水媒法燕麥分離蛋白的制備

王妙玲,張彩猛,李興飛,華欲飛

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫 214122)

燕麥是禾本科燕麥屬一年生草本植物,依種子帶殼與否分為皮燕麥和裸燕麥兩大類型。我國以種植裸燕麥為主。其富含β-葡聚糖、不飽和脂肪酸、酚酸、維生素等功能性成分[1],具有預防心血管疾病、降低膽固醇和平穩血糖等功效,因此受到人們的關注[2-3]。

燕麥中的蛋白質含量較高,在11.35%～19.9%,在谷物中居于首位[4]；燕麥中的蛋白質按其溶解性的不同,可分成4種蛋白質,分別為清蛋白(10%～20%)、球蛋白(12%～55%)、谷蛋白(23%～54%)和醇溶蛋白(12%～14%)[5]；燕麥蛋白的氨基酸構成比較平衡,各種必需氨基酸的含量接近聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/世界衛生組織(World Health Organization，WHO)推薦值[6-7],蛋白質功效比超過2.0,生物價為72～75[8]。與大多數其他谷物不同,燕麥蛋白質的麩質(gluten)成分較少,因此其可以供乳糜瀉患者安全食用[9]。

在以往制備燕麥蛋白的工藝研究中[10-12],國內外研究者們為提高燕麥蛋白的含量,會引入有機溶劑進行脫脂或使用酶制劑,這些方法顯然不符合綠色生產的標準,會使燕麥蛋白的使用范圍大大受限,不能應用到食品工業中去。

本研究的主要目的是在不使用溶劑浸出,而且蛋白質不被酶解的情況下制備蛋白質含量大于90%的燕麥蛋白產品,提高蛋白質含量的過程實際上就是去除燕麥中其他成分的過程。相對來說,燕麥中的碳水化合物類成分,包括淀粉、纖維、β-葡聚糖等[13-14],較容易與蛋白質實現分離,而脂質成分與蛋白質之間有較強作用力,不容易分離[15]。作者經過大量研究,提出了燕麥打漿、冷凍、分級沉淀的工藝路線,可以同時制備燕麥分離蛋白(oat protein isolate,OPI)和燕麥濃縮蛋白(oat protein concentrate,OPC)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

裸燕麥,沈陽信昌糧食貿易有限公司；氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、硫酸銅、葡萄糖、無水硫酸鈉、石油醚、三氯甲烷、甲醇、無水乙醇、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、亞甲藍、甲基紅等,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

HimacCR21G Ⅱ型冷凍離心機,日本Hitachi公司；BLST4090B-073打漿機,東莞匯勛電器制品有限公司；K9840半自動凱氏定氮儀,濟南海能儀器股份有限公司；UV2450型紫外分光光度計,日本島津公司；PHS-3C數顯pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市醫療儀器廠；90型磁力攪拌器,上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 OPI與OPC制備的工藝路線

取一定質量的裸燕麥,按料水比1∶12(g∶mL)加入去離子水,25 ℃浸泡12 h,浸泡結束后8 000 r/min打漿2 min。打漿后的漿液即為燕麥糊,使用2 mol/L NaOH溶液調節燕麥糊pH 至8.5,攪拌提取1.0 h,放入-18 ℃冰箱冷凍10 h,常溫水浴自然解凍,燕麥糊3 000×g離心15 min,棄去下層沉淀,收集上清液,上清液于50 ℃水浴加熱30 min,加入1 mol/L HCl溶液調節上清液pH至7.2,6 000×g離心15 min,下層沉淀即為OPI,上清液用1 mol/L HCl溶液調節 pH 至5.2,3 000×g離心15 min得到OPC。

1.2.1.1 提取pH對OPI蛋白質含量的影響

取100 g裸燕麥,浸泡12 h后,按料水比1∶12(g∶mL)打漿2 min(8 000 r/min)。取8份等質量的燕麥糊,使用2 mol/L NaOH溶液調節pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,提取溫度25 ℃、提取時長1.0 h,3 000×g離心15 min,得到上清液,使用1 mol/L HCl溶液將上清液調節pH至7.2,6 000×g離心15 min,得到OPI,測其蛋白質含量。

1.2.1.2 離心分級pH對OPI蛋白質含量的影響

取100 g裸燕麥,浸泡12 h后,按料水比1∶12(g∶mL)打漿2 min(8 000 r/min)。使用2 mol/L NaOH溶液調節燕麥糊pH為8.5,3 000×g離心15 min,得到上清液,將上清液分成等質量的11份,使用1 mol/L HCl溶液將11份上清液分別調節pH為4.5、5.2、5.7、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8,6 000×g離心15 min,溫度25 ℃、提取時長0.5 h,6 000×g離心15 min,下層沉淀即為OPI,測其蛋白質含量。

1.2.1.3 冷凍時長對OPI蛋白質含量的影響

取一定質量的裸燕麥,按照1.2.1.1相同條件浸泡打漿,調節pH 8.5,攪拌提取后,將燕麥糊分為等質量的8份,放在-18 ℃冰箱中,分別冷凍0、3、5、7、9、10、13、21 h,在常溫水浴自然解凍,3 000×g離心10 min,得到上清液,上清液50 ℃水浴加熱30 min后,加入1 mol/L HCl溶液調節上清液 pH 至7.2,6 000×g離心15 min,下層沉淀即為OPI,測其蛋白質含量。

1.2.2 基本成分測定方法

蛋白質含量參照GB 5009.5 —2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法進行測定,燕麥蛋白質折算系數為5.83；脂肪含量參照氯仿甲醇法進行測定[16]；淀粉含量參照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》進行測定；灰分含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》進行測定；水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法進行測定。

蛋白質和脂肪提取率的計算如公式(1)所示：

蛋白質(脂肪)提取率/%=

(1)

1.2.3 氨基酸的測定

稱取0.1 g蛋白樣品于水解管中,加入8 mL 6 mol/L HCl溶液,充分混合均勻后向水解管中氮吹3 min,置于120 ℃烘箱內水解20 h。在室溫下自然冷卻后,轉移至試管中,用4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和,定容至25 mL,混勻后用雙層濾紙過濾。濾液7 000×g離心10 min,取上清液進行分析。采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜紫外檢測法進行氨基酸測定,用外標法定量,計算氨基酸評分(amino acid score,AAS)。

1.2.4 數據處理

實驗均重復3次,采用Origin對數據進行分析和繪圖,結果用“平均值 ± 標準偏差”表示,使用SPSS 軟件對數據進行顯著性分析(P<0.05表示具有顯著性差異)。

2 結果與分析

2.1 OPI的制備

2.1.1 燕麥原料的基本成分

小麥、玉米、大麥等糧食類谷物中的蛋白質含量均在10%以下,由表1可知,裸燕麥中蛋白質含量為12.5%,相比之下,燕麥中的蛋白質含量在谷物中較高,因此從燕麥中提取蛋白質意義重大。

表1 燕麥原料的基本成分 單位：%

2.1.2 提取pH對OPI蛋白質含量的影響

將打漿后的燕麥糊調節至不同的pH提取蛋白質,結果表明在未加堿pH 6.5的條件下,蛋白質的提取率和含量均為最低,提高pH可明顯提高蛋白質的提取率和含量,因此燕麥中的蛋白質在堿性條件下更易于溶出,在pH 8.5時,蛋白質含量達到最大,為78.58%,而且提取率也達到36.15%,雖然蛋白質的提取率隨著pH的繼續升高仍會增大,但是增幅較小,而且過堿的條件會使燕麥漿液具有刺鼻的堿味。以蛋白質含量為主要考察指標,選取最佳提取pH為8.5。

圖1 提取pH對OPI蛋白質含量的影響Fig.1 The effect of extraction pH on OPI protein content

2.1.3 分級離心pH對OPI蛋白質含量的影響

將上清液的pH分別調節至4.5～7.8,進行離心沉淀,發現OPI的蛋白質含量呈現出先升高后降低的趨勢,在pH 7.2時達到最大,為77.65%,遠遠高于在等電點pH 5.2時的蛋白質含量65.14%,表明燕麥中存在一部分蛋白質在中性條件下先進行沉淀,而且這一部分蛋白質結合雜質的量較少,所以燕麥蛋白的含量較高。因此,在進行等電點沉淀之前,可以在中性條件下先進行一次分級沉淀,得到蛋白質含量較高的OPI,剩余的上清液再進行等電點沉淀,回收剩余蛋白質,得到燕麥含量較低但提取率較高的OPC。

圖2 分級離心pH對OPI蛋白質含量的影響Fig.2 The effect of pH in fractional centrifugation on OPI protein content

2.1.4 燕麥糊冷凍處理

圖3為燕麥蛋白提取工藝流程圖,本實驗對蛋白質和脂質在各組分中的分配情況進行了測定,數據見表2。由表2數據可知,燕麥糊是否進行冷凍處理對OPI中蛋白質和脂質含量影響很大,未冷凍處理得到的OPI中脂質含量為15.53%,冷凍以后,OPI中蛋白質含量升高,脂質含量降低至6.92%,提取率降低至7.35%。未冷凍處理的a 上清液1和冷凍處理的b 上清液1中蛋白質和脂質的提取率幾乎沒有差異,將pH調至中性沉淀后,未冷凍和冷凍處理的上清液2和沉淀2(OPI)的蛋白質和脂質的分配情況出現了差異,a OPI中的脂質提取率為12.86%,而冷凍以后,b OPI中脂質提取率僅為7.35%,與此同時,a 上清液2中的脂質提取率為72.3%,冷凍以后,提取到b 上清液2中的脂質增加至77.68%。因此,原本傾向于沉降到OPI中的脂質經過冷凍處理后會轉移至上清液2中,所以沉淀b OPI中的蛋白質含量得到提高。

a-未冷凍處理;b-冷凍處理圖3 從燕麥糊中提取OPI的流程圖Fig.3 Flow chart of extracting OPI from oat

表2 冷凍處理對各組分中蛋白質與脂質的影響 單位：%

孫旦[17]和朱敏敏等[18]均研究了冷凍對乳狀液破乳的影響,并認為冷凍會形成冰晶刺穿包裹油滴的蛋白質界面膜,使油滴能夠釋放并聚集。因此,未冷凍前,燕麥蛋白質與脂質之間具有相互作用,形成的蛋白質-脂質結合物在中性條件下會沉降,經過冷凍處理后,冷凍條件下形成的冰晶使蛋白質與脂質間的相互作用被削弱,油滴被釋放聚集,進入到清液中,所以沉降至OPI中的脂質含量降低,蛋白質含量升高。

2.1.5 冷凍時長對OPI蛋白質含量的影響

燕麥糊的冷凍時長與OPI中蛋白質含量的變化有密切聯系,蛋白質含量隨冷凍時長的延長先升高后降低,在冷凍10 h時,OPI的含量達到最大為92.31%,遠超于未冷凍時的蛋白質含量77.65%,而蛋白質的提取率沒有隨著冷凍時長的改變而發生明顯的變化。林暢[19]和程雪等[20]的研究發現在冷凍過程中,連續相產生的冰晶會刺穿界面膜進入油滴內部,解凍后引發油滴聚合；若冷凍時間過長,油相結晶增加緩慢,結晶達到最大程度,脂肪晶體刺穿界面膜的概率不再增加。因此綜合來看,冷凍時長選為10 h時OPI的蛋白質含量和提取率均為最高。

圖4 冷凍時長對OPI蛋白質含量的影響Fig.4 The effect of freezing time on OPI protein content

2.2 OPI與OPC的氨基酸分析

OPC與OPI的氨基酸含量見表3,可以看出OPI和OPC中谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量較高；氨基酸評分AAS值見表4,OPC的AAS值在70～162,OPI的AAS值在42～166,說明燕麥蛋白氨基酸配比比較平衡,為優質的蛋白質資源。OPC中第一限制性氨基酸為賴氨酸,其AAS值為70；此結果與KLOSE等[21]的研究結果一致。而OPI中的限制性氨基酸為蛋氨酸、胱氨酸和賴氨酸。

表3 OPC與OPI的氨基酸組成 單位：g/100 g蛋白質

續表3

表4 OPC與OPI的氨基酸評分Table 4 OPC and OPI amino acid score

3 結論與討論

本研究采用不引入有機溶劑的綠色加工工藝,以裸燕麥為原料,探究了提取pH、分級沉淀pH、冷凍處理等條件的影響,結果表明當提取pH為8.5,回調pH為7.2,冷凍10 h時,可以制備出蛋白質含量為92.61%、提取率為42.46%的OPI,接著對上清液在等電點pH 5.2下進行沉淀,可得到燕麥蛋白含量為65.14%,提取率為44.75%的OPC,此工藝流程可以提取出燕麥原料中大于80%的蛋白質,實現了燕麥中蛋白質資源的最大利用,而且全過程不引入任何有機溶劑與酶制劑,工藝符合綠色生產標準,此外OPI和OPC的氨基酸配比均十分均衡,是一種優質的植物蛋白資源,可應用于食品工業。