常壓室溫等離子體誘變選育抗后酸化的乳酸菌

周虹瑾,霍向東,趙丹,林青,婁愷,袁華偉*

1(新疆大學 生命科學與技術學院,新疆 烏魯木齊,830000) 2(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室,新疆 烏魯木齊,830091) 3(宜賓學院 質量管理與檢驗檢測學部/固態發酵資源利用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)

酸乳在儲藏、運輸、銷售和消費過程中,pH值會持續降低,出現酸味過重、乳清分離等一系列感官品質下降的問題,即后酸化現象[1],直接影響酸乳貨架期及乳酸菌的活菌數量。

對于抗后酸化的研究,目前主要集中在改變加工工藝、基因工程技術及誘變育種3個方面。通過調整發酵酸乳中球菌與桿菌的比例(1.5∶1),能有效地減輕酸乳的后酸化,但易受到其他條件影響,效果不穩定[2]。巴氏殺菌或瞬時高溫滅菌技術是以降低乳酸菌的活菌數(<106CFU/mL)為代價,抑制乳酸菌利用乳糖發酵產酸,極大地降低了酸乳的益生功能。研究人員利用載體 pGhost9:ISS1,經復制型轉座構建保加利亞乳桿菌突變體,得到3株具有抗后酸化能力的保加利亞乳桿菌菌株[3-4],其生物學性狀穩定,回復突變率低,但外源DNA轉化困難且存在應用困境。

誘變育種是目前選育抗后酸化菌株最為有效的途徑,包括物理誘變、化學誘變、原生質體融合等。韓雪等[5]采用紫外線對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行誘變處理,得到低溫敏感型突變菌株,能有效抑制酸乳的后酸化,但存在可見光修復問題,最適條件有待進一步研究。羅紅霞等[6]對乳酸菌進行原生質體融合,利用青霉素進行篩選,獲得2株在貯藏過程中后酸化程度明顯減弱的菌株,但融合子的不穩定性、雜種細胞間的異源基因相互排斥等問題仍有待解決。利用新霉素對保加利亞乳桿菌進行誘變,可篩選出H+-ATPase弱化菌株,當酸度超過閾值時,乳酸菌產酸能力顯著下降[7]。此外,將紫外線誘變和1.5%硫酸二乙酯復合誘變結合,突變菌株能抗酸乳后酸化[8]。

研究認為,H+-ATP酶活性與轉運H+能力有關,H+-ATPase弱化菌株的本質是酸敏菌株[7],即在正常的酸度下H+-ATPase正常行使其功能,保持乳酸菌的耐酸性；當酸度超過閾值時H+-ATPase酶活性顯著弱化,乳酸菌產酸能力則顯著下降。

本研究采用常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)[9]對菌株進行誘變處理,結合新霉素篩選得到低H+-ATP酶活性突變株,測定突變菌生長特性并進行酸奶發酵實驗,以期得到具有抗后酸化能力的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) B15由新疆特殊環境微生物實驗室分離、鑒定及保藏。

1.1.2 試劑與培養基

新霉素、PCR Master Mix擴增試劑盒、Bradford蛋白檢測試劑盒、溶菌酶、Na2ATP、HCl、鉬酸銨、H2SO4、甲苯、Na2SO3、對甲基氨基苯酚,生工生物工程(上海)股份有限公司；MRS瓊脂、MRS肉湯,青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ARTP-II誘變系統,無錫源清天木生物科技有限公司；電熱恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司；PCR儀,美國Bio-Rad；pH計,德國Sartoris；Fresco17離心機,Thermo Fisher Scientific Inc.；電泳儀、凝膠成像系統,北京六一生物科技有限公司；分光光度計,上?？迫A生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ARTP誘變

將L.paracaseiB15接種至MRS肉湯中進行活化與擴大培養,離心收集對數生長期的菌體,根據已有研究[10-11],將菌體稀釋為5×106CFU/mL后進行ARTP誘變。將10 μL菌懸液均勻涂布于金屬板上,放置在ARTP誘變系統樣品處理室,與氣流端口間距調整到2 mm[12]。ARTP的工作參數如下：射頻功率輸入100 W；工作氣體純氦的流量10 L/min[13]。在控制上述條件的情況下,設置對照組,將涂有菌懸液的金屬板以不同處理時間(0、10、15、20、30、45、60、90 s)暴露在處理端口下。結束誘變后,用無菌生理鹽水洗脫樣品,再以梯度稀釋方法將不同濃度的懸液涂布于MRS瓊脂平板上,從而測定ARTP誘變劑量。對照組和實驗組均將在37 ℃培養48 h,致死率按公式(1)計算:

(1)

式中：S,對照培養基上的單菌落數；M,每個處理組培養基上的菌落數,單位均為菌落形成單位(colony formal units,CFUs)[14]。

1.3.2 突變菌株的篩選

選擇85%致死率對應的時間(30 s)作為ARTP誘變處理時間[15],將處理后的菌株同樣使用梯度稀釋法進行稀釋。將稀釋后的懸液(100 μL)涂布在添加了不同質量濃度新霉素(100、200、300、400、500 mg/L)MRS瓊脂平板上,而未添加新霉素MRS瓊脂平板則作為空白對照。在相同條件下(37 ℃,48 h)培養,記錄單菌落數,陽性篩選率按公式(2)計算:

(2)

式中：S′,不含新霉素的對照組MRS瓊脂平板菌落計數；M′,不同濃度新霉素MRS瓊脂平板單菌落數。

選擇陽性篩選率50%以上的平板所對應的新霉素濃度作為突變菌株的篩選條件,將從MRS瓊脂平板上獲得的突變菌株接種于MRS肉湯(3 mL)中,進行下一步的篩選和驗證。通過篩選獲得的菌株在-80 ℃超低溫冰箱進行保存。

1.3.3 初步篩選具有抗后酸化潛力的突變株

1.3.3.1 生長狀況和pH值測定

將篩選得到的突變株和對照組均接種于同樣培養條件下的MRS肉湯中,接種量3%,37 ℃培養24 h,每隔2 h取樣1次,測定OD660 nm與pH值的變化。

1.3.3.2 H+-ATP酶的提取與活性測定

將對照組與突變株均接種到MRS肉湯(3 mL)中進行活化,37 ℃下培養48 h,將菌液(10 mL)離心(8 000 r/min,10 min,4 ℃)后棄上清液,加入50 μL甲苯和500 μL含10 mmol/L MgSO4溶液的Tris-HCl緩沖液,37 ℃靜置5 min后在-80 ℃冷凍2 h。重復完成凍融操作后9 000 r/min離心10 min,重懸溶液后再次加入400 μL Tris-HCl緩沖液[16]。

按照H+-ATP酶活性檢測試劑盒測定方法,將50 μL Na2ATP(0.1 mol/L)加入酶提取液中開始反應,37 ℃條件下,靜置20 min,加入600 μL HCl(0.1 mol/L)終止反應。將溶液置于冰浴中進行冷卻,離心(6 000 r/min,4 ℃,10 min)后收集上清液。加入2.0 mL著色劑30 min后測定OD660 nm,得到磷含量[17]。本實驗中蛋白定量測定采用Bradford蛋白檢測試劑盒進行檢測。H+-ATP酶活性以U/mg表示,即每個活性單位U定義為1 mg H+-ATP酶粗提物在1 min內將ATP分解成1 mol無機磷酸鹽[18-19]。

1.3.4 突變株的抗后酸化特性驗證

將篩選得到的具有抗后酸化潛力的突變株活化后接種于MRS肉湯(3 mL)中,37 ℃培養24 h。將1 mL菌液接種于相同條件下的MRS肉湯(300 mL)中,擴增培養48 h。取30 mL培養液,5 000 r/min離心10 min后棄上清液,重懸于30 mL磷酸緩沖溶液(PBS,pH 7.4)。菌體和PBS以1∶1的比例制備菌懸液,放入4 ℃環境下進行保存。

全脂牛奶(100 mL)在42 ℃下預熱,加入制備好的菌懸液(5×106CFU/mL)進行接種,攪拌均勻后42 ℃培養至完全凝乳。發酵完成后4 ℃進行貯藏。

測定發酵0、1、5、10、15、20 d的發酵乳pH值和酸度的變化[20]。pH的變化將直接使用精密pH計(±0.01)在室溫條件下進行測定。酸度則選擇國標法(GB 5009.239—2016)進行檢測：將10.0 g的發酵乳樣品與20.0 mL蒸餾水和2.0 mL的酚酞乙醇(0.5%)混合均勻,使用NaOH(0.100 mol/L)標準溶液進行滴定,指示反應終點為微紅并30 s內不褪色[21]。記錄整個反應過程中NaOH標準滴定液的消耗量(mL)。發酵乳的酸度計算如公式(3)所示:

(3)

式中：c,NaOH標準溶液濃度,mol/L；V1,滴定過程中消耗的NaOH標準溶液的體積,mL；V0,空白實驗所消耗NaOH標準溶液的體積,mL；m,發酵乳樣品的質量,g。常數0.1為酸度理論定義的NaOH摩爾濃度,單位為mol/L[22-23],即滴定酸度(°T)為發酵牛奶消耗的0.100 mol/L NaOH標準溶液的體積。

1.3.5 突變株遺傳穩定性

將突變株接種至MRS肉湯(5 mL)中,于37 ℃下培養18 h進行活化。將活化菌株在MRS肉湯中連續傳代9次,37 ℃下培養24 h。12 ℃下儲藏6 d,檢測pH值和酸度兩項指標的變化以確定突變株是否具有遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變處理時間的確定

根據ARTP誘變的操作原理,處理時間是達到劑量依賴性致死率的關鍵因素[24]。L.paracaseiB15致死率如圖1所示,當輻照時間達到45 s時,菌株的致死率為96%；當ARTP誘變時間延長至60 s以上后,細胞的致死率約為99%。

圖1 L.paracasei B15在ARTP不同處理時間下的致死率Fig.1 Lethality rate of L.paracasei B15 under different mutagenic time of atmospheric and room temperature plasma treatment(ARTP)

根據已有的研究,當ARTP誘變的致死率在90%左右時,陽性誘變率較之其他致死率對應的處理時間下明顯更高[25-26]。因此,選擇87%致死率對應的30 s作為ARTP誘變的最佳處理時間。

2.2 抗后酸化突變菌株的篩選

2.2.1 新霉素篩選突變菌株

基于新霉素對高H+-ATP酶活性菌株的抑制作用,本實驗將不同濃度的新霉素溶液加入MRS瓊脂平板作為選擇培養基。將可在平板上生長的菌株記錄為陽性菌株,通過設置不添加新霉素的空白對照組進行陽性篩選和概率計算。當新霉素質量濃度為300 mg/L時,陽性率最高可達62%(圖2)。以往的研究表明,聯合誘變處理的突變率和陽性突變率高于單處理誘變[27]。因此,在ARTP誘變的基礎上,向MRS瓊脂平板中添加300 mg/L新霉素可以認定是篩選H+-ATP酶活性較低的突變菌株的合適方法。

圖2 不同濃度新霉素下陽性突變株篩選率Fig.2 Effects of mutagenesis on positive survival rate in candidate strains with different concentration of neomycin

2.2.2 抗后酸化突變菌株生長特性和H+-ATP酶活性

通過ARTP誘變結合300 mg/L新霉素篩選,共獲得7株突變株,其對數生長期均出現在培養8 h后,晚于對照組2 h左右(圖3)。突變株BJT-5、BJT-6和BJT-7的生長速率明顯降低,穩定期的生物量是其他菌株的1/2左右。

圖3 B15及突變株的生長曲線Fig.3 Growth curves of B15 and mutants during culture period

突變菌株培養8 h后,培養基pH值出現快速下降(圖4),與圖3中菌株對數生長期的時間一致,即菌體的代謝旺盛時期,代謝產物產物的迅速積累造成pH值的快速下降。突變株BJT-7在培養10 h后,pH值趨于穩定,最低為4.74,pH值變化最小,有較強的抗后酸化能力。

圖4 B15及突變株在培養階段pH的變化Fig.4 pH of B15 and the mutants during culture period

如圖5所示,突變菌株的H+-ATP酶活性均低于對照組的原始菌株。突變菌株BJT-7的H+-ATP酶活性最低,為0.57 U/mg,對照組原始菌株的H+-ATP酶活性是BJT-7的3.09倍。由此推測,菌株生長能力可能與H+-ATP酶活性有關,突變株H+-ATP酶活性的降低,降低了菌株底物的磷酸化水平,導致ATP產量下降,生長速率降低,產酸能力降低,這與已有研究結果一致[28]。結果表明,ARTP聯合新霉素的篩選方法能夠有效篩選出H+-ATP酶活性較低的菌株。

圖5 突變株與B15的H+-ATP酶活性Fig.5 The H+-ATPase activity of the mutants and B15

2.3 突變菌株抗后酸化能力的驗證

在全脂牛乳中接種菌懸液進行發酵(37 ℃,48 h),待完全凝乳后測定4 ℃冷藏下發酵乳的pH值及酸度。圖6表明,各突變株處理組1 d內pH變化均不明顯,對照組稍有下降。

圖6 發酵乳pH變化曲線Fig.6 pH of fermented milk during storage

1～10 d,均為各處理pH值下降最快的時期,其中對照組變化幅度達到0.67,BJT-7變化幅度最小,為0.23。20 d時,對照組pH最低,為3.79,BJT-7的pH值最高,為4.27。

由圖7可知,對照組的酸度在儲存期間始終在上升,至20 d達到88 °T左右。突變株BJT-5和BJT-6在0～5 d期間酸度變化較小,5～10 d出現酸度增長的對數期,但后續酸度增加趨緩。突變株BJT-7在整個存儲過程中酸度變化幅度最小,20 d時酸度為73 °T。隨著各處理組pH值的下降,其酸度相應上升。

圖7 發酵乳酸度變化曲線Fig.7 The acidity curve of fermented milk during storage

通過ARTP結合新霉素篩選能夠得到儲藏期間無明顯酸度上升或延遲出現較大酸度變化的菌株,即能夠得到具有抗后酸化特性的菌株。

2.4 突變菌株遺傳穩定性

將突變株BJT-7在MRS培養基中連續傳代培養9代,在12 ℃條件下儲藏6 d,測定其pH和滴定酸度,結果表明菌株BJT-7具有較好的穩定遺傳性(表1)。

表1 BJT-7菌株遺傳穩定性Table 1 Genetic stability of BJT-7

3 結論

本文采用ARTP誘變處理結合新霉素篩選,獲得7株L.paracasei突變菌株,其中菌株BJT-7經全脂牛乳發酵在20 d儲藏期間幾乎無明顯酸度上升,且酸度低于70 °T,具有較好的遺傳穩定性,為獲得抗后酸化能力強的酸乳發酵菌株提供了新方法。