體外模擬消化對暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽結構特征及抗氧化活性的影響

曹振海,樂彩虹,陶寧萍,2*,鄧尚貴

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,201306) 3(浙江海洋大學 食品與藥學學院,浙江 舟山,316000)4(浙江興業集團有限公司,浙江 舟山,316000)

膠原蛋白肽是以膠原蛋白或明膠為原料,在物理、化學和酶解的作用下得到水解物。與膠原蛋白相比,低分子質量的膠原蛋白肽表現出了更廣泛的生物活性和更強的生物利用度而受到市場的青睞,如抗氧化、抑菌,降血壓、抑制肥胖以及增強骨質特性等[1-2]。水生動物由于其優異的生物相容性和功能性以及無宗教信仰問題已成為膠原蛋白肽的最佳來源,被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品行業。前人[3]等研究了來源于金槍魚、鳳尾魚、魷魚等的混合副產物中不同級分的酸溶性膠原蛋白肽的生物功能活性,發現分子質量<1 kDa組分其抗氧化活性最高,DPPH自由基清除率可達81.6%,·OH清除活性高達91.0%,且乳化活性指數高達130 m2/g；JIN等[2]使用胰蛋白酶水解三文魚皮膠原,并從中篩選出了具備抑制與糖尿病發病機制有關的DPP-IV活性肽組分,其IC50為(0.79±0.13)mg/mL。LIU等[4]發現泥鰍皮膠原蛋白肽可通過Wnt/β-catenin通路減輕小鼠骨質疏松癥,并增強其骨生物力學特性。

隨著養殖暗紋東方鲀技術的成熟,規模化養殖暗紋東方鲀的需求日益增長,其魚皮是生產加工中主要的副產物之一,據前期實驗表明,暗紋東方鲀魚皮中膠原蛋白含量豐富,可達到總蛋白含量80%以上,是膠原蛋白肽理想來源。周瑞等[5]使用不同酶處理暗紋東方豚魚皮以提取膠原蛋白,結果表明胃蛋白酶提取的膠原蛋白得率最高,且能較好地保留膠原蛋白三股螺旋結構,但目前國內外對于暗紋東方鲀魚皮中的膠原蛋白活性肽的提取及其活性的探討研究極少。

研究表明,在體外顯示出生理活性的活性肽只有一小部分在體內被證明是有效的[6]。體內胃腸道消化會改變多肽的結構,進而影響其生物利用度。本實驗使用INFOEGEST體外模擬消化系統模型對不同分子質量的自制暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽(Takifuguobscurusskin collagen peptide,TOSCP)和市售魚皮膠原蛋白肽(commercial fish skin collagen peptide,CFSCP)進行體外消化實驗,探究了膠原蛋白肽在消化過程中的結構特征變化(微觀結構、分子質量、二級結構以及氨基酸含量)及其對抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽,實驗室自制；市售魚皮膠原蛋白肽,山東邁德豐生物科技有限公司。

胃蛋白酶(V900497,750 U/mg)、牛血清蛋白(色譜級),美國sigma公司；胰蛋白酶(YT7553,250 U/mg),合肥博美生物科技有限責任公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC),北京索萊寶科技有限公司；乙腈(色譜級),德國默克公司；其他試劑均為分析純,上海麥克林生物科技有限公司。

1.2 儀器和設備

SW22SET1恒溫振蕩水浴鍋,北京優萊博技術有限公司；H1850臺式高速離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司；L—8800氨基酸自動分析儀,日本日立公司；SU5000掃描電子顯微鏡,日立高新技術公司；Spotlight 400傅里葉變換紅外光譜儀,英國PerkinElmer公司；LSM710 NL0激光共聚焦顯微鏡,德國蔡司股份公司；Waters e2695高效液相儀,美國沃特世公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 TOSCP的制備

將1 cm×1 cm的暗紋東方鲀魚皮與3倍魚皮質量的水混合,于95 ℃水浴鍋中熱水浸提3 h,取出并冷卻后,調節浸提液的pH至6.0,在50 ℃下預熱10 min,加入復合蛋白酶(魚酶質量比50∶1)酶解1.5 h,待酶解反應完成后,將酶解液放入90 ℃水浴鍋中滅酶15 min,冷卻至室溫后以10 000 r/min轉速離心10 min,冷凍干燥上清液得TOSCP,得率為93.80%。

1.3.2 體外消化模擬

按INFOGEST體外模擬消化系統[7]對膠原蛋白肽進行消化,該模型包括胃、腸2個階段。胃液模擬液(simulated gastric fluid,SGF)和腸液模擬液(simulated intestinal fluid,SIF)的配制具體見表1。

模擬胃液消化液的配制以200 mL為例：稱取1.20 g胃蛋白酶與150 mL SGF濃縮液混合后,加入0.1 mL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O并用去離子水定容至200 mL,然后調節pH至2.0。模擬腸液消化液的配制同樣以200 mL為例,分別稱取0.16 g胰蛋白酶和1.70 g膽鹽與150 mL SIF濃縮液混合后,加入0.4 mL 0.3 mol/L的CaCl2·2H2O并定容至200 mL,調節pH至7.0。

表1 模擬消化液的配制Table 1 Preparation of simulated digestion fluids

將TOSCP和CFSCP溶解于去離子水中(5 g/L),預備等體積模擬胃液消化液并37 ℃水浴預熱5 min后,加入樣品,37 ℃恒溫振蕩(120 r/min)2 h。將胃消化后的消化液用1 mol/L NaOH調節pH至7.6,加入等體積模擬腸液消化液(37 ℃),37 ℃恒溫振蕩(120 r/min)2 h,完成消化。樣品經模擬胃、腸道消化,立即取出,通過沸水浴(5 min)滅酶,調節pH至7.0,10 000 r/min離心10 min,冷凍干燥,備用。

1.3.3 消化前后多肽表面微觀結構觀察

參考余韻[8]的方法并稍作修改,取少量粉末涂抹于貼有導電膠的樣品盤上,置于離子濺射儀的樣品艙中,噴金2 min,將樣品盤放入掃描電子顯微鏡觀察室,選取清晰視野進行觀察。

1.3.4 消化前后多肽微觀結構觀察

參考王笑涵等[9]的方法并稍作修改,取1 mL樣品和10 μL FITC溶液(1 mg/mL)混勻,靜置20 min。取10 μL染色液于載玻片上,靜置20 min,晾干后在FITC通道,20倍激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)下進行觀察,溶液配制及實驗操作全程避光。

1.3.5 消化前后多肽分子質量測定

參照GB 31645—2018《食品安全國家標準 膠原蛋白肽》中附錄A進行測定。

1.3.6 消化前后多肽消化率測定

參照JIANG等[10]的方法測定多肽消化率,計算方法如公式(1)所示:

(1)

式中：ρ0,消化前多肽含量,mg/mL；ρ1,消化后多肽含量,mg/mL。

標準曲線的繪制參考汪旭[11]的方法并稍作修改。用牛血清蛋白構建蛋白定量標準曲線,于540 nm下測定其吸光值。

樣品測定：取2.5 mL樣品,加入2.5 mL體積分數10%三氯乙酸溶液,振蕩混勻,靜置10 min,5 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,加4 mL雙縮脲試劑,振蕩混勻,放置30 min,于540 nm下測定其吸光值,將吸光值帶入標準曲線,可得樣品中的多肽含量。

1.3.7 消化前后多肽氨基酸測定

氨基酸含量：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.3.8 消化前后多肽紅外光譜測定

利用單點衰減全反射(attenuated total reflection,ATR)模式對樣品信息進行采集,室內干燥(空氣濕度<40%)。樣品的紅外譜圖以空氣為背景,去除干擾。譜圖掃描波數為4 000～600 cm-1,分辨率為±4 cm-1,信號累加32次。使用軟件PeakFit v 4.12對1 600～1 700 cm-1的區域進行基線校正以及二階導數擬合對膠原蛋白肽的二級結構進行分析[10]。

1.3.9 抗氧化活性的測定

參考樂彩虹等[12]的方法并稍作修改,取不同消化階段多肽產物,分別配制成1、5、10 mg/mL的多肽水溶液。

DPPH自由基清除率：取不同消化階段多肽水溶液各1 mL,分別加入1 mL DPPH溶液(0.4 mg/mL),混合均勻,室溫反應30 min后,取200 μL于96孔板中,于517 nm處測其吸光值A1,計算方法如公式(2)所示：

(2)

式中：A0,超純水代替樣品吸光值；A1,樣品吸光值；A2,超純水代替DPPH溶液吸光值。

總還原能力：取不同消化階段多肽水溶液各0.5 mL,加入2.5 mL PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH 6.6)和2.5 mL K4Fe(CN)6(體積分數1%)混勻,在50 ℃的水浴中反應20 min,迅速冷卻后加入2.5 mL 三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)(體積分數10%),混勻后在3 000 r/min下離心10 min,取上清液2 mL,加入2 mL H2O和1 mL FeCl3(體積分數0.1%)混勻,室溫放置10 min后于700 nm處測其吸光值。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3次,結果以平均值±標準偏差(mean±SD)表示。使用SPSS 23.0軟件對數據進行差異顯著性分析,P<0.05表示數據間存在顯著性差異；使用Origin 8.6(Origin Lab,USA)軟件處理和生成圖像。

2 結果與分析

2.1 消化前后多肽表面微觀結構

掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)是使用聚焦電子束觀察物質微納米尺度范圍的特征技術[13]。由掃描電鏡圖可知,TOSCP在120倍下呈大小不一的片狀并緊密排列,而CFSCP呈大小均一的小球狀排列,更加均勻細小,放大到1 000倍后,TOSCP呈不規則片狀、且表面帶有裂痕；CFSCP呈大小不一的球狀,且表面凹陷,這可能是CFSCP經過造粒等工藝處理,外觀更加細膩光滑。由圖1-b可知,TOSCP胃消化后在120倍下呈不規則的塊狀、小球狀,放大到1 000倍后,呈大小不一的球狀黏著在一起,光滑程度不一,可能是膠原蛋白肽為抵抗胃蛋白酶水解發生了皺縮以及凍干造成的；由圖1-e可知,CFSCP胃消化后形狀不規則,孔隙大小不均,放大到1 000倍后呈現不均一塊狀且表面有孔洞；這可能是大分子質量的CFSCP在胃蛋白酶作用下發生劇烈水解,肽鏈間作用力減小的原因導致,這與FANG等[14]體外模擬消化鰱魚蛋白后所觀察的結果相似。由圖1-c可知,TOSCP和CFSCP腸消化后在120倍下表面松散,呈絮狀,放大到1 000倍后呈排列不規則蜂窩網狀結構,表面有大小不一的孔隙,這一結構可有利于蛋白酶進入TOSCP和CFSCP內部,提高多肽消化程度。

圖1 TOSCP和CFSCP消化前后掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of TOSCP and CFSCP during each digestion stage注：A～C為TOSCP各消化階段在×120的SEM圖；a～c為TOSCP各消化階段在×1 000的SEM圖；D～F為CFSCP各消化階段在×120的SEM圖；d～f為CFSCP各消化階段在×1 000的SEM圖,比例尺表示400 μm

2.2 消化前后多肽微觀結構

采用FITC對2種膠原蛋白肽樣品進行染色,使用CLSM觀察了膠原蛋白肽體系在胃腸消化過程中的微觀結構變化。從TOSCP和CFSCP消化前的CLSM圖(圖2-A、圖2-a)中可以看出,2種樣品在未消化前均可觀察到明顯的綠色熒光(多肽)區域,但CFSCP的形狀更規則,接近于球形,與SEM顯示的結果一致,這可能是多肽粉末處理方式不同所致。從圖2-B、圖2-b可觀察到熒光顯色區域明顯減少,與傅丹宇[15]消化乳蛋白后熒光標記物的變化相一致,說明膠原蛋白肽經胃消化后含量均減少。TOSCP和CFSCP進一步經腸消化后(圖2-C、圖2-c),熒光物質基本消失。

圖2 TOSCP和CFSCP消化前后激光共聚焦圖Fig.2 CLSM image of TOSCP and CFSCP during each digestion stage注：比例尺表示250 μm

2.3 消化前后的分子質量分布以及多肽消化率

膠原蛋白肽分子質量大小與生物利用度直接相關,低分子質量的多肽在消化過程中可盡可能的保持完整并在組織中發揮活性[6]。多肽分子質量分布和多肽消化率可直觀體現在不同消化階段中多肽肽鍵斷裂情況及氨基酸存在形式。由TOSCP和CFSCP消化前后的分子質量比例分布圖(圖3)可知,TOSCP在消化前分子質量主要集中在0.2 k～1 kDa,比例為63.49%,其次為3 k～10 kDa和1 k～3 kDa,比例為19.22%和13.22%；CFSCP消化前分子質量>10 kDa的比例為27.82%,3 k～10 kDa為25.17%,1 k～3 kDa為21.37%,0.2 k～1 kDa為24.81%,其1 kDa以上的高分子質量多肽遠高于TOSCP。

TOCSP和CFSCP經胃消化后多肽消化率如圖4所示,分別為(22.40±1.57)%和(25.55±0.20)%,無顯著性差異(P≥0.05),TOSCP在胃消化階段顯示出了較好的抗消化性,且分子質量分布在各范圍內并無明顯變化；CFSCP經過胃消化后>10 kDa和1 k～3 kDa比例明顯減少,其他范圍比例增加,這可能因為CFSCP自身分子質量較大,更易在胃中被胃蛋白酶識別斷鍵,釋放小分子質量多肽和游離氨基酸,所

圖3 TOSCP和CFSCP消化前后分子質量比例分布Fig.3 Molecular weight ratio distribution of TOSCP和CFSCP during each digestion stage

圖4 TOSCP和CFSCP的多肽消化率Fig.4 Peptide digestibility of TOSCP and CFSCP during each digestion stage注：大寫字母不同代表不同膠原蛋白肽,同種處理差異顯著;小寫字母不同代表同種膠原蛋白肽,不同處理差異顯著(P<0.05),下同

以多肽消化率高于TOSCP,這說明胃蛋白酶對高分子質量多肽(>1 kDa)具有更強的嗜好性,其更加趨向于斷鍵大肽為小肽,破壞其可能形成的空間結構,并釋放部分游離氨基酸,這與大豆水解蛋白的體外模擬消化結果相似[16]。

TOSCP和CFSCP經腸消化后多肽消化率進一步增加,分別為(58.26±0.68)%和(59.57±2.81)%,兩者無顯著性差異(P>0.05)。但兩者之間分子質量分布存在區別,CFSCP中0.2 k～3 kDa的多肽含量顯著上升,這是因為CFSCP自身分子質量較大,且經胃蛋白酶作用可有效增加胰蛋白酶識別和切割位點數量[17],使肽鍵更易斷裂；而TOSCP經腸消化后,發現3 kDa以上的多肽比例大量減少,說明該組分更傾向于在腸道內被胰蛋白酶水解。值得注意的是,2種活性肽<1 kDa比例在2段消化過程中均出現明顯提高,TOSCP經腸消化后<1 kDa為85.39%,而CFSCP<1 kDa的比例明顯少于TOSCP,為52.55%,因此分子質量在1 kDa以下的膠原蛋白活性肽可有效抵制胃蛋白酶作用,并有效減少胰蛋白酶的水解。先前的研究證實,1 kDa以下的寡肽組分更易被吸收[18],因此經腸消化后的TOSCP<1 kDa比例更多,分子質量更小,更易吸收。

2.4 消化前后多肽紅外光譜分析及二級結構變化

TOSCP和CFSCP經胃腸消化后,2種膠原蛋白肽峰形均發生了變化。由于C—N伸縮和N—H彎曲振動,酰胺Ⅱ帶分別在TOSCP和CFSCP的1 537和1 528 cm-1處出現吸收峰。經胃消化后,TOSCP中酰胺Ⅱ帶的出峰位置不變,但CFSCP發生紅移,經腸消化后,二者均發生紅移,峰形也發生了變化,推測膠原蛋白肽亞基結構發生了變化。酰胺Ⅲ帶分別在TOSCP和CFSCP的1 244和1 241 cm-1處有明顯吸收峰,經胃消化后,TOSCP和CFSCP均無顯著變化,經腸消化后,均發生紅移,2種膠原蛋白肽變化趨勢一致,具體變化還有待進一步研究[20]。

圖5 TOSCP和CFSCP消化前后紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of TOSCP and CFSCP during each digestion stage

二級結構可從側面反映多肽分子的松散程度,多肽分子有序剛性結構的基礎可歸因于具備較多氫鍵的α-螺旋與β-折疊[20]。由圖6可知,TOSCP和CF-SCP在消化前二級結構主要以β-折疊為主,含量分

圖6 TOSCP和CFSCP消化前后二級結構含量Fig.6 The secondary structure contents of TOSCP and CFSCP during each digestion stage

別為29.64%和34.56%,表明2種膠原蛋白肽肽鏈間多以平行或反平行排列,這種有序的二級結構由于具備較大的氫鍵表面積而有利于多肽穩定性。經過胃消化后,2種膠原蛋白肽在酸性條件下經胃蛋白酶處理,β-折疊和無規卷曲含量減少,α-螺旋和β-轉角含量增加。這類變化可有效促進分子內部聚合,縮減肽鏈長度增強其機械強度,使其鏈間變得更加穩定以增強其對胃蛋白酶消化抵抗力[19],這與掃描電鏡圖(圖1)結果相對應。TOSCP和CFSCP進一步經腸消化后,2種多肽β-折疊進一步減少,而α-螺旋和β-轉角含量增加,這可能是因為β-折疊含量減少有助于α-螺旋的形成[21],同時多肽鏈反轉180°形成β-轉角[22],使消化期間多肽消化產物β-折疊含量減少,β-轉角含量增加。這一結構變化表明經胰蛋白酶作用后肽鏈間變得松散,而鏈內部收縮[21],形成蜂窩網狀結構。VANGA等[23]發現胰蛋白酶活性與β-折疊的含量呈負相關,與α-螺旋的含量呈正相關,由二級結構變化而引發的空間結構的改變可能會進一步改變酶的作用位點進而影響活性肽的消化,這可解釋TOSCP和CFSCP在腸消化階段的多肽消化率和氨基酸釋放率更高的原因。膠原蛋白活性肽經胃腸道消化后并不會完全水解成氨基酸,而是以一部分穩定的空間結構存在,并以α-螺旋結構為主。α-螺旋具備跨越生物膜磷脂雙分子層的能力可直接被人體吸收[24],因此膠原蛋白活性肽會在胃腸道酶的誘導下逐漸轉化為具備剛性結構的α-螺旋結構,進而被吸收。

2.5 消化過程中多肽氨基酸含量變化

膠原蛋白活性肽的氨基酸組成是影響其消化特性的重要因素,可通過各消化階段過程中各類氨基酸相對含量變化來揭示膠原蛋白肽的消化特性和對生物可及性的影響[6]。表2為TOSCP和CFSCP在模擬胃腸消化過程中氨基酸的相對含量。經胃消化,TOSCP和CFSCP的疏水性氨基酸的相對含量顯著降低(P<0.05),分別為2.26%和1.93%,這與酶的專一性有關,胃蛋白酶更嗜好于苯丙氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸殘基[25],這類氨基酸作為β-折疊結構的重要組成部分,它們的減少將進一步導致β-折疊結構的含量減少,與二級結構變化相對應[21]。經胃腸消化后,TOSCP和CFSCP中堿性氨基酸和疏水性氨基酸含量進一步降低,且具有顯著性差異(P<0.05),這可能與多肽序列差異有關,胰蛋白酶的反應位點一般是緊鄰精氨酸或賴氨酸的肽鍵[25],因此含有更多堿性氨基酸的多肽比含有更多酸性氨基酸的肽更易被消化。經過胃腸消化,TOSCP和CFSCP兩種多肽在消化過程中的各類氨基酸含量變化相似,且脯/羥脯氨酸可有效抵制胃腸蛋白酶作用(P<0.05)[26],呈現了較強的抗消化性,這與ZHONG等[27]的研究結果相似。結合多肽消化率和氨基酸含量、分子質量的變化可知,膠原蛋白活性肽在胃消化階段主要以大肽斷鍵為主,而在腸消化階段,多肽的疏水性、堿性氨基酸殘基作為特異性反應位點被水解,釋放大量1 kDa以下的多肽。

表2 TOSCP和CFSCP在各消化階段氨基酸相對含量變化 單位：%

續表2

2.6 消化前后多肽抗氧化性變化

抗氧化活性是膠原蛋白活性肽的重要功能特性之一,可有效遏制心血管疾病的發生,抵制由自由基引發的脂質過氧化所導致的各類疾病[6,12],故選取抗氧化性作為消化過程中多肽生物穩定性的判斷指標?？寡趸钚耘c多肽結構特征密切相關,如分子質量、特定氨基酸組成以及二級結構[6]等,通過對不同消化階段中多肽的DPPH自由基清除率和總還原力的測定,探究膠原蛋白活性肽消化過程中結構特征變化對膠原蛋白肽生物穩定性的影響。

DPPH自由基作為一種穩定自由基,其中心結構中的氮原子可與多肽自由基清除劑配對,使其還原為DPPH-H非自由基形式,以此來判斷其抗氧化活性。在各濃度梯度下,TOSCP和CFSCP在不同消化階段展現出相同的變化趨勢,在消化前,TOSCP和CFSCP抗氧化活性差異較大,在5 mg/mL質量濃度下,TOSCP和CFSCP的DPPH自由基清除率分別為49.59%和7.89%(P<0.05)。經胃消化后,TOSCP和CFSCP的抗氧化活性均出現顯著提高(5 mg/mL,P<0.05),在10 mg/mL質量濃度下,CFSCP的DPPH自由基清除率可達28.77%,較未消化前活性上升3.60倍,這可能是因為胃蛋白酶的作用,使先前未表現或潛在的活性肽從親本序列中釋放出來生成新的抗氧化多肽,或經水解后更多具備抗氧化活性的疏水性氨基酸殘基被暴露,使抗氧化活性升高[6]；經過胃腸消化后,TOSCP的抗氧化活性出現小幅度下降(P>0.05),這是因為特定的氨基酸相對含量的變化以及其序列中位置的改變所導致,由于胰蛋白酶作用,使具備抗氧化活性的疏水性氨基酸從肽鏈完整結構中釋放致使抗氧化活性降低；同時已有研究證明,多肽α-螺旋結構增加可降低其抗氧化性,因此在消化過程中,α-螺旋結構的增加也是降低其抗氧化活性原因之一[13]。

A-DPPH自由基清除率；B-總還原能力(樣品濃度為5 mg/mL)圖7 TOSCP和CFSCP消化前后抗氧化活性變化Fig.7 Antioxidant activity changes of TOSCP and CFSCP during each digestion stage

多肽的總還原能力強弱可通過吸光度的大小來反映,并與吸光度數值呈正比[12]。在5 mg/mL質量濃度下TOSCP和CFSCP在不同消化階段中總還原能力變化趨勢和DPPH自由基清除率相似,但在消化前或消化中任何一階段TOSCP還原能力顯著高于(P<0.05)CFSCP,這可能與分子質量大小有關,小分子質量的TOSCP更易在N末端暴露出更多具備抗氧化活性的疏水性氨基酸和支鏈氨基酸[25],另外,TOSCP中高含量甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸可通過作為H+供體促進肽與自由基的反應,表現出較高的抗氧化活性[3]。BUSTAMANTE等[28]使用堿性蛋白酶、糜蛋白酶和風味酶水解乳清蛋白制備的不同分子質量多肽,發現低分子質量水解物具備更高的抗氧化活性；WU等[1]從鮭魚皮中截取分子質量<3 kDa的膠原蛋白肽組分,該組分DPPH自由基清除率可達73.29%；CHI等[29]從藍鰭金槍魚皮中制備純化了3種具有抗氧化性能的膠原蛋白肽,其分子質量均<1 kDa。因此多肽分子質量集中分布于1 kDa以下的TOSCP在胃腸消化過程中的抗消化性和結構完整性優于CFSCP,由此表現出較高的抗氧化活性。

3 結論與討論

本文利用INFOGEST體外消化模型探究了TOSCP和CFSCP在不同消化階段中結構特征變化及其對抗氧化活性的影響。結果表明,小分子質量的TOSCP表現出了更好的抗消化性和生物穩定性。TOSCP和CFSCP在胃消化階段中多肽消化率分別為22.40%和25.55%,胃蛋白酶主要以斷鍵大肽為小肽為主,且對高分子質量膠原蛋白活性肽(>1 kDa)具有更強的選擇專一性；消化過程中發現,1 kDa以下多肽能有效抵制胃腸蛋白酶作用,且由于酶的專一性,脯氨酸和羥脯氨酸表現出了優越的抗消化性能,疏水性氨基酸和堿性氨基酸更易釋放；多肽會在胃腸道酶誘導下逐漸轉化為具備剛性結構的α-螺旋結構,并在掃描電鏡下可觀察到蜂窩網狀結構。1 kDa以下的多肽在胃腸消化過程中可保持結構完整性并發揮其抗氧化活性,因此集中分布于1 kDa以下的TOSCP在不同消化階段中其抗氧化活性始終較高；胃消化過程中小分子質量多肽的釋放均促進了TOSCP和CFSCP抗氧化活性提高,但經過胃腸2個階段消化后,α-螺旋結構的增加、具有抗氧化活性的疏水性游離氨基酸的大量釋放將導致抗氧化活性下降,該研究為膠原蛋白多肽功能性制品的研發提供實驗依據。