植物乳桿菌F3-2聯合甘露低聚糖通過上調短鏈脂肪酸水平抑制PPARγ改善小鼠肥胖

趙茂臻,梁曦,張喆,呂優優,王引,劉同杰,易華西,公丕民,張蘭威

(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266000)

在不斷尋求安全有效的減肥措施過程中,某些益生菌或益生元得到了廣泛關注。甘露低聚糖(mannooligosaccharides,MOS)作為一種益生元,在改善肥胖方面表現出良好的作用效果。研究發現MOS能夠調節腸道菌群結構,增加短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)水平,改善高脂飲食誘導的肥胖[1]。臨床研究也證明MOS能夠降低人體血脂水平,減少人體腹部脂肪量,有效減輕體重[2-4]。此外,研究表明,部分益生菌,如雙歧桿菌、植物乳桿菌等,能夠降低體重、抑制脂質積累,具有良好的改善肥胖效果[5-7]。

合生元是益生菌與益生元的混合制劑,可通過合生元改變飲食結構,或對宿主脂代謝有積極作用,從而達到改善肥胖的效果。前人研究發現,乳桿菌聯合MOS能夠顯著改善高脂飲食引起的肝損傷和肝臟脂肪細病變[8]。MOS也被證明能夠促進腸道中乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的生長,具有益生作用[9]。但其與益生菌聯合作用對肥胖病癥的改善作用研究的并不多且作用機制也不明確。盡管如此,合生元已成為膳食干預改善肥胖的新策略。

本研究以前期實驗獲得的具有良好減肥效果的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)F3-2聯合MOS干預高脂飲食誘導肥胖小鼠,對其作用效果進行評價,以進一步探究二者相互作用的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

L.plantarumF3-2,中國海洋大學功能性乳品與益生菌實驗室保藏；6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠,山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；低脂飼料(D12450B)、高脂飼料(D12492),北京維通利華實驗動物技術有限公司；奧利司他,山東新時代藥業有限公司；血清中甘油三酯(triglyceride,TG)、血清總膽固醇(serum total cholesterol,TC)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；Trizol裂解液,美國Invertrogen；逆轉錄試劑盒、Power SYBR Green PCR Master Mix,東洋紡生物科技有限公司；二乙基丁酸、乙酸標準品、丙酸標準品、丁酸標準品,德國Dr.Ehrenstorfer；MOS(93%),上海源葉科技生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

Multiskan FC酶標儀,北京普朗新技術有限公司；NIKON/Ni-E電動熒光顯微鏡,日本尼康公司；NanoDrop2000超微量分光光度計、LineGene9600實時熒光PCR儀,賽默飛世爾科技公司；TP600PCR擴增儀,寶日醫生物技術有限公司；高溫低速組織研磨儀,武漢賽維爾生物科技有限公司；GC6890氣相色譜儀,安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株

將L.plantarumF3-2在MRS中37 ℃條件下培養24 h,于1 100×g,4 ℃條件下離心5 min收集菌體,用PBS洗3遍。將菌體重懸到PBS(pH 7.4)中,采用平板計數法[10]調整濃度到108CFU/mL。

1.2.2 小鼠飼養與分組

將24只6周齡雄性C57BL/6小鼠置于光照12 h、溫度(20±2)℃、相對濕度(50±10)%條件下,適應性喂養1周,期間飲水自由。實驗經中國海洋大學食品科學與工程學院實驗動物倫理委員會批準,倫理審查號為SPXY20181118215。

適應性喂養1周后,小鼠被隨機分為4組,每組6只。分別為低脂飼料對照組(normal control,NC)、高脂飼料對照組(high-fat diet,HFD)、MOS干預組(MOS)、L.plantarumF3-2聯合MOS干預組(F3-2+MOS)。NC組喂低脂飼料,其余3組喂高脂飼料。從第7周開始,NC組和HFD組每天灌胃0.2 mL PBS；MOS組每天灌胃含有MOS(6 g/kg BW)的PBS；F3-2+MOS組每天灌胃0.2 mL含有MOS(6 g/kg BW)的菌懸液。實驗共干預6周。每周測量1次小鼠體質量。

1.2.3 小鼠組織及血清

將小鼠麻醉后采用眼眶靜脈叢取血法收集血液,并用頸椎脫位處死小鼠。將血液在3 000×g,4 ℃條件下離心20 min,收集上清液即為血清。切除脂肪組織及肝臟,稱質量。血清、脂肪組織及肝臟被移至-80 ℃ 凍存,用于下一步分析,避免反復凍融[11]。

1.2.4 脂肪組織病理學分析

將小鼠附睪脂肪組織用生理鹽水沖洗干凈,置于脂肪專用固定液。用石蠟包埋,組織切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法。使用電動熒光顯微鏡對圖像進行分析[12]。

1.2.5 血清脂質測定

血清中TG、TC的濃度按商業試劑盒的說明進行測定[11]。

1.2.6 逆轉錄聚合酶鏈反應分析脂代謝關鍵基因

根據先前實時熒光定量PCR方法[13],用Trizol試劑提取附睪脂肪組織中總RNA。使用逆轉錄試劑盒,利用PCR擴增儀將RNA反轉錄生成cDNA。采用Power SYBR Green PCR Master Mix通過實時逆轉錄聚合酶鏈反應對RNA表達水平進行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 逆轉錄聚合酶鏈反應的引物序列Table 1 Primer sequence of reverse transcription polymerase chain reaction

1.2.7 小鼠糞便中SCFAs測定

根據先前SCFAs測定方法[16]采用氣相色譜法測定其SCFAs的濃度。將0.1 g的樣品與1 200 μL的蒸餾水混勻后,與50 μL 50%濃硫酸混合進行酸化。室溫下,每分鐘渦旋1次,持續5 min。5 000×g離心10 min。取上清液500 μL,用0.22 μm濾器過濾,加入50 μL過膜的二乙基丁酸作為內標,加入500 μL無水乙醚,漩渦振蕩30 s,5 000×g離心10 min。取上層乙醚150 μL,12 000×g離心10 min后將上清液轉移至液相小瓶中。采用內標法利用氣相色譜儀測定濃度,每次上樣1 μL。

1.2.8 統計分析

實驗重復3次。采用IBM SPSS 22.0軟件進行統計學差異分析。所有結果均表示為平均值±標準差。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。#P<0.05 對照NC組,*P<0.05 對照HFD組。

2 結果與分析

2.1 L.plantarum F3-2聯合MOS對小鼠體質量、脂肪組織質量的影響

如圖1所示,各組小鼠經適應性飼養1周后,體質量沒有顯著差異。干預6周實驗結束后,HFD組小鼠體質量與NC組相比體質量增加了40.39%(P<0.05)。而MOS減緩了小鼠體質量增長趨勢,相比HFD組減少了14.16%(P<0.05)。當L.plantarumF3-2聯合MOS干預時,相比HFD組,小鼠體質量減少了18.33%(P<0.05)。可以認為,MOS能有效減輕高脂飲食誘導肥胖小鼠體質量,聯合L.plantarumF3-2在一定程度上加強MOS改善肥胖的作用效果。

圖1 L.plantarum F3-2聯合MOS對小鼠體質量的影響Fig.1 The effect of L.plantarum F3-2 combined with MOS on body weight

如表2所示,高脂飲食飼喂的小鼠各部分脂肪質量與NC組相比顯著增加(P<0.05)。MOS干預后,各部分脂肪組織質量相比HFD組有下降的趨勢,但差異并不顯著。而與L.plantarumF3-2聯合作用時各部分脂肪組織質量顯著下降(P<0.05)。說明L.plantarumF3-2聯合作用MOS能有效抑制脂肪組織擴張。

表2 L.plantarum F3-2聯合MOS對小鼠脂肪組織質量的影響Table 2 The effect of L.plantarum F3-2 combined with MOS on fat tissue weight of mice

2.2 L.plantarum F3-2聯合MOS作用減下小鼠脂附睪脂肪細胞大小

為了進一步觀察小鼠脂肪組織病變情況,對小鼠脂肪組織進行切片染色,分析各組處理對小鼠附睪脂肪細胞的大小的影響,結果見圖2。對照NC組,高脂飲食顯著增加了附睪脂肪細胞平均大小。MOS干預后細胞明顯變小。L.plantarumF3-2聯合MOS干預后,明顯減小了脂肪細胞大小。通過軟件分析附睪脂肪細胞平均面積,給予MOS的脂肪細胞平均面積明顯減小,相比HFD組減小了31.99%(P<0.05),L.plantarumF3-2與MOS聯合作用減小了63.49%(P<0.05)。進一步驗證了L.plantarumF3-2聯合MOS能夠有效抑制脂肪組織擴張,減輕脂肪組織質量。

a-小鼠附睪脂肪組織病理切片(HE染色);b-脂肪細胞平均面積圖2 L.plantarum F3-2聯合MOS干預對小鼠附睪脂肪細胞大小的影響Fig.2 The effect of L.plantarum F3-2 combined with MOS intervention on the size of mouse epididymal adipocytes

2.3 L.plantarum F3-2聯合MOS作用對血清TG、TC含量的影響

為了明確被干預后小鼠血脂水平變化情況,對各組小鼠血清中TG、TC含量進行分析,結果如表3所示。MOS能顯著改善高脂飲食引起的血清TG含量的升高。當L.plantarumF3-2與MOS聯合作用時,顯著降低了血清中TG水平,相比HFD組下降了32.93%。各干預組對血清中TC含量均沒有顯著作用效果。說明MOS能通過降低血清中TG含量減少脂質堆積,L.plantarumF3-2聯合作用加強了MOS的作用效果。

表3 L.plantarum F3-2聯合MOS對血清TG、TC含量的影響 單位：mmol/L

2.4 L.plantarum F3-2聯合MOS作用降低附睪脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ和CCAAT/增強子結合蛋白-α基因表達

為了探究L.plantarumF3-2聯合MOS有效改善肥胖的作用機制,對各組小鼠附睪脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)及CCAAT/增強子結合蛋白-α(CCAAT/enhancer binding protein-α,C/EBPα)基因表達量進行分析,結果見圖3。高脂飲食喂養小鼠附睪脂肪組織中PPARγ基因表達量顯著升高,相比NC組增加了41.20%(P<0.05)。灌胃MOS后,附睪脂肪組織中PPARγ基因的表達量顯著降低,減少了54.30%(P<0.05)。當L.plantarumF3-2和MOS同時作用時,PPARγ基因表達量顯著低于MOS單獨作用,相比HFD組減少了74.46%(P<0.05)。同樣C/EBPα基因表達量變化趨勢同PPARγ類似。

a-PPARγ表達量；b-C/EBPα表達量圖3 L.plantarum F3-2聯合MOS對附睪脂肪組織中脂代謝關鍵基因表達量的影響Fig.3 The effect of L.plantarum F3-2 combined with MOS on the expression of key genes of lipid metabolism in epididymal adipose tissue

2.5 L.plantarum F3-2聯合MOS作用對SCFAs濃度的影響

為了進一步探究L.plantarumF3-2聯合MOS抵抗高脂飲食誘導肥胖的作用機制,對各組小鼠糞便中SCFAs水平進行了分析,結果見圖4。高脂飲食導致小鼠糞便中主要SCFAs濃度顯著下降。MOS干預后,顯著升高了乙酸、丙酸及丁酸濃度(P<0.05)。當L.plantarumF3-2聯合MOS作用時,乙酸、丙酸、丁酸濃度被顯著提升,特別是丁酸濃度,相比HFD組升高了109.89%(P<0.05)。發現甘露寡糖能有效提升高脂飲食誘導肥胖小鼠糞便中主要SCFAs的濃度,L.plantarumF3-2聯合作用后能進一步提升糞便中丁酸的濃度。

圖4 L.plantarum F3-2聯合MOS對干預對高脂飲食誘導肥胖小鼠糞便中主要SCFAs含量的影響Fig.4 The effect of L.plantarum F3-2 combined with MOS on the main SCFAs content in the stool of obese mice induced by high-fat diet

3 結論與討論

MOS在改善抗肥胖方面表現出極大的潛力,被證明能夠促進有益菌生長,對宿主腸道健康產生積極影響[17-18]。反之,腸道菌及其益生菌對MOS的功能又會產生什么影響,是否能產生更有益的協調效果,是一個值得深入思考的問題。本文將前期實驗獲得的能改善肥胖的L.plantarumF3-2與MOS聯合作用于高脂飲食誘導的肥胖小鼠,對其聯合作用效果進行探究。發現L.plantarumF3-2與MOS聯合作用時在抑制脂肪積累、減肥方面具有協同效果。

進一步探究L.plantarumF3-2加強MOS效果的作用機制。MOS不能被動物直接消化吸收,但能被嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等代謝分解生成SCFAs[11,19],也有研究表明,益生菌干預能影響腸道菌群中主要產SCFAs相關菌群的豐度。例如LactobacillusplantarumHAC01能提高小鼠腸道內Allobaculum的豐度,Allobaculum是產SCFAs的屬之一,與體重增加呈負相關[11]。因此本研究對小鼠糞便中主要SCFAs濃度進行了分析,發現MOS能顯著提升小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸的濃度,這也與前人研究結果一致[20]。而L.plantarumF3-2聯合作用后,3種主要SCFAs濃度均被提高,特別是丁酸的濃度。推測L.plantarumF3-2與MOS聯合作用,能夠通過提升糞便中主要SCFAs水平特別是丁酸水平來抵抗高脂飲食誘導肥胖。

前人研究表明,SCFAs通過抑制脂肪組織中PPARγ的表達來改善肥胖[21]。為進一步探究其機制,對小鼠脂肪組織中PPARγ和C/EBPα等基因表達量進行分析。發現L.plantarumF3-2聯合MOS作用時,附睪脂肪中脂代謝關鍵基因PPARγ和C/EBPα等表達量被顯著下調,L.plantarumF3-2加強了MOS對脂肪組織中脂代謝關鍵基因表達的抑制作用,而且各組之間的差異性與SCFAs趨勢一致。因此推測,MOS能夠通過增加SCFAs水平抑制脂肪組織中PPARγ等脂代謝關鍵基因的表達從而改善肥胖,而L.plantarumF3-2加強了MOS對肥胖的改善作用,但其如何影響SCFAs水平等作用機制作仍需進一步探究。

綜上,本研究發現MOS能有效減輕小鼠體質量、脂肪組織質量、降低血清TG含量,證實了其在改善肥胖方面的良好作用效果。補充L.plantarumF3-2,可加強MOS的作用效果,其作用機制可能是增加SCFAs特別是丁酸的濃度,進一步下調脂肪組織中脂代謝關鍵基因PPARγ等的表達量,抑制脂肪組織擴張,改善肥胖病癥。