卵形鯧鲹黃嘌呤氧化酶抑制肽的制備及其工藝優化

侯夢凡,胡曉,楊賢慶*,陳勝軍,吳燕燕,許加超

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266003) 2(中國水產科學研究院 南海水產研究所,農業農村部水產品加工重點實驗室,廣東 廣州,510300)

高尿酸血癥是由于體內嘌呤代謝紊亂而導致的一種代謝性疾病。當體內肝臟產生尿酸的量超出腎臟的排泄能力時,就會導致血清尿酸水平升高,從而引起高尿酸血癥[1]。當血清尿酸水平過飽和時,尿酸鹽容易在關節、軟骨和腎臟等組織中沉積,形成尿酸鹽結晶,最終導致痛風的產生[2]。此外,高尿酸血癥也與高脂血、高血壓、二型糖尿病和心血管疾病等疾病的發生有著密切的關系[3]。據不完全統計,我國高尿酸血癥的患病率約為13%,其中男性為18.5%,明顯高于女性,且沿海和經濟發達地區高尿酸血癥患病率高達20%以上,已達到或接近歐美發達國家水平[4]。目前臨床上主要使用別嘌呤醇、非布斯坦等藥物進行有效的治療,然而這些藥物會產生嚴重的副作用,如頭痛發熱、過敏反應、高血壓、慢性腎炎、心血管疾病、關節及肌肉骨骼功能障礙等,且治療費用較高[5]。因此開發出具有較少的不良反應和更加經濟的新型降尿酸藥物是目前亟待解決的問題。目前,多酚、黃酮、皂苷類等天然提取物,蛋白酶解物及多肽,益生菌等已被證明具有降尿酸活性[6]。與其他生物活性物質相比,多肽往往表現出較高的活性、穩定性和特異性,且容易吸收,可以進行批量生產且成本較低[7]。食源性生物活性肽來源廣泛且安全性高,從食物蛋白源中開發降尿酸活性肽,在預防與治療高尿酸血癥及痛風方面具有較高的研究價值和廣闊的應用前景[8]。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是嘌呤代謝中的關鍵酶,催化黃嘌呤或次黃嘌呤氧化生成尿酸[9],因此,XOD活性過高會加快尿酸的生成,造成高尿酸血癥。此外,在XOD的再氧化過程中,還會產生內源性活性氧,包括超氧自由基和過氧化氫,會對組織造成氧化損傷[10],對機體造成進一步的損害。因此,抑制XOD活性可以阻止生物體從嘌呤到尿酸的生物合成,從而有效降低血清尿酸含量以及血管氧化應激反應[11]。

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)又稱金鯧魚,為暖水性中上層洄游魚類,廣泛分布于我國南海、日本沿海、地中海、印度洋等熱帶亞熱帶海域,在我國廣東、海南已進行大規模的人工養殖[12]。2016年,我國卵形鯧鲹年養殖產量達12萬t以上[13]。卵形鯧鲹富含蛋白質、脂肪、脂肪酸、氨基酸等多種營養成分,且必需氨基酸及不飽和脂肪酸比例較高[14],具極佳的保健及綜合利用開發價值。目前,鰹魚[15]、秋刀魚[16]、鯊魚軟骨[17]、海參[18]等海產品中已經提取出具有XOD抑制活性的多肽,本文對卵形鯧鲹XOD抑制肽的制備進行了研究,并對其肽分子質量分布及氨基酸組成進行了分析,以期為卵形鯧鲹降尿酸活性產品的研發提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵形鯧鲹(選擇體長為20 cm左右,質量為500 g左右,產地為湛江的個體),廣州華潤萬家超市,取魚肉,洗凈后放入絞肉機中絞成肉糜,置于聚乙烯袋中于-20 ℃凍藏備用。

中性蛋白酶(≥100 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥1 500 U/mg)、復合蛋白酶(≥90 U/mg)、堿性蛋白酶(≥200 U/mg)、胰酶(≥4 000 U/g),合肥博美生物科技有限公司；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶,美國Sigma公司；三氟乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇，美國BCR；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀，廣州化學試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，上海源葉生物科技有限公司；甲醛，廣東廣試試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GB204電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司；3K30臺式高速冷凍離心機,德國Sigma公司；KjeltecTM 2300蛋白自動分析儀,丹麥福斯分析儀器公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器,金壇市精達儀器制造廠；809 Titrando自動電位滴定儀,瑞士萬通公司；Sunrise-basic Tacan SUNRISE吸光酶標儀,瑞士TECAN公司；Alpha1-4真空冷凍干燥機,德國Christ公司；N-EVAP24氮吹儀,美國ORGANOMATION公司；Agilent 1100液相色譜儀,美國安捷倫科技公司；LC-20AD高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵形鯧鲹XOD抑制肽的制備

取一定質量的卵形鯧鲹魚糜于錐形瓶中,按1∶3(g∶mL)的料液比加入去離子水,混合均勻后調節至所需pH,加入一定比例的酶(以魚糜質量計),在不同實驗條件下酶解。酶解結束后,沸水浴滅酶15 min,冷卻,于4 ℃、6 793 r/min條件下離心20 min,收集上清液,冷凍干燥后得到卵形鯧鲹XOD抑制肽,于-20 ℃保存備用。

1.3.2 蛋白酶的篩選

取10 g魚糜加入30 mL去離子水,選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、胰酶在各自最適pH和溫度下酶解6 h,加酶量為0.3%。以水解度和XOD抑制活性為指標篩選出最佳蛋白酶。不同酶的最佳酶解溫度和pH如表1所示。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different proteases

1.3.3 單因素試驗

按1.3.1方法進行酶解、制備,以水解度(degree of hydrolysis,DH)和XOD抑制活性為指標,分別考察中性蛋白酶的酶解時間(1、2、4、6、8 h)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、加酶量(質量分數0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)以及料液比(g∶mL)(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)5個因素對2個指標的影響。

1.3.4 響應面法優化實驗

根據單因素試驗結果,選取酶解時間(A)、加酶量(B)以及酶解溫度(C)為響應因素,以水解度和XOD抑制活性為響應值,根據Box-Behnken原理設計3因素3水平實驗,優化XOD抑制肽的最佳制備工藝。實驗因素及水平設計見表2。

表2 響應面實驗因素和水平Table 2 Factors and levels in response surface design

1.3.5 水解度測定

采用甲醛電位滴定法測定酶解后上清液中氨基酸態氮質量,采用凱氏定氮法(參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》)測定原料中總氮質量,水解度按公式(1)計算。

(1)

1.3.6 XOD抑制活性測定

于96孔酶標板中依次加入50 μL待測樣品溶液(20 g/L),50 μL黃嘌呤氧化酶溶液(0.05 U/mL),混勻,37 ℃孵育30 min,加入150 μL黃嘌呤溶液(0.40 mmol/L)啟動反應,記錄6 min內反應體系在290 nm處吸光值的動力學變化,以pH 7.4磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)做空白對照。XOD抑制活性按公式(2)計算。

(2)

式中：dA，吸光度；dt，時間；(dA/dt)空白，未加抑制劑的反應速率；(dA/dt)樣品，加抑制劑的反應速率。

1.3.7 肽分子質量分布測定

將凍干粉稀釋至2 g/L,采用高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)測定肽分子質量分布。檢測條件：色譜柱為TSK-GELG2000SWXL(7.8 mm×300 mm)；流動相A是含體積分數0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,流動相B是超純水配制的體積分數為0.1%三氟乙酸溶液,洗脫比例為V(A)∶V(B)=20∶80；進樣體積10 μL；流速0.5 mL/min；檢測波長214 nm。將標準品細胞色素C(12 400 Da)、桿菌肽(6 511.83 Da)、抑肽酶(1 422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)、還原型谷胱甘肽(307.3 Da)用流動相配制成質量濃度為2 g/L的混合液,過0.22 μm微孔濾膜后按上述方法進行分析,根據標準品出峰時間分析樣品的分子質量分布。

1.3.8 氨基酸組成測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》酸水解法測定17種基本氨基酸；參考GB/T 18246—2019《飼料中氨基酸的測定》堿水解法測定色氨酸。

1.4 數據分析

采用Origin 2019軟件繪圖,實驗數據利用Excel 2019和SPSS Statistics 22.0進行統計分析,以單因素ANOVA法及Duncan多重比較分析組間差異性,P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶篩選結果

用5種不同蛋白酶酶解得到的XOD抑制肽其水解度和XOD抑制活性如表3所示。由于酶的專一性,不同蛋白酶具有不同的酶切位點和酶解產物,因此酶解效果和產物活性具有明顯差異[19]。從水解度來看,復合蛋白酶的水解程度最好,胰蛋白酶次之,其余3種酶的水解程度相對較低,這可能與卵形鯧鲹蛋白中氨基酸組成及排列方式有關。然而這2種酶解產物的XOD抑制活性低,中性蛋白酶酶解產物雖水解度較低,但具有最高的抑制率,達到61.94%,顯著高于其他酶解產物。因此,綜合考慮選取中性蛋白酶為本研究最佳用酶進行一下步實驗優化。

表3 不同蛋白酶對水解度和XOD抑制活性的影響Table 3 Effect of different proteases on degree of hydrolysis and XOD inhibition activity

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解時間對水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-a所示,水解度隨酶解時間的延長而增加,4 h后增加趨勢有所減緩。這主要是隨著反應的進行,酶的作用位點逐漸減少,底物濃度降低,因而水解度的增幅程度有所減緩[20]。由于中性蛋白酶作用于底物的水解程度較低,在酶解的8 h內并未到達反應終點。各時間段的XOD抑制活性差異不大,4 h酶解產物的XOD抑制活性最高,達到62.02%,顯著高于2 h(P<0.05),但與6 h的XOD抑制活性無顯著差異。綜合時間及經濟成本考慮,選擇4 h為最佳酶解時間。

2.2.2 酶解溫度對水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-b所示,隨著酶解溫度的升高,水解度呈現先上升后下降的趨勢,在其最適溫度50 ℃時達到最大。水解度反映著酶催化生成肽鏈的能力,當酶解溫度超過酶促反應最適溫度時,酶本身蛋白質結構的分子熱能增加,多重弱非共價鍵相互作用破裂的機會增加,導致酶變性,從而使酶活性降低[21]。50 ℃時酶解產物的水解程度達到最高,而XOD抑制活性卻低于55 ℃,這可能是由于較高的水解程度破壞某些氨基酸殘基,因而降低了其活性。因此選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

2.2.3 酶解pH對水解度和XOD抑制活性的影響

中性蛋白酶的最適pH介于6.0～7.5,如圖1-c所示,當pH為6.5～7.5時,pH 7.0組與pH 6.5組、pH 7.0組和 pH 7.5組的XOD抑制活性都沒有顯著性差異。因此在pH 6.5～7.5對酶解效果影響不大,考慮到工業生產的實際應用,確定酶解的最佳pH為7.0。

2.2.4 加酶量對水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-d所示,隨著加酶量的增加,底物與酶的接觸幾率增大,水解程度和酶解產物也隨之增加。當加酶量為0.2%時XOD抑制活性最高,與其他組分具有顯著性差異(P<0.05),因此選擇0.2%為最佳加酶量。

2.2.5 料液比對水解度和XOD抑制活性的影響

如圖1-e所示,隨著料液比的增加,水解程度逐漸增加,當料液比為1∶3(g∶mL)時逐漸趨于平緩。底物濃度高可增加酶與底物的接觸面積,從而促進反應的進行,然而當底物濃度過高時,反應體系過于黏稠,影響了蛋白酶的分散性和活性物質的釋放,因而減弱了酶解效果[22]。當料液比達到1∶2(g∶mL)后,各組間的XOD抑制活性沒有顯著差異,說明料液比對其影響不大,綜合考慮選擇最佳料液比為1∶3(g∶mL)。

圖1 時間、溫度、pH、加酶量、料液比對水解度和XOD抑制活性的影響Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis time,temperature,pH,enzyme dosage,and liquid-material ratio on the degree of hydrolysis and XOD inhibition activity注：圖中的不同字母表示在P<0.05范圍內存在顯著性差異

2.3 響應面試驗分析

2.3.1 實驗設計及結果

由單因素試驗結果發現,pH和料液比對酶解效果的影響不明顯,因而本研究選擇酶解時間(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)3個條件進一步優化,固定酶解pH為7.0,料液比為1∶3(g∶mL)。實驗設計及水解度和XOD抑制活性結果見表4。以XOD抑制活性為主要指標，水解度為輔助指標，當酶解時間為4h,加酶量為0.2%，酶解溫度為55℃時結果最佳。

表4 響應面實驗設計及結果Table 4 Experimental design and results for response surface methodology

續表4

2.3.2 響應面優化模型的建立及方差分析

利用Design-Expert 10軟件對表4中的結果進行多元回歸擬合,得到水解度和XOD抑制活性對于酶解時間(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)的二次回歸方程：Y1=11.73+0.92A+1.09B-2.27C+0.082AB-1.02AC-(6.963E+003)BC-0.17A2-0.35B2-0.85C2,R2=0.977 2；Y2=54.60-0.85A-1.11B-3.09C+0.081AB-0.32AC-0.50BC-5.16A2-4.05B2-5.84C2,R2=0.969 9。對擬合的回歸模型方程進行方差分析及顯著性檢驗,結果見表5。研究發現,各因素對水解度和XOD抑制活性影響的強弱順序為溫度>加酶量>時間,A、B、C、AC、C2對水解度的影響為極顯著(P<0.01)；C、A2、B2、C2對XOD抑制活性的影響為極顯著(P<0.001)。結果表明回歸模型與實驗結果的擬合度較好,模型構建合理,可用于蛋白水解度和酶解產物XOD抑制活性的分析和預測。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

2.3.3 響應面交互作用分析

曲面圖中曲線的陡峭程度了反映各個因素對響應值影響的大小,曲線越陡,影響越大；響應圖中等高線的形狀反映了2因素間交互作用的顯著性,形狀越陡,說明交互作用越顯著[23]。由圖2可知,在各因素中,溫度對水解度的影響最為顯著,加酶量和時間對水解度的影響相對較小。酶解時間、加酶量和酶解溫度的兩兩交互作用不顯著。由圖3可知,加酶量與酶解時間和酶解溫度的交互作用均顯著,酶解時間和溫度2因素間的交互作用對XOD抑制活性的影響相對次之。

a-加酶量和時間交互作用；b-溫度和時間交互作用；c-溫度和加酶量交互作用圖2 各因素相互作用對水解度影響的響應面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour lines of interaction of factors on the degree of hydrolysis

a-加酶量和時間交互作用；b-溫度和時間交互作用；c-溫度和加酶量交互作用圖3 各因素相互作用對XOD抑制活性影響的響應面及等高線圖Fig.3 Response surface and contour lines of interaction of factors on XOD inhibition activity

2.3.4 響應面模型優化及驗證

綜合響應面優化結果及現實因素,確定卵形鯧鲹魚糜最佳酶解工藝如下,酶解時間3.85 h,加酶量0.19%,酶解溫度54 ℃。對應的的水解度及XOD抑制活性的預測值分別為12.03%和55.10%。為了驗證模型預測的準確性,用此優化條件重復試驗3次,實際得到的水解度和XOD抑制活性值分別為11.82%和52.41%。由此可見,該回歸模型可以較好地預測卵形鯧鲹蛋白的酶解情況。

2.4 肽分子質量分布分析

大量研究表明,小分子質量的多肽具有更高的XOD抑制活性。HE等[24]通過乙醇分級將鰹魚酶解凍干產物TPH分為2組,發現醇溶性組分富含分子質量<1 000 Da的肽段且XOD抑制活性顯著高于其余2個組分。LI等[15]用尺寸排阻凝膠色譜對鰹魚酶解物的分離組分進一步純化,發現分子質量<1 000 Da的肽段組分其XOD抑制活性顯著高于其他組分。MUROTA等[25]研究發現,醇溶性組分的鯊魚軟骨蛋白酶解物的肽分子質量分布于300～7 000 Da,經體內外實驗驗證,該組分可提高大鼠血清XOD抑制活性,但其本身在較高濃度下也沒有體外XOD抑制活性,這說明乙醇溶性組分中的肽段在消化、吸收和代謝過程中可能轉化為具有XOD抑制活性的小肽段。卵形鯧鲹酶解產物肽分子質量分布如圖4所示,分子質量<1 000 Da的肽段高達53.57%,顯著高于其他組分；其次為分子質量1 000～3 000 Da的肽段,占比為40.35%；分子質量<3 000 Da的肽段占據總量的93.92%。肽分子質量分布結果表明,卵形鯧鲹酶解物的XOD抑制活性可能主要來源于分子質量<3 000 Da的肽段。

圖4 卵形鯧鲹酶解產物HPLC色譜圖以及分子質量分布圖Fig.4 HPLC chromatogram of hydrolysates of Trachitus ovatus and its molecular weight distribution

2.5 氨基酸組成分析

已有研究證實,蛋白質或多肽的氨基酸的組成決定了其生物活性[26]。XOD活性位點附近氨基酸殘基能形成疏水空腔,某些氨基酸能進入疏水空腔,與XOD中的氨基酸殘基間以疏水相互作用、氫鍵、靜電相互作用、范德華力等作用力發生競爭性或非競爭性結合,從而改變其空間結構,進而抑制XOD活性,達到減少尿酸生成的效果[8]。該疏水空腔是XOD抑制劑發揮抑制作用的重要區域,疏水性較強的肽段可能更易通過疏水相互作用進入此區域,從而影響鉬碟呤中心的催化活性。由表6可知,卵形鯧鲹原料中總疏水氨基酸占氨基酸總量的30.68%,酶解后的產物其總疏水氨基酸占比提高至36.95%,其中含量較高的為亮氨酸和苯丙氨酸,其次為纈氨酸和異亮氨酸,這可能與XOD抑制活性有關。李宇娟等[27]的研究也表明,富含疏水氨基酸肽段組分的XOD抑制活性顯著高于其他組分,本研究結果與其具有相似性,都說明了疏水氨基酸可能在多肽的XOD抑制活性中發揮著重要的作用。

表6 卵形鯧鲹魚肉及酶解物的氨基酸組成 單位：%

3 結論與討論

本研究比較了5種酶對卵形鯧鲹魚糜蛋白水解度和XOD抑制活性的影響。基于單因素試驗,采用Box-Behnken設計分析,確定了以卵形鯧鲹為原料制備XOD抑制肽的最佳酶解工藝：采用中性蛋白酶,料液比為1∶3(g∶mL),酶解溫度為54 ℃,pH為7.0,酶解時間為3.85 h,加酶量為0.19%。在此條件下測得水解度和XOD抑制活性值分別為11.82%和52.41%,與預測值基本相符,說明在該實驗范圍內建立的二次線性回歸模型準確有效,具有一定的參考價值。肽分子質量及氨基酸分析結果表明,具有高XOD抑制活性的卵形鯧鲹酶解產物大多為分子質量<3 000 Da的肽段,且亮氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸含量較高。本研究表明,卵形鯧鲹是制備XOD抑制肽較為理想的原料來源,制備得到的產物活性較高,可為卵形鯧鲹高值化利用提供方法和技術指導。