 SPS的表征

使用Phenom Pure掃描電子顯微鏡觀察微球形貌；采用溴化鉀壓片法制片,使用紅外光譜儀測定微球表面官能團性質；使用Mastersizer 3000超高速智能粒度分析儀表征粒徑分布。硫含量分析采用氧瓶燃燒、硫酸鋇電位滴定法進行。根據公式(1)、公式(2)分別計算微球的擔載量和磺化度：

(1)

(2)

式中：LA,擔載量,mmol/g；X,硫元素質量百分比；MS,硫元素摩爾質量,g/mol；DS,磺化度,%；MPS,苯乙烯摩爾質量,g/mol；WSPS,磺化后SPS微球的質量,g；WPS,磺化前PS微球的質量,g。

1.4 固相萃取小柱的制備

在3 mL針筒型聚丙烯空柱管底部填入篩板,稱取60 mg填料填入柱中,適度振實、振平后,填料上端由篩板封住,用配套的裝柱推桿壓實,得到固相萃取柱。

1.5 不同PS微球制備固相萃取柱

分別選取2種粒徑不同PS微球,其平均粒徑分別為170和40 μm,比較其磺化的難易程度,并按1.2節和1.4節方法制備固相萃取柱,比較其對3種β-受體激動劑和三聚氰胺的動態吸附能力。

1.6 樣品處理

β-受體激動劑的樣品處理方法按照GB/T 22286—2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》[27]進行。三聚氰胺樣品參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[28]中第二法的方法進行前處理。

1.7 儀器條件

1.7.1 分析β-受體激動劑儀器條件

色譜條件：色譜柱為Kinetex LC Column C18(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為乙腈；梯度程序如下：0～1 min,97% A；1～3.5 min,97%～70% A；3.5～4.5 min,70% A；4.5～6.4 min,70%～25% A；6.4～6.5 min,25%～5% A；6.5～8.2 min,5% A；8.2～8.3 min,5%～97% A；8.3～10 min,97% A。流動相的流速設置為0.4 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源正離子電離(ESI+),電噴霧離子源溫度500 ℃,毛細管電壓5 500 V,霧化器流量為55 L/min。3種β-受體激動劑在多反應監測模式下的質譜檢測參數見表1。

表1 三種β-受體激動劑的串聯質譜檢測參數Table 1 Tandem mass spectrometry detection parameters of three β-receptor agonists

1.7.2 分析三聚氰胺儀器條件

色譜條件：色譜柱為Thermo AccucoreTMHILIC(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)；柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流動相A為2 mmol/L甲酸銨水溶液,流動相B為乙腈；梯度程序如下：0～2 min,10% A；2～4 min,10%～50% A；4～5 min,50% A；5～5.2 min,50%～10% A；5.2～7 min,10% A。流動相的流速設置為0.4 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源正離子電離(ESI+),定量離子：127.1>85.2,定性離子：127.1>68.4；毛細管電壓3 500 V,離子源溫度350 ℃,霧化器溫度300 ℃；裂解電壓77 V；定量離子的碰撞能量為17 V,定性離子的碰撞能量28 V。

1.8 填料最佳擔載量的選擇

1.8.1 β-受體激動劑的最佳擔載量選擇

應用Miscellaneous設計和響應面法研究2個自變量填料擔載量和加標濃度對3種β-受體激動劑回收率的影響,運用Design-Expert V8.0.6.1軟件設計方案,建立回歸模型,通過計算得到應用于實際豬肉樣品時,滿足檢測要求應選擇的材料最佳擔載量。1水平擔載量數值選用實驗制備所得最高擔載量(表2、表3)。根據實際情況調整,170 μm填料的擔載量選用0、1.39、3.05 mmol/g；40 μm填料的擔載量選用0、0.86、2.24 mmol/g。

表2 170 mm SPS應用于β-受體激動劑的Miscellaneous 試驗因素水平表Table 2 Levels and factors designed for 170 mm SPS fillers applied to β-receptor agonists Miscellaneous

表3 40 mm SPS應用于β-受體激動劑的Miscellaneous 試驗因素水平表Table 3 Levels and factors designed for 40 mm SPS fillers applied to β-receptor agonists Miscellaneous

1.8.2 三聚氰胺的最佳擔載量選擇

方法同1.8.1節,試驗因素水平如表4、表5所示。

表4 170 mm SPS應用于三聚氰胺的Miscellaneous 試驗因素水平表Table 4 Levels and factors designed for 170 mm SPS fillers applied to melamine Miscellaneous

表5 40 mm SPS應用于三聚氰胺的Miscellaneous 試驗因素水平表Table 5 Levels and factors designed for 40 mm SPS fillers applied to melamine Miscellaneous

2 結果與討論

2.1 微球的表征

2.1.1 SEM表征

使用掃描電子顯微鏡觀察材料的形貌。如圖1所示,改性后的SPS與PS對比,微球仍然保持良好的單分散性和球形度,形態無明顯變化。從圖1-a(1 300×、2 300×)系列可以看出,改性后的微球表面出現了大量凸起的顆粒物,這是由于磺酸基成功修飾到苯環上導致的。

a-170 μm的微球；b-40 μm的微球圖1 PS和SPS的SEM表征圖Fig.1 SEM of PS and SPS

2.1.2 紅外光譜表征

通過紅外光譜對獲得的產物進行表征。由圖2可知,與PS相比,SPS多出3個新峰:1個寬峰位于3 400 cm-1處,這歸因于被磺酸基團吸附的水分子的振動；位于1 168和1 034 cm-1處的2個峰,可以歸因于C—S鍵,表明產物的苯環上引入了磺酸基團；苯環C—H在1 715 cm-1處的吸收峰得到增強,并且隨著磺化度的增加,它成為一個寬而強的吸收帶[29]。

圖2 PS和SPS的紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of PS and SPS

2.1.3 粒徑分布

通過表征微球的粒徑(圖3),可以獲得磺化前后微球的單分散性和粒徑變化。PS微球在磺化處理之前具有良好的分散性,并且在用2種磺化劑處理后,粒徑均略有增加,單分散性變得更好,這是由于苯環上成功接枝磺酸基導致的。

a-170 μm的PS,SPS；b-40 μm的PS,SPS圖3 PS和SPS的Malvern Mastersizer粒徑分布圖Fig.3 Malvern Mastersizer droplet size distribution of PS and SPS

2.1.4 產物的元素分析

通過元素分析確定了SPS微球的元素組成,改性處理后,出現了大量PS微球元素組成中不存在的硫元素。使用元素分析結果,根據1.3節計算微球的擔載量,判定以下反應條件的優化。

2.1.5 擔載量的優化控制

2.1.5.1 反應時間對擔載量的影響

在25 ℃、PS微球與氯磺酸摩爾比為1∶1的條件下進行機械攪拌反應,探究擔載量與磺化時間之間的關系。結果如圖4所示,磺化反應速度非常快,隨著反應時間的增加,擔載量迅速增大,170 μm微球反應5 min即可達到3.05 mmol/g的擔載量。5 min后,擔載量隨反應時間的延長變化不大。反應條件相同時,170 μm PS比40 μm PS更容易被氯磺酸改性。

圖4 SPS微球擔載量隨時間的變化圖Fig.4 The chang of loading capacity of SPS microspheres with reaction time

2.1.5.2 PS載體磺酸基擔載量的可控性

在25 ℃條件下反應5 min,通過改變氯磺酸與PS微球的摩爾比,研究氯磺酸用量對PS載體擔載量的影響,結果見圖5。擔載量隨氯磺酸用量的增加而增大,并且呈近似線性關系(170 μm SPS：y=3.15x+0.08,R2=0.968 0；40 μm SPS：y=2.47x-0.28,R2=0.986 9)。將擔載量按照1.3節公式(2)換算成磺化度,則磺化度與氯磺酸用量也呈近似線性關系。由圖5-b可知,已得到的微球最大擔載量3.05 mmol/g，對應的磺化度為39.56%,如果氯磺酸含量持續增加,理論上磺化度接近100%時將不再增大,對應的PS載體擔載量此時會出現峰值。反應條件相同時,170 μm SPS比40 μm SPS擔載量更高,170 μm的PS更容易被氯磺酸改性。可見,氯磺酸的磺化具有良好的規律性,可以根據需要,通過控制氯磺酸的用量制備出不同磺化程度的磺化聚苯乙烯微球。

圖5 氯磺酸用量對反應結果的影響Fig.5 Effect of sulfonating agent amount on reaction注:圖中n為摩爾

2.1.6 材料的動態吸附能力

2.1.6.1 170 μm SPS填料的最佳擔載量

按照1.6節的實驗方法,依照實驗因素水平表2、表4分別進行13次試驗,以回收率為指標,各因素組合下3種β-受體激動劑及三聚氰胺回收率的結果分別如表6、表7所示。

(1)回歸方程與方差分析

以克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺回收率為響應值建立的二次回歸方程分別如公式(3)、(4)、(5)、(6)所示：

表6 β-受體激動劑的Miscellaneous試驗設計方案與結果Table 6 Experimental design and results by Miscellaneous of β-agonists

表7 三聚氰胺的Miscellaneous試驗設計方案與結果Table 7 Experimental design and results by Miscellaneous of melamine

Y1=-0.22+93.83A+0.08B+0.36AB-21.25A2+0.13B2

(3)

Y2=5.19+96.86A-14.19B+3.15AB-21.64A2+7.72B2

(4)

Y3=4.64+102.91A-12.85B+0.74AB-23.43A2+7.03B2

(5)

Y4=-6.32+30.47A+272.83B

(6)

方差分析表明：所得的回歸方程顯著程度非常高,Y1、Y2、Y3、Y4模型的F值分別為4 957.65、1 204.8、587.84、635.73,Y1、Y2、Y3的P值均<0.05,Y4的P值<0.000 1,表明該模型具有統計學意義。Y1、Y2、Y3、Y4的相關系數R2值分別為0.999 7、0.998 8、0.997 6、0.992 2,說明實測值與預測值擬合程度良好。失擬項值分別為0.373 2、0.339 6、0.075 5、0.668 1,均大于0.05,無失擬因素存在。因此該模型可以用于分析各因素對于3種β-受體激動劑及三聚氰胺回收率的影響,并優化預測滿足檢測條件的最佳擔載量。

Y1、Y2、Y3、Y4模型中因素A(擔載量)的P值均<0.000 1,因素B(加標濃度)的P值分別為0.278 1、0.008 2、0.349 3、0.059 5,因此,可得出各單因素對3種β-受體激動劑及三聚氰胺回收率影響的順序為：A(擔載量)>B(加標濃度)。

(2)各因素的交互作用分析

回歸方程模擬二因素對3種β-受體激動劑及三聚氰胺的回收率影響見圖6。

圖6 170 μm SPS填料的Y=(A,B)的響應曲面圖Fig.6 Responsive surface plot of Y=(A,B) for 170 μm SPS fillers

通過對三維響應曲面圖的分析,可以更加直觀地找出不同的變量因素制成的小柱對于3種β-受體激動劑回收率的影響。在圖6中,曲面的高度越高,顏色越深,則代表著回收率越好。其中Y4的響應曲面較為平整,說明因素擔載量與加標濃度之間無交互作用。可以看出,加標濃度對3種β-受體激動劑及三聚氰胺的回收率的影響甚微；而固相萃取填料的擔載量對回收率起著重要的作用。隨著填料擔載量的增加,3種β-受體激動劑和三聚氰胺的回收率均逐漸增大,在1 mmol/g左右時,3種β-受體激動劑的回收率已達到80%,在2.7 mmol/g左右時三聚氰胺的回收率達到80%,已基本滿足檢測的要求,隨后擔載量繼續增加,回收率變化不再明顯。

(3)實驗驗證

為使3種β-受體激動劑的回收率均在80%～120%,目標值接近100%,利用本模型得出最佳擔載量為1.38 mmol/g。此條件下,加標濃度為0.5 μg/kg時,模型對克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的回收率的預測值分別為89%、95%、98%。為了驗證本模型預測值的準確性,進行回歸模型的驗證實驗。根據實際制備得到的填料進行調整,選用擔載量為1.39 mmol/g的SPS填料裝柱,進行3次平行實驗,取平均值。實際測得克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的回收率分別為88%、97%、97%,與預測結果接近,說明優化結果可信,對確定最佳擔載量有實際指導作用。

為使三聚氰胺的回收率在80%～120%,目標值接近100%,利用模型得出最佳擔載量為3 mmol/g。此條件下,加標濃度為0.01 mg/kg時,模型對三聚氰胺的回收率的預測值為87%。根據實際制備得到的填料進行調整,選用擔載量為3.05 mmol/g的SPS填料裝柱,進行3次平行實驗,取平均值。實際測得三聚氰胺的回收率為88%,誤差較小,說明優化結果可信,對確定最佳擔載量有實際指導作用。

2.1.6.2 40 μm SPS填料的最佳擔載量

實驗及分析方法同2.1.6.1。為使3種β-受體激動劑的回收率均在80%～120%,目標值接近100%,利用本模型得出最佳擔載量為0.81 mmol/g。此條件下,加標濃度為0.5 μg/kg時,實際測得克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的平均回收率分別為87%、82%、81%。為使三聚氰胺的回收率在80%～120%,目標值接近100%,利用模型得出最佳擔載量為2 mmol/g。根據實際制備得到的填料進行調整,選用擔載量為2.24 mmol/g的SPS填料裝柱,此條件下,加標濃度為0.01 mg/kg時,實際測得三聚氰胺的回收率為83%,與預測值之間誤差較小,說明優化結果可信,對確定最佳擔載量有實際指導作用。

2.1.7 應用性能評價

將制備的填料的動態吸附能力與同類型Waters Oasis?MCX和安譜(CNW)MCX填料進行了比較,以提取豬肉中的β-受體激動劑和奶粉中的三聚氰胺。根據2.1.6的結果,在相同條件下,使用最佳擔載量的填料對0.5 μg/kg加標豬肉樣品進行SPE吸附,170 μm的填料的擔載量選用1.39 mmol/g,40 μm的填料的擔載量選用0.86 mmol/g。使用填料對0.01 mg/kg加標奶粉樣品進行SPE吸附時,170 μm的填料的擔載量選用3.05 mmol/g,40 μm的填料的擔載量選用2.24 mmol/g。實驗結果見圖7,結果表明,自制的填料性能均達到國際水平,對3種β-受體激動劑的回收率為81%～97%,相對標準差(relative standard deviation,RSD)為3.22%～8.98%。對三聚氰胺的回收率為82%～88%,RSD在2.45%～2.97%。從RSD結果可以看出,自制的材料在3個平行實驗中具有良好的平行性。其中,沙丁胺醇的提取平行性甚至優于CNW小柱。因此,本實驗制備的SPS填料適合豬肉中3種β-受體激動劑藥物和奶粉中三聚氰胺的富集和純化,可以推廣使用。Waters Oasis?MCX填料的平均粒徑為60 μm,安譜(CNW)MCX填料的平均粒徑為100 μm,2種商品化填料以及自制的40 μm填料在前處理實際樣品時均因為粒徑較小容易產生堵塞柱管、過柱時間長等問題,而本實驗制備的170 μm填料則避免了這些問題,具有樣品溶液過柱流暢、縮短固相萃取時間的優勢。

圖7 自制填料與MCX填料的比較Fig.7 Comparison of the self-synthetic sorbents with MCX sorbents

3 結論

本研究制備了擔載量可控的磺酸基陽離子固相萃取填料(磺化聚苯乙烯),并將其應用于β-受體激動劑和三聚氰胺的檢測分析當中。以PS微球為載體材料,以氯磺酸為磺化劑,制備了磺化聚苯乙烯微球,并對其粒徑和擔載量進行優化。通過控制磺化劑用量,可實現在0～3.5 mmol/g內磺酸基擔載量定量化可控。已有的磺酸基陽離子固相萃取填料大多采用傳統的濃硫酸法進行磺化反應,且填料的粒徑在60～100 μm,合成時間長、成本高,應用于前處理時易堵塞小柱,固相萃取時間長。本研究為填料的制備提供了一種新的思路,即使用氯磺酸作為磺化劑,制備更大粒徑(170 μm)的填料。采用該方法制備填料,大粒徑微球更易被磺酸基改性,且反應溫度低,磺化劑用量少,反應時間短,產品性能質量可控,成本大大降低；在滿足檢測要求的條件下,前處理過程中使用該填料,不易堵塞小柱,能夠縮短固相萃取時間。結合響應面軟件,得到滿足檢測條件的填料最佳擔載量。分析豬肉樣品中β-受體激動劑時,170 μm的填料的擔載量選用1.39 mmol/g；分析奶粉樣品中三聚氰胺時,170 μm的填料的擔載量選用3.05 mmol/g。本研究制備的最佳擔載量填料對3種β-受體激動劑的回收率為88%～97%,相對標準偏差為5.23%～8.99%；對三聚氰胺的回收率為88%,相對標準偏差為2.97%。填料性能滿足痕量檢測的要求,可應用于實際食品樣品中β-受體激動劑和三聚氰胺的濃縮富集。