短小芽孢桿菌HN-10抗菌肽P-1對粉紅單端孢細胞膜結構和活性氧代謝的影響

武淑娟,贠建民,王睿,何奎,毛永強,趙風云,張紊瑋,艾對元

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)

粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)是引起果蔬采后病害的重要病原物[1],它不僅能夠侵染果蔬產品,造成嚴重的經濟損失,而且產生的次級代謝產物單端孢霉烯毒素具有生物毒性[2]。目前,控制由T.roseum引起的果蔬采后病害主要依賴于化學合成的殺真菌劑[3],但是化學合成殺菌劑的長期使用,易引起藥物殘留,污染環境并影響人類健康,甚至增加病原體的抗藥性[4]。因此,選擇替代或減少化學合成殺菌劑,研究相應的抑菌物質具有重大意義[5]。

抗菌肽又名抗微生物肽[6],是一類小分子的多肽類物質,具有抗真菌的生物學特性且不易產生耐藥性,有望成為化學藥物替代品,應用潛力和價值巨大[7]。實驗室前期從腐敗的濕粉條中分離得到了1株對粉紅單端孢具有拮抗作用的芽孢桿菌,經鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) HN-10,利用B.pumilusHN-10發酵液開展了拮抗實驗研究[8]；嚴海嬌等[9-10]通過硫酸銨沉淀、AB-8大孔吸附樹脂、Sephadex G-100凝膠和半制備型反相高效液相色譜法對B.pumilusHN-10發酵液進行逐級分離純化,獲得了抗真菌肽P-1,并證實了B.pumilusHN-10抗菌肽P-1僅對粉紅單端孢具有抑菌作用;明確了其氨基酸序列和分子質量,分別是GGSGGGSSGGSIGGR和1 149.14 Da；郭娟等[11]采用轉錄組學和蛋白組學初步分析了抗菌肽P-1對粉紅單端孢胞內核酸,以及蛋白質的影響,但尚未明確其抑菌機理。

本試驗以粉紅單端孢為供試菌,基于平板培養和液態培養體系,采用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色和透射電鏡技術觀察、結合系列生理生化指標測定,從細胞壁、膜結構變化、膜通透性以及膜脂過氧化等方面,探討B.pumilusHN-10抗菌肽P-1處理對粉紅單端孢細胞膜結構和活性氧(reactive oxygen species,ROS)代謝的影響,以期闡明抗菌肽P-1的抑制作用機理,為紅粉病害控制及新型生防治劑的開發應用提供理論依據和支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：抗菌肽P-1,分離純化于短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) HN-10。

試驗菌株：粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)CICC 2703,中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1B.pumilusHN-10抗菌肽P-1的粗提和分離純化

參照嚴海嬌等[9]的方法測定。

1.2.2T.roseum孢子懸浮液制備

參照劉志恬等[12]的方法制備。

1.2.3 抗菌肽P-1抑菌效果的測定

采用牛津杯法進行抑菌實驗。在PDA平板中央滴1滴(約2 μL),1×108個/mL的T.roseum孢子懸浮液,然后在孢子懸浮液等距2 cm處放置4個牛津杯,吸取抗菌肽P-1 1 μL滴加于牛津杯中,等量無菌蒸餾水做為空白對照,置于28 ℃培養箱中培養7 d,采用十字交叉法測定抑菌直徑。實驗設3個重復。

1.2.4 抗菌肽P-1對T.roseum孢子細胞膜完整性和超微結構的影響

細胞膜完整性采用PI染色檢測,具體參照WANG等[13]的方法測定,其超微結構變化參照HELAL等[14]的方法進行測定。

1.2.5 抗菌肽P-1對T.roseum菌體生長曲線的測定

在150 mL PDA 液體培養基中接種120 μL密度為1×108個/mL的孢子懸浮液和1 μg/mL的抗菌肽P-1,28 ℃,200 r/min 培養0、1、3、5、7 d,10 000 r/min離心20 min分別收集菌絲,80 ℃ 烘干至恒重,稱量質量。每組重復3次。

1.2.6 抗菌肽P-1對T.roseum菌體細胞膜上麥角甾醇含量的影響

參考LIU等[15]的方法進行測定。

1.2.7 抗菌肽P-1對T.roseum細胞膜通透性的影響

細胞外膜通透性參照付永巖等[16]的方法進行測定；電導率參照王雪燕等[17]的方法；脂質過氧化參照PUSHPANATHAN等[18]的方法；蛋白羰基化參照段麗菊等[19]的方法；丙二醛(malondialdehyole,MDA)含量參照王霆等[20]的方法。

1.2.8 抗菌肽P-1對T.roseum菌體活性氧代謝的影響

1.3 數據分析和處理

全部數據用Excel 2010計算平均值和標準偏差,使用Origin 9.0軟件作圖。用SPSS 19.0進行差異顯著性分析及相關性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 B.pumilus HN-10抗菌肽P-1的純化

由表1可知,B.pumilusHN-10抗菌肽P-1經過硫酸銨沉淀、AB-8大孔吸附樹脂、Sephadex G-100凝膠進行了分級純化,最終得到了抗菌肽P-1。結果顯示,經過逐級純化的抗菌肽P-1對粉紅單端孢具有明顯的抑菌作用。

表1 不同純化方式對粉紅單端孢的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of different purification methods against T.roseum

2.2 抗菌肽P-1抑菌效果的測定

抗菌肽P-1對T.roseum的抑菌作用如圖1,抗菌肽P-1對粉紅單端孢菌體生長具有明顯抑制作用,抑菌圈直徑達到(12.1±0.10) mm。

1-加入抗菌肽P-1；CK-對照圖1 抗菌肽P-1對T.roseum的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of antifungal peptide P-1 on T.roseum

2.3 PI檢測抗菌肽P-1對T.roseum孢子細胞膜完整性的影響

PI為非膜滲透性熒光染料,可以染色細胞核,質膜完整的細胞中,PI無法正常進入細胞,因而可以利用這一性質觀察細胞核是否被染色,若能觀察到熒光則證明質膜不完整。在熒光顯微鏡下觀察,正常的細胞不能被染上紅色,只有細胞膜被破壞的細胞才能發出紅色熒光,并且早期凋亡的細胞紅光比較微弱,晚期凋亡的細胞紅光變強[22]。由圖2可知,處理組中隨著抗菌肽P-1時間的延長,被PI染色的孢子數逐漸增多(圖2-d～圖2-f),處理組可觀察到明顯熒光,而對照組(圖2-a～圖2-c)幾乎無熒光。由此說明抗菌肽P-1破壞了T.roseum孢子的細胞膜完整性。

a-對照4 h；b-對照8 h；c-對照-12 h；d-處理4 h；e-處理8 h；f-處理12 h圖2 抗菌肽P-1對T.roseum孢子質膜完整性的影響Fig.2 Effect of antifungal peptide P-1 on plasma membrane integrity of T.roseum spores

2.4 抗菌肽P-1對T.roseum孢子超微結構的影響

為了進一步驗證抗菌肽P-1對T.roseum孢子的破壞作用,通過透射電鏡觀察正常菌體及被抗菌肽P-1處理的菌體細胞形態、細胞壁、膜及細胞器的變化情況,從細胞水平分析抗菌肽P-1對菌體的影響[23]。對照組孢子結構完整且緊密,壁、膜平滑完整,胞內橫隔膜完整且細胞器分布均勻(圖3-a)。抗菌肽P-1處理4 h后,有些菌體壁、膜邊緣變得粗糙不平,甚至出現局部的破損缺口(圖3-b)。處理8 h時,菌體內橫隔膜內陷斷裂細胞壁薄厚不均甚至殘缺,細胞質外滲出現電子密度高的陰影,細胞器分布紊亂(圖3-c)。延長處理時間至12 h時,觀察到細胞器不規則且模糊,細胞質內含物大多消失,細胞質大量外滲,孢子變形(圖3-d)。由此可知,抗菌肽P-1處理破壞了T.roseum菌體的超微結構,且處理時間越長,破壞越嚴重。

Cw-細胞壁;Cm-細胞膜;Cy-細胞質a-對照0 h(×18 000)；b-處理4 h(×25 000)；c-處理8 h(×21 000)；d-處理12 h(×21 000)圖3 抗菌肽P-1對T.roseum孢子超微結構的影響Fig.3 Effect of antifungal peptide P-1 on ultrastructure of T.roseum spores注：a-×18 000；b-×25 000；c、d-×21 000

2.5 抗菌肽P-1對T.roseum菌體生物量和細胞膜麥角甾醇含量的影響

菌體生物量如圖4-a,對照組的T.roseum生長良好,具有典型微生物的生長曲線特征,在第5天進入穩定期,第7天時達到最大生物量為0.171 g。而處理組生長曲線位于對照組下方,生長曲線呈現為平緩的下降趨勢。結果說明抗菌肽P-1能夠明顯抑制T.roseum的生長繁殖。

麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組分,主要以自由態的形式存在于磷脂雙分子層中,在維持細胞膜流動性方面起著重要的作用[24]。麥角甾醇的缺失或降低,會導致真菌細胞膜結構破壞及功能的喪失[25]。因此,麥角甾醇含量的變化是衡量細胞膜受損的主要指標。由圖4-b可知,隨著時間的延長,麥角甾醇含量呈下降趨勢,且在每個時段,處理組的麥角甾醇含量顯著低于對照組(P<0.05),第7天時,相比對照組,減少了35%(P<0.05)。結果表明,抗菌肽P-1可以有效抑制T.roseum麥角甾醇的合成,引起細胞膜結構和功能受損,從而達到抑菌作用。

a-T.roseum菌體生物量；b-麥角甾醇含量圖4 抗菌肽P-1處理對T.roseum菌體生物量和麥角甾醇含量的影響Fig.4 Effects of antifungal peptide P-1 treatment on T.roseum biomass and ergosterol content注：豎線代表標準偏差(±SD),*代表組內差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 抗菌肽P-1對T.roseum細胞膜通透性的影響

2.6.1 熒光染料N-苯基-1-萘胺攝取率的測定結果

N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)是一種疏水熒光探針,在水環境中不會發出熒光,但在疏水環境中會發出強烈的熒光[26]。因此可以利用熒光染料NPN來評價抗菌肽P-1通過T.roseum細胞外膜的能力。圖5反映了T.roseum胞內熒光NPN攝取率隨培養時間的變化情況。結果顯示,在整個培養過程中,隨著時間的延長,NPN攝取率呈現增強趨勢,且在每個時段,處理組的NPN攝取率顯著高于對照組(P<0.05)。在第7天時,其高出對照組24%(P<0.05),說明抗菌肽P-1處理可造成T.roseum細胞外膜通透性增大,使NPN與膜上的磷脂分子中的疏水基結合,產生熒光。

圖5 抗菌肽P-1處理對T.roseum菌體NPN熒光吸收強度的影響Fig.5 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on NPN fluorescence absorption intensity of T.roseum cells

2.6.2 電導率測定結果

電導率的變化可反映細胞膜滲透性的改變[27]。圖6顯示,隨著培養時間的增加,處理組菌體細胞相對電導率明顯高于對照組,在第7天,比對照組高35%(P<0.05),表明抗菌肽P-1處理使T.roseum細胞膜的滲透性發生改變,導致細胞內外滲透壓的調節能力下降,使細胞失水或脹破,從而起到抑菌作用。

圖6 抗菌肽P-1處理對T.roseum菌體相對電導率的影響Fig.6 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on relative conductivity of T.roseum cells

2.7 抗菌肽P-1對T.roseum菌體活性氧代謝的影響

圖7 P-1處理對T.roseum菌體的影響Fig.7 Effect of P-1 treatment on superoxide anion of T.roseum

2.7.2 對抗氧化酶系(SOD、CAT、POD)和H2O2含量的影響

圖8反映了P-1處理對參與ROS反應的相關抗氧化酶系活力和H2O2含量的影響。隨著培養時間的延長,SOD活性呈現下降趨勢,第1、3天,處理組的SOD活性都顯著低于對照組(P<0.05)(圖8-a)；CAT活性呈先增大后減小的趨勢,處理組的CAT活性顯著高于對照(P<0.05)(圖8-b)；POD整體呈現增大的趨勢,且處理組的POD活性顯著高于對照組(P<0.05)(圖8-c)；H2O2含量呈現下降的趨勢,且處理組的H2O2的含量顯著低于對照組(P<0.05)(圖8-d)。結果表明抗菌肽P-1處理加劇了T.roseum胞內的抗氧化程度。

a-SOD活力；b-CAT活力；c-POD活力；d-H2O2含量圖8 抗菌肽P-1處理對T.roseum 菌體SOD活力、CAT活力、POD活力及H2O2含量的影響Fig.8 Effect of antifungal peptide P-1 on SOD,CAT,POD activity and the content of H2O2 in T.roseum

2.7.3 對脂質過氧化、蛋白羰基化的影響

脂質和蛋白是細胞膜的主要組成部分,由ROS大量積累引起的脂質和蛋白的氧化損傷,可直接影響T.roseum的正常生理活動。由圖9可知,隨著培養時間的延長,處理組的脂質過氧化值(OD535)高于對照組,第7天時,OD535高于對照組55%(P<0.05)(圖9-a)；處理組蛋白羰基含量顯著高于對照組。第7天時,羰基含量高于對照組71.96%(P<0.05)(圖9-b)。上述結果表明抗菌肽P-1處理使T.roseum細胞膜氧化損傷引起的脂質過氧化和蛋白羰基化程度加深。

a-T.roseum菌體OD535；b-羰基含量圖9 抗菌肽P-1處理對T.roseum菌體OD535和羰基含量的影響Fig.9 Effect of P-1 treatment on OD535 and carbonyl content of T.roseum

2.7.4 對MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化作用的主要產物之一,一般利用其含量作為膜脂過氧化的指標,反映細胞膜脂質過氧化的程度[28]。由圖10可知,處理組MDA含量顯著高于對照組,第7天時,MDA含量比對照組高67.6%(P<0.05)。表明抗菌肽P-1處理使菌體發生膜脂質過氧化反應,引起菌體MDA含量升高,最終導致細胞膜受損。

圖10 抗菌肽P-1處理對T.roseum菌體MDA含量的影響Fig.10 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on MDA content of T.roseum

3 討論與結論

本試驗從超微結構、細胞膜通透性及ROS代謝3個方面研究了抗菌肽P-1處理對T.roseum有抑菌作用。液體培養結果顯示,抗菌肽P-1處理能夠明顯抑制T.roseum菌體生物量的增加,通過超微觀察發現P-1破壞了T.roseum孢子的細胞壁膜、局部出現了缺口、細胞質大量流出,致使孢子的形態發生了劇烈的變化,胞質變得不均勻。這可能是抗菌肽P-1抑制T.roseum菌體生長的主要原因[29]。

細胞膜是主要由磷脂構成的富有彈性的半透性膜,麥角甾醇可以與磷脂結合形成穩定磷脂相,進而增加細胞膜的穩定性[30]。本研究結果顯示,抗菌肽P-1處理使T.roseum細胞膜上麥角甾醇含量減少,可能是由于抗菌肽P-1抑制了麥角甾醇的生物合成途徑,使膜的結構和完整性受到影響,使NPN這種對細胞外膜敏感性熒光染料透過了細胞外膜,與膜上的磷脂雙分子層中的疏水基產生了結合；同時,抗菌肽P-1處理后T.roseum菌體細胞相對電導率的不斷增大,進一步證明抗菌肽P-1處理破壞了細胞膜的結構,改變了膜的穩定性。

本研究從超微結構、膜通透性以及ROS代謝的研究中推測出抗菌肽P-1對粉紅單端孢的抑菌機理可能是通過破壞T.roseum菌體膜的完整性,改變膜的通透性,以及誘導ROS在胞內的積累,引起氧化脅迫反應,從而導致細胞膜完整性喪失,菌體生長受到抑制。