黃酒貯存陳釀關鍵酸敗微生物的生物學特征

羅雪,柯鋒,劉文容,徐巖,陳雙*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(勁牌有限公司,湖北 黃石,435100)

黃酒是中國民族特色的酒精飲料[1],其典型特征是越陳越香。長期貯存陳釀是生產高品質黃酒必須的工藝環節,但由于黃酒中含有豐富的糖類、氨基酸及多肽等營養物質,易造成微生物污染生長,故在陳釀過程中時常出現酸敗變質現象[2-6],給黃酒產業造成嚴重的經濟損失[7-8]。

根據黃酒酸敗現象的不同,黃酒酸敗主要分為醋酸酸敗和乳酸酸敗[9],其中乳酸酸敗是造成高酒精度陳釀黃酒出現酸敗現象的主要原因,而乳桿菌(Lactobacillus)是引起乳酸酸敗的主要微生物。在密閉環境中、較高酒精度(18%,體積分數)條件下,乳酸酸敗時常發生。劉文容等[10]首次采用未培養技術與可培養技術相結合的方法,明確了食果糖乳桿菌(L.fructivorans)和耐酸乳桿菌(L.acetotolerans)為引起陳釀黃酒發生酸敗的主要微生物。章志超等[11]在確定從酸敗黃酒中分離得到的酸敗微生物為食果糖乳桿菌后,優化了食果糖乳桿菌的最佳培養條件：在pH值為5.4的MRS固體培養基上,加入質量分數為0.08%的L-半胱氨酸和體積分數為9%的乙醇,30 ℃下培養。但目前,對黃酒陳釀酸敗微生物的生物學特征的相關研究較少,對酸敗微生物的生理生化特征認識不清,缺乏控制黃酒酸敗微生物的有效措施,這已成為黃酒產業發展的限制因素[12-13]。

貯存陳釀過程的微生物酸敗是酒精飲料行業中普遍存在的問題。日本學者研究清酒微生物酸敗現象發現,食果糖乳桿菌和同型腐酒乳桿菌(L.homohiochi)是導致清酒貯存陳釀酸敗的主要微生物[14-16],這2種酸敗微生物都具有很高的酒精耐受度,兩者適宜生長的pH值都大約在4.5～5.0[17-18]。食果糖乳桿菌具有較好的耐熱性,在巴氏滅菌結束后仍可能繼續存活[19-20]。研究啤酒微生物酸敗現象發現,導致啤酒酸敗的主要酸敗微生物是耐酸乳桿菌,這類酸敗微生物具有很強的乙醇耐受性和酒花耐受性[21-22]。由于對啤酒和清酒酸敗微生物生物學特征的系統研究,目前啤酒和日本清酒中都建立了針對這類酸敗微生物的有效控制方法體系。

針對黃酒貯存陳釀過程中存在的酸敗微生物的生物學特征認識不清的問題,本研究通過對黃酒陳釀關鍵酸敗微生物——食果糖乳桿菌和耐酸乳桿菌的生理生化特征進行分析,包括營養需求、糖分消耗、生長溫度耐受、酒精耐受等4個方面,為黃酒陳釀過程中酸敗微生物的科學控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

菌種:食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans)和耐酸乳桿菌(Lactobacillasacetotolerans),江南大學釀造微生物與應用酶學實驗室保藏；正常黃酒酒樣,紹興某黃酒廠按照傳統紹興黃酒釀造工藝釀造。

1.1.2 試劑和儀器

無水乙醇,國藥集團化學試劑有限公司；甲瓦龍酸,北京百靈威科技有限公司；MRS培養基,美國Oxoid公司；厭氧培養盒、厭氧產氣袋,日本三菱瓦斯化學株式會社；全波長酶標儀,Thermo公司。

1.1.3 培養基

粉末狀MRS培養基：8.0 g牛肉膏,20.0 g葡萄糖,10.0 g蛋白胨,2.0 g檸檬酸三銨,0.2 g MgSO4,2.0 g K2HPO4,5.0 g乙酸鈉,0.05 g MnSO4,4.0 g酵母提取物,1 mL山梨醇單油酸酯,終pH調至5.7。

添加甲瓦龍酸的MRS培養基：5.0 mg甲瓦龍酸,52.0 g粉末狀MRS培養基,800～850 mL無菌水,150～200 mL無水乙醇,終pH調至5.0。

培養基滅菌條件：115 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酒關鍵酸敗微生物理化特征分析

1.2.1.1 酸敗微生物營養需求分析

本研究用生態板(Biolog-ECO)方法探究了黃酒酸敗微生物的營養需求情況。首先取10 mL黃酒酸敗微生物培養液(處于對數生長期),經1 000 r/min離心5 min后,將細胞沉淀置于裝有接種液的10 mL通用(general purpose,GP)管中重懸混勻,再取100 μL上述重懸液轉移到GP2微孔板中(GP2微孔板中有氨基酸、有機酸糖類等95種底物),最后將微孔板置于厭氧、30 ℃環境中培養72 h后,在波長為590 nm下測定吸光度,并與以水為底物的A1微孔板在相同情況下測定的吸光度作差值,得到酸敗微生物對各種營養物質的吸收情況。

1.2.1.2 酸敗微生物對不同含量還原糖利用情況分析

首先取未發生酸敗的黃酒酒樣,將酒樣糖含量分別調至2、5、10 g/L,再在酒樣中接種2%的酸敗微生物培養液(處于對數生長期),在厭氧、30 ℃條件下培養46 d,同時在培養過程中測定黃酒中糖度和酸度的變化情況。

1.2.1.3 酸敗微生物溫度耐受分析

首先取未發生酸敗的黃酒酒樣,將酒樣糖含量調至10 g/L,保證微生物可正常生長,再在黃酒酒樣中接種2%的酸敗微生物培養液(處于對數生長期),最后將上述酒樣置于溫度分別為11、20、25、30、35和40 ℃下,厭氧培養20 d后,測定不同溫度下培養得到的黃酒在波長為600 nm下的吸光度,判斷溫度變化對黃酒酸敗微生物生長產生的影響。

1.2.1.4 酸敗微生物酒精耐受分析

首先在MRS-甲瓦龍酸培養基中添加無水乙醇,將各個培養基的酒精度(體積分數)分別調到14%、18%、20%、23%、25%和30%,再在培養基中接種2%的酸敗微生物培養液(處于對數生長期),最后在厭氧、30 ℃條件下培養2周,測定培養基中酸敗微生物數量和還原糖變化量,探究酸敗微生物在不同酒精度培養基中的生長狀況。根據工廠的實際生產情況,首先取未發生酸敗的黃酒酒樣(酒精度為14%)添加無水乙醇,將黃酒的酒精度分別調到14%、18%、20%、23%、25%和30%,再在黃酒中接種2%的黃酒酸敗微生物培養液(處于對數生長期),最后在厭氧、30 ℃條件下培養2周,測定黃酒中酸敗微生物數量和還原糖變化量,探究酸敗微生物在不同酒精度黃酒中的生長狀況。

2 結果與分析

2.1 酸敗微生物營養需求特征解析

選擇耐酸乳桿菌30-1、19-1-1和食果糖乳桿菌13-2、7-2進行實驗,培養結束后,接種不同酸敗微生物的GP2微孔板與以水為底物的A1微孔板在波長590 nm下的吸光度差值變化情況如下表1所示。

表1 酸敗微生物對不同營養物質的利用情況Table 1 The use of different nutrients by spoilage microbes

酸敗微生物主要以糖類作為能源物質,能夠消耗部分有機酸,基本不消耗氨基酸。在糖類中,酸敗微生物對葡萄糖的利用能力最強,對麥芽糖的利用能力次之,可以利用少量環糊精,幾乎不利用淀粉作為能源物質；在有機酸中,可以利用部分乳酸、L-蘋果酸、丙酮酸,幾乎不利用乙酸。耐酸乳桿菌對麥芽糖的利用能力明顯高于食果糖乳桿菌,而食果糖乳桿菌對環糊精的利用能力則更強。傳統黃酒中含有糖分、有機酸及氨基酸等營養物質,這些營養物質特別是糖類能夠為酸敗微生物的生長提供有利條件,因此可以通過控制黃酒中糖分的含量來抑制酸敗微生物的生長。本研究還發現，黃酒中酸敗微生物與日本清酒中的酸敗微生物在營養需求上具有一定的相似性。日本清酒中的酸敗微生物也是主要利用葡萄糖作為能源物質,還能夠消耗丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸等有機酸作為營養物質[16]。

2.2 還原糖含量對黃酒關鍵酸敗微生物的影響

比較黃酒酸敗關鍵微生物在不同糖含量黃酒中糖分消耗和酸度的變化情況,如圖1和圖2所示。在不同糖分含量的黃酒中,2類微生物的生長趨勢大體一致,黃酒的有機酸含量均隨著還原糖的消耗而上升,說明2類酸敗微生物代謝黃酒中的糖分生成了有機酸。糖代謝和有機酸生成曲線顯示黃酒中的還原糖含量越高,酸敗微生物代謝產生的有機酸含量就會越高,當黃酒中的總酸含量達到一定濃度時,就會發生酸敗現象,因此可以通過調節黃酒糖度來控制黃酒中的有機酸含量,預防黃酒發生酸敗。黃酒陳釀過程中酸敗現象的發生和黃酒發酵過程是相似的。在黃酒發酵過程中,乳酸菌代謝糖類產生乳酸,導致黃酒中酸度上升,當酸度達到一定濃度時,黃酒就會發生酸敗現象[23]。

a-還原糖含量2 g/L；b-還原糖含量5 g/L；c-還原糖含量10 g/L圖1 還原糖含量黃酒對耐酸乳桿菌30-1代謝的影響Fig.1 The effects of reducing sugar content in Huangjiu on the metabolism of L.acetotolerans 30-1

a-還原糖含量2 g/L；b-還原糖含量5 g/L；c-還原糖含量10 g/L圖2 還原糖含量黃酒對食果糖乳桿菌13-21代謝的影響Fig.2 The effects of reducing sugar content in Huangjiu on the metabolism of L.fructivorans 13-21

2.3 溫度對黃酒關鍵酸敗微生物的影響

分析黃酒中2類關鍵酸敗微生物在不同溫度下的生長情況。如圖3和圖4所示,在20～30 ℃,2種酸敗微生物菌體濃度較高,生長情況較好,而在11和40 ℃條件下,2種酸敗微生物幾乎不能生長。在11 ℃的低溫環境下,酸敗微生物的生命活動受到影響,生長受到抑制。在40 ℃條件下,培養得到的黃酒中幾乎不存在酸敗微生物,表明在該溫度下長時間培養會導致酸敗微生物死亡。為驗證該結論的一般性,從上述兩類酸敗菌中分別挑選8株菌株,將微生物培養液(處于生長對數期)接種到正常陳釀的黃酒中,再將黃酒置于30、40 ℃條件下,厭氧培養,觀察記錄酸敗微生物的生長狀況,所得結果如表2所示。在30 ℃條件下,2種酸敗微生物的生長狀況良好,而在40 ℃條件下,2種酸敗微生物幾乎不能生長,從而驗證了上述結論的一般性。因此,通過控制黃酒在較低的儲藏溫度或在黃酒殺菌過程中優化殺菌的溫度、時間等參數能夠一定程度上抑制酸敗微生物的生長,防止黃酒酸敗現象的發生。這與章志超等[11]從酸敗黃酒中分離得到的食果糖乳桿菌在溫度方面的單因素試驗結果基本吻合。分離得到的食果糖乳桿菌在30 ℃時生長得最快,當溫度升高時,食果糖乳桿菌的生長逐漸受到抑制,可計數菌落逐漸減少。

a-耐酸乳桿菌7-2；b-耐酸乳桿菌19-1-1圖3 耐酸乳桿菌在不同溫度下的生長狀況Fig.3 The growth of L.acetotolerans at different temperatures

圖4 食果糖乳桿菌7-2在不同溫度下的生長狀況Fig.4 The growth of L.fructivorans 7-2 at different temperatures

表2 耐酸乳桿菌和食果糖乳桿菌在不同溫度下的生長狀況Table 2 The growth of L.fructivorans and L.acetotolerans at different temperatures

2.4 酒精度對黃酒關鍵酸敗微生物的影響

選擇耐酸乳桿菌30-1、19-1-1和食果糖乳桿菌13-2、7-2進行實驗,培養結束后,不同酒精度培養基中酸敗微生物數量及還原糖變化量的測定結果如表3和圖5所示。結果表明,在低酒精度(14%,體積分數)下酸敗微生物的生長能力很強,2種酸敗微生物的數量增加較多,對還原糖的消耗量較大,有明顯的生長跡象。隨著培養基中的酒精度上升,耐酸乳桿菌和食果糖乳桿菌的生長逐漸受到抑制。當酒精度達到23%(體積分數)時,培養基中的2種酸敗微生物仍然能夠生長產酸。當酒精度達到25%(體積分數)以上時,培養基中的2種酸敗微生物不存在生長跡象,生長明顯受到抑制。

表3 不同酒精度培養基中酸敗微生物的數量 單位：個/mL

圖5 不同酒精度培養基中微生物對還原糖的消耗情況Fig.5 The consumption of reducing sugars by spoilage microbes in different alcoholic medium

為了驗證黃酒酸敗微生物在真實黃酒中的酒精耐受性,根據工廠的實際生產情況,分析不同酒精度黃酒中酸敗微生物數量及還原糖變化量的測定結果。如表4和圖6所示,與食果糖乳桿菌7-2、13-1相比,耐酸乳桿菌19-1-1、30-1在黃酒中具有更強的生長能力。在較低酒精度下,黃酒中耐酸乳桿菌的數量最多,對還原糖的消耗量較高,最高可達到17.86 g/L；而食果糖乳桿菌在不同酒精度黃酒中的數量相對較少,對還原糖的消耗量相對較低,都在4.5 g/L以下。當酒精度達到23%(體積分數)時,黃酒中的2種酸敗微生物仍然能夠生長產酸。當酒精度達到25%(體積分數)以上時,黃酒中的2種酸敗微生物不存在生長跡象,生長明顯受到抑制。從以上的結果分析可以得到,食果糖乳桿菌和耐酸乳桿菌對酒精的耐受能力很強,在低酒精度下有較強的生長能力,在23%(體積分數)的酒精度下仍存在生長跡象,在25%(體積分數)的酒精度下生長受到抑制作用。與黃酒酸敗微生物相似,啤酒和日本清酒的酸敗微生物也具有較高的酒精耐受性,清酒酸敗微生物可達20%(體積分數)以上的酒精耐受性[16]；而食醋中的微生物和黃酒酸敗微生物相反,幾乎不具有酒精耐受性[24]。

表4 不同酒精度黃酒中酸敗微生物的數量 單位：個/mL

圖6 不同酒精度正常陳釀黃酒中微生物對還原糖的消耗情況Fig.6 The consumption of reducing sugars by spoilage microbes in Huangjiu with different alcoholicity

3 結論

本研究從微生物營養需求、糖分消耗、生長溫度耐受、酒精耐受4個方面探究了黃酒陳釀關鍵酸敗微生物的生物學特征。黃酒酸敗微生物主要以糖類作為能源物質,能夠利用部分有機酸,不利用氨基酸,其中對葡萄糖的利用能力最強。黃酒酸敗微生物會利用酒體中的還原糖產酸,低糖條件下,酸敗微生物代謝產生的有機酸含量不足以導致黃酒發生酸敗。黃酒酸敗微生物在20～30 ℃生長能力極強,在11和40 ℃下,生長受到明顯的抑制。黃酒酸敗微生物的酒精耐受性極強,在低酒精度下,有利于酸敗微生物的生長；在23%(體積分數)的酒精度下,酸敗微生物仍存在生長跡象；在25%(體積分數)的酒精度下,酸敗微生物的生長受到抑制。因此,通過控制黃酒的糖濃度、酒精度以及儲存溫度可有效預防黃酒酸敗。以上對黃酒陳釀酸敗微生物生物學特征的研究,為控制黃酒酸敗微生物生長提供了一定的理論基礎。