高耐受醋酸菌在不同條件發酵李子醋的有機酸和揮發性成分研究

周滟晴,季旭,盧家磊,汪立平,3*,曹玉陵,張晶晶

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(上海海洋大學 生態與環境學院,上海,201306) 3(食品熱加工工程技術研究中心(上海海洋大學),上海,201306)

李子(PrunussalicinaLindl.),別名山李子、嘉慶子、布林,能促進胃酸和胃消化酶的分泌,進而促進胃腸蠕動,有改善食欲,促進消化的作用;富含多種維生素和花青素,具抗炎、抗氧化和改善記憶力的功效,是抗衰老、防疾病的“超級水果”[1-2]。李子醋是李子的深加工產品之一,一方面保留了原果的天然成分,營養價值高,另一方面兼顧了果醋的獨特口感,富含多種有機酸、多酚和礦物元素[3]。

目前關于李子醋的研究集中在工藝優化[3-4],對其品質評價的研究鮮有報道。有機酸和揮發性成分均是評價果醋風味和品質的重要因素,單一研究果醋揮發性成分或有機酸的報道較多[5-7],吳震等[8]綜合研究了桑葚果渣固態發酵醋的有機酸和風味特征。AcetobacterpasteurianusAS1.41是我國工業釀造食醋的主要醋酸菌菌株之一。醋酸菌的嚴格中溫特性(30 ℃)對實際工業上的控溫系統要求高,乙醇濃度(醋酸發酵底物)也嚴重影響醋酸菌的生長。本實驗室前期篩選了果醋專用醋酸菌(Acetobactersp.LO2),在耐受環境下具有良好的產酸能力和生長特性,且發酵的果醋感官評價較好[9]。

本研究以李子為主要原料,在不同耐受條件下,以實驗室篩選的Acetobactersp.LO2發酵的李子醋為實驗組,A.pasteurianusAS1.41發酵的李子醋為對照組,通過HPLC測定李子醋的有機酸含量;SPME-GC-MS結合相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)分析李子醋的揮發性風味化合物,為LO2菌株的實際應用提供參考,并為李子的高值化利用和精深加工提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

李子(黑布林),陜西渭南；釀酒活性干酵母,廣西丹寶利酵母有限公司；AcetobacterpasteurianusAS1.41,中國工業微生物菌種保藏中心;Acetobactersp.LO2,實驗室保藏菌種;有機酸標準品,色譜純,上海源葉生物科技有限公司；其他試劑,分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F型潔凈工作臺,上海博迅實業有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；HWS-24型恒溫水浴鍋,上海恒科學儀器有限公司；7890B/5977A型GC-MS聯用儀,美國Agilent公司；AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；萃取頭(DVB/CAR/PDMS,60 μm),美國Supelco公司；L-2000高效液相色譜儀,日立高新技術公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

干酵母的活化：將活性干酵母按照投料質量的1%溶于50 g/L的白砂糖水溶液,水浴45 ℃保持1 h(液面氣泡翻滾即活化成功),活化后為酵母種子液。

醋酸菌的活化：醋酸菌種子液(李子汁版),取活化2次醋酸菌的單菌落接種至100 mL/250 mL李子汁(加入10 g/L的滅菌后的白砂糖),8層紗布封口,30 ℃,150 r/min振蕩培養2 d(觀察到渾濁)；醋酸菌種子液(李子酒版),將醋酸菌種子液(李子汁版)以8%的接種量接種到100 mL/250 mL李子酒中,8層紗布封口,30 ℃,150 r/min振蕩培養2 d(觀察到渾濁)。

1.3.2 李子醋的加工工藝流程及操作要點

李子→清洗→切塊去核→榨汁→殺菌→調節糖含量→酒精發酵→醋酸發酵→離心→裝瓶→殺菌

以李子汁的1.2%(體積分數)加入活化后的酵母液,接種后攪拌均勻,28 ℃ 靜置發酵9 d。將李子酒的酒精度調整至5%和8%(均為體積分數,下同),分別接種醋酸菌AS1.41和LO2的種子液,以下述4種條件進行靜置醋酸發酵8 d：適宜條件(N)(酒精度5%、溫度30 ℃)；高溫條件(HT)(酒精度5%、溫度37 ℃)；高乙醇條件(HE)(酒精度8%、溫度30 ℃)；高溫高乙醇條件(HTE)(酒精度8%、溫度37 ℃)。

1.3.3 有機酸含量的測定

參考文獻[5]和[10]的方法測定,并稍作修改。樣品制備：取10 mL樣品4 000 r/min 離心10 min。量取2 mL上清液定容于10 mL容量瓶,用0.22 μm水系濾膜過濾后置于樣品瓶中待測。6種有機酸(酒石酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和富馬酸)的含量用外標法測定。色譜條件：Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；淋洗條件：等度洗脫；流動相：V(0.1%磷酸)∶V(甲醇)=97.5∶2.5；流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.3.4 揮發性成分的測定

1.3.4.1 萃取條件

參考王丹等[6]的方法并修改。準確稱取1.5 g NaCl于20 mL頂空瓶中,量取5 mL樣品(李子汁、李子酒和李子醋)于頂空瓶中迅速旋緊瓶蓋。40 ℃水浴平衡15 min。將老化處理后的60 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶,推出纖維頭,調整插入深度后,40 ℃水浴吸附30 min。隨后,在GC進樣口解吸5 min。

1.3.4.2 GC-MS條件

參考王丹等[6]的方法并修改。色譜條件：載氣He；流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；HP-5MS彈性毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；不分流模式進樣。升溫程序：起始溫度40 ℃保持10 min,以3 ℃/min升至108 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至250 ℃保持5 min。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃,檢測器電壓1.2 kV,質量掃描范圍m/z30～350。

定性分析：總離子流色譜圖積分后對照美國國家標準技術研究所(NIST)14.L譜庫檢索化合物,本研究選擇正反匹配度均大于800的物質。

定量分析：采用峰面積歸一化法,根據色譜圖保留峰面積計算各香氣成分的相對含量。

1.3.4.3 特征風味分析

采用劉登勇等[11]的ROAV法來衡量揮發性成分對風味的貢獻。定義對樣品風味貢獻最大的組分ROAVstan=100,其他揮發性化合物的ROAVA按公式(1)計算：

(1)

式中：CA,各揮發性化合物的相對含量,%；TA,各揮發性化合物的氣味閾值,μg/kg；Cstan,對樣品風味貢獻最大組分的相對含量,%；Tstan,對樣品風味貢獻最大組分的氣味閾值,μg/kg。

1.3.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 李子醋的有機酸組成及含量比較

李子汁的有機酸含量為11.36 g/L,李子酒的有機酸含量為15.34 g/L。4種不同發酵條件下,2株醋酸菌發酵的李子醋樣品的有機酸的含量如表1所示。LO2菌株發酵的李子醋中,有機酸含量最高的是適宜條件(86.98 g/L),最低的是高乙醇條件(72.43 g/L)；AS1.41菌株有機酸含量最高的是適宜條件(83.89 g/L),最低的是高溫高乙醇條件(24.29 g/L)。結果表明,對LO2菌株,高乙醇條件增加產酸量,其余發酵條件均抑制了菌株的產乙酸能力；對AS1.41菌株,各種條件都對產酸有不利影響,其中高溫高乙醇條件尤甚。

表1 李子醋樣品中有機酸含量 單位：g/L

乙酸是醋酸菌代謝的重要產物,也是李子醋酸味口感的主要成分。李子汁的乙酸含量為0.3 g/L,李子酒中未檢測到乙酸,8種李子醋產品中的乙酸含量均高于其他有機酸,并占有機酸總含量的80%左右。方冠宇等[12]研究表明玫瑰醋的主要有機酸是乙酸和乳酸,但本研究中李子汁、李子酒和李子醋均未檢測到乳酸含量(均用外標法驗證),這與段雪榮等[13]對李子產品的有機酸測定結果一致。李子醋中占較高比例的蘋果酸主要來自李子汁(蘋果酸含量 8.74 g/L),酒石酸、檸檬酸、琥珀酸和富馬酸調和了李子醋的酸味,減少乙酸的刺激感,使李子醋口感協調和柔和。特別地,富馬酸賦予LO2菌株發酵的李子醋獨特的酸味,吳震等[8]研究表明富馬酸在不同菌株和發酵條件下差異較大,這可能與微生物在釀醋過程中的生長狀態和不同菌株自身屬性有關代謝情況有關。各種發酵條件下,LO2菌株發酵的李子醋的有機酸均高于AS1.41,且在各脅迫環境中有機酸產量穩定,具備良好耐溫和耐醇性。同時,發酵條件和菌株種類對李子醋的影響存在明顯差異,這與此前研究結果一致[9],為研究其揮發性成分差異提供基礎。

2.2 李子醋的揮發性成分相對含量

采用SPME-GC-MS測定了4種發酵條件下,2株醋酸菌發酵的8種李子醋樣品的揮發性成分。由表2可知,這8種李子醋的揮發性風味成分主要由發酵過程中產生的不同種類的化合物組成,主要是酯類(24種)、醇類(11種)和酸類(4種),醛類、酮類、酚類和烷烴等占很小比例,共計65種化合物。如圖1-a所示,高溫高乙醇條件下,LO2菌株發酵的李子醋檢出的揮發性成分種類最多,且明顯高于AS1.41菌株；在適宜條件和高乙醇條件下,2株菌發酵的李子醋的揮發性成分在種類上一致,但成分組成存在明顯差異；高溫條件下,LO2菌株發酵的李子醋的種類高于AS1.41組。如圖1-b所示,8種李子醋產品的揮發性成分中,酯類和醇類占比大,為其主體揮發性成分,適宜條件高溫條件和高溫乙醇條件下，LO2菌株發酵的李子醋的酯類和醇類化合物之和高于AS1.41菌株。

表2 八種李子醋中揮發性成分及相對含量(±s,n=3)Table 2 Volatile components and relative contents in 8 plum vinegar samples

續表2

圖1 發酵李子醋的揮發性成分種類(a)及相對含量(b)Fig.1 Types(a) and relative content(b) of volatile compounds in fermented plum vinegar

揮發性化合物的相對含量不能說明其對風味的貢獻程度,利用劉登勇等[11]的方法,參照關于香氣閾值的相關報道[14-16],進行ROAV的計算和分析,ROAV越大則對氣味貢獻越大。如表3所示,4種發酵條件,2株醋酸菌發酵的李子醋的ROAV均存在一定的差異。適宜條件下,5種酯類(醋酸異戊

酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯、水楊酸甲酯和醋酸甲酯)、3種醇類(苯乙醇、芳樟醇和活性戊醇)、壬醛、丁香酚和精萘是LO2和AS1.41菌株發酵的李子醋的共有特征揮發性物質(ROAV≥1);3種酯類(乙酸異丁酯、苯甲酸乙酯和戊酸乙酯),3種醇類(異香葉醇、異戊醇和ɑ-松油醇)、苯甲醛和2,4-二叔丁基苯酚是共有的對整體風味起修飾作用的化合物(0.1≤ROAV<1);特別地,甲酸甲酯是LO2菌株發酵的李子醋特有的特征揮發性物質,乙酸香葉酯和香葉基丙酮則是AS1.41菌株發酵的李子醋的特征揮發性物質和有修飾作用的物質。高溫條件下,與適宜條件相比,LO2菌株發酵的李子醋的特征揮發性物質增加了乙酸乙酯(ROAV≥1),AS1.41菌株的減少了2-甲基丁基乙酸酯和活性戊醇。與適宜條件相比,高乙醇條件下,LO2菌株的增加了1種特征揮發性物質(乙酸乙酯)和3種修飾作用風味成分(正己酸乙酯、乙酸香葉酯和異辛醇),AS1.41菌株增加了6種特征揮發性物質(苯甲酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯和異戊醇),兩株菌均減少了戊酸乙酯和未檢到精萘。高溫高乙醇條件下,與適宜條件相比,LO2菌株增加了正己酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸香葉酯,AS1.41菌株增加了正己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯。LO2菌株發酵的李子醋的特征揮發性物質(ROAV≥1)之和高于AS1.41菌株,LO2菌株發酵的李子醋風味更豐富,與此前研究報道的感官評價結果一致[9]。

表3 八種李子醋的特征揮發性物質的ROAV及氣味描述Table 3 ROAV and odor description of volatile compounds in 8 plum vinegar samples

續表3

大多數酯類化合物是由酸、醇在發酵和陳釀過程中酯化而成[17]。酯類是李子醋中主要的風味化合物,一般為香甜的水果香,且閾值較低。如表3所示,李子醋一共檢出14種重要酯類揮發性化合物,其種類豐富、含量高和占比大,為其提供了獨特豐富的果香。趙峰等[18]、王丹等[6]的研究均表明酯類化合物的種類和含量最高,這與本研究結果一致。醋酸異戊酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯水楊酸甲酯和醋酸甲酯是8種李子醋中共有的特征性揮發風味成分。醋酸異戊酯和乙酸乙酯是對李子醋整體香氣貢獻最大的化合物,醋酸異戊酯是一種乙酸和異戊醇酯化反應得到的化合物,有香蕉氣味；而ZOHRE等[19]的研究表明,乙酸乙酯含量過高會有不愉快的香氣,本研究李子醋的乙酸乙酯含量高,可能會對香氣產生不良影響。2-甲基丁基乙酸酯是常見的蘋果香氣成分,有獨特的青蘋果味道,除AS1.41菌株在高溫條件下發酵的李子醋未檢出外,其余李子醋樣品中含量相當。乙酸香葉酯、辛酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯是AS1.41菌株發酵的李子醋產品中特有的揮發性風味成分。8種李子醋中的酯類化合物的相對含量依次為31.08%、28.62%、31.56%、21.40%、53.47%、21.59%、53.12%、17.21%(圖1-b),LO2菌株發酵的李子醋平均含量均高于AS1.41菌株。

醇類化合物一般具有植物香氣,是李子醋中主要的風味化合物之一,不飽和醇閾值偏低,并隨著碳鏈的延長,香氣也會隨之增加,少量的高級醇(3個碳原子以上的一元醇的總稱)還能作為其他香氣物質的良好溶劑。李子醋的醇類化合物主要是酵母菌等利用糖代謝產生,其中,ROAV較大的苯乙醇是釀酒酵母利用葡萄糖通過莽草酸途徑生成[20],貢獻木香和風信子花香。李子醋的另一重要特征醇類風味成分是芳樟醇,賦予獨特的青木香和花香,熊濤等[21]研究表明芳樟醇是發酵后胡蘿卜汁的特征揮發性成分,這與本研究結果一致。如表3所示,李子醋中共檢出8種醇類化合物,除苯乙醇和芳樟醇外,還有一些含量較低但對整體風味有貢獻的醇類,例如異香葉醇、苯乙醇、α-松油醇和香茅醇,均為提供豐富多層次的花果香,豐富了酯類風味物質的種類,使香味更協調。對LO2菌株發酵的李子醋,發酵條件的改變對其醇類化合物影響不大,發酵條件的溫度升高會降低AS1.41菌株發酵的李子醋的活性戊醇(提供苦味)含量,高乙醇條件發酵會降低AS1.41菌株發酵的李子醋的異香葉醇(提供玫瑰花香)的含量。8種李子醋的醇類化合物的相對含量依次為37.28%、35.84%、39.75%、35.74%、25.26%、63.77%、32.24%和66.68%,在前2種發酵條件下,LO2菌株發酵的李子醋的醇類相對含量均高于AS1.41,高乙醇和高溫高乙醇條件下,AS1.41菌株發酵的李子醋的醇類異常高的原因是AS1.41菌株對該環境不耐受,未進行完全的醋酸發酵,其醇類物質主要來源于李子酒。

除醇類和酯類等主要的揮發性風味成分,李子醋還有一些其他種類的揮發性香氣成分,如醛類、酸類、酮類、酚類等。醛類化合物因其較低的閾值而對風味具有較大的貢獻,低、中和高碳位數的醛類分別具有刺激性氣味、油脂味和柑橘皮的香味[22]。李子醋中的特征揮發性風味物質中的醛類化合物主要是壬醛(ROAV≥1)。孫寶國[15]研究表明水果中的壬醛等中碳鏈長度的醛類化合物對主體香氣有重要輔助作用。長鏈的酸類化合物閾值較高,ROAV偏低,對李子醋的風味貢獻不大。雖然李子醋的有機酸含量較高,但酸類化合物卻不是李子醋的特征風味化合物,這是因為隨著發酵時間的延長,酸類化合物和醇類化合物生成了對應的酯類化合物,使特征性揮發成分中酯類化合物占比高,酸類化合物占比低。不飽和脂肪酸或微生物氧化以及氨基酸降解,形成具有持久花果香氣的酮類化合物[22-23]。發酵過程中的丁香酚的含量變化會引起李子醋的其他酚類化合物的變化,丁香酚為李子醋提供一種獨特的辛香味,其具有良好的抑菌防腐作用[24]。

2.4 李子醋的揮發性成分相對含量

選擇表3中對樣品風味有重要影響的揮發性物質(ROAV≥0.1)進行主成分分析(principal component analysis,PCA),建立李子醋樣本和化合物之間的相關性關系。不同發酵條件下的李子醋數據分散,提取的3個主成分PC1解釋所有變量方差的40.3%,是方差貢獻率最大的主成分；PC2和PC3分別解釋所有變量方差的28.3%和14.3%,3個主成分累計解釋所有變量的82.5%(表4)。

表4 主成分特征值及方差貢獻率Table 4 Eigenvalues of PCA and variance contribution rate

由圖2可知,8種李子醋樣品沒有明顯聚類,說明其主要揮發性成分存在差異。根據PCA原理,樣品在得分圖上距離越近,其揮發性成分的組成和含量相似度越高,載荷圖中化合物與原點的距離與主成分之間有相關性[25]。

圖2 八種李子醋的3D PCA評分圖Fig.2 PCA score plot in 3D of 8 plum vinegar samples

為了更好表示每個變量的相對重要性以及每個變量與主成分之間的相關性,分別在PC1～PC2和PC1～PC3平面繪制得分圖和載荷圖(圖3)。由圖3-a可知,李子醋樣品分散在PC1～PC2平面的4個象限,揮發性成分和含量具有差異性,但AS1.41在適宜(NA)和高溫條件(HTA),LO2菌株在適宜(NL)和高溫條件(HTL),LO2菌株在高醇(HEL)和高溫高乙醇(HTEL)發酵的李子醋分別在象限內聚集,在同一象限內聚集的樣品的揮發性成分相似。LO2在高醇條件發酵的李子醋(HEL)的特點是甲酸甲酯(A1)含量最高；LO2在高溫條件發酵的李子醋(HTL)的特點是苯乙醇(B2)和丁香酚(E3)得分最高。AS1.41在適宜條件發酵的李子醋(NA)在PC1上得分最高,NA的特點是戊酸乙酯(A9)、精萘(E5)和冰醋酸(D1)的含量最高；AS1.41在高溫條件發酵的李子醋(HTA)的特點是L-石竹烯(E1)、香葉基丙酮(E2)和壬醛(C2)的含量最高；AS1.41在高醇條件(HEA)以辛酸乙酯(A13)和9-十六碳烯酸乙酯(A14)含量最高為特點。

a-PC1-PC2;b-PC1-PC3圖3 李子醋揮發性物質的主成分雙圖Fig.3 PCA biplots of volatile compounds in plum vinegar

依據每種醋的化合物特點,有助于將其與其他樣品分開,并賦予其特定氣味細微差別,如HTA的壬醛含量高,賦予其高于其他樣品的獨特的油脂味,如以精萘為特點的NA樣品的強烈的樟腦丸味道。高溫和適宜條件發酵的李子醋在PC1的正向,顯示出揮發性成分相似性。由圖3-b可知,HTEL和HEA在PC1～PC3平面的第2象限,酯類、醇類化合物聚集分布,說明酯醇類化合物成分的相關性,HTEL和HEA的酯、醇類化合物含量高于其他醋樣。NA在PC1得分最高,對應在得分值較高的均為酯類,表明其酯類成分含量高?？傮w來講,PCA能有效區分這8種不同李子醋,為李子醋評價提供基礎。

3 結論

本研究通過HPLC發現,不同的發酵條件和菌株發酵的李子醋的有機酸組成和含量有差異,但LO2菌株在各發酵條件下發酵的李子醋有機酸含量相近,富馬酸是LO2菌株發酵的李子醋特色有機酸。通過SPME-GC-MS發現,李子醋鑒定出酯類、醇類、酸類、醛類、酮類和酚類等8個類別共65種揮發性成分,適宜條件和高溫條件揮發性成分和含量相似,其余2種條件的揮發性成分和含量相似。LO2菌株和AS1.41菌株在適宜條件的的揮發性化合物種類含量一致,高溫條件會降低種類,高乙醇條件會豐富種類,高溫高乙醇條件僅豐富了LO2菌株的揮發性種類。基于閾值計算的ROAV表明,LO2菌株發酵的李子醋的特征揮發性風味成分的ROAV大于AS1.41,特別地,高溫高乙醇條件下,AS1.41大于LO2,原因是AS1.41菌株在此條件未進行完全醋酸發酵,保留了李子酒的大部分醇類揮發性物質。PCA結果表明,不同的發酵條件和菌株發酵李子醋的揮發性成分的種類和含量差異較大,可以建立李子醋的發酵條件與揮發性成分的關系。本研究明確了LO2菌株在脅迫環境下發酵李子醋的優勢,為LO2菌株在工業上非嚴格控制發酵條件下發酵李子醋提供參考,為工藝調整、質量控制、節約能源和進一步提升產品品質提供理論基礎和依據。