石斑魚肉肽粉的氨基酸組成分析與營養價值評價

徐杰,廖津,林澤安,唐振冬,范秀萍,3,4*,孫欽秀,3,4,劉書成,3,4*,蘇偉明

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524088)2(暨南大學 食品科學與工程系,廣東 廣州,510632) 3(南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江),廣東 湛江,524088) 4(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,大連工業大學,遼寧 大連,116034)

珍珠龍膽石斑魚(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂E.lanceolatus),屬于鱸形目、鮨科、石斑魚屬,具有成長快、病害少、抗逆性強、肉質細膩、營養豐富等優點,是我國南方海水養殖的重要經濟魚類之一,年產量高達10萬t,產值超100億元[1-3]。其銷售主要以活魚為主,但由于保活流通技術的限制,其死亡率較高,死亡石斑魚的銷售價格大大降低。針對死亡的珍珠龍膽石斑魚,采用一些技術手段開發高附加值產品(如酶解制備活性肽、提取魚油等),可以提高其經濟價值。

目前,利用水產蛋白通過酶解制備生物活性肽是科學研究和消費市場關注的熱點之一。因為這類生物活性肽具有抗氧化、降血壓、抗凝血、提高免疫力等多種生理功能,且容易被機體吸收[4-7]。珍珠龍膽石斑魚肉是一種優質蛋白質來源(85.19%,干背基),必需氨基酸(essential amino acid,EAA)含量高(34.56%,干背基)[8],是開發生物活性肽的優質原料。本研究以保活流通過程中死亡的珍珠龍膽石斑魚為對象,采用生物酶解制備小分子肽,并對其超濾處理,分析超濾組分的蛋白質含量和氨基酸組成,評價其營養價值,為利用珍珠龍膽石斑魚肉酶解產物開發生物活性肽提供基礎數據,實現其高值化利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

珍珠龍膽石斑魚是實驗室保活流通試驗中剛死亡的魚,魚體完整、健康,個體質量為(500±50)g。取魚肌肉,經高速組織搗碎機搗碎后,等量分裝,-20 ℃冰箱保存備用。

風味蛋白酶(酶活力30 000 U/g),廣西南寧東恒華道生物科技有限責任公司；檸檬酸鈉,上海碧云天生物技術有限公司；分子標準品：桿菌酶(M：1 450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M：451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M：189 Da)、乙腈(色譜純),西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；羥脯氨酸測試盒,南京建成生物工程研究所；鹽酸(優級純),國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BSA224S-CW型萬分之一電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Varioskan Flash型酶標儀,美國賽默飛世爾科技公司；pHS-3C型雷磁pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司；VAP450型全自動凱氏定氮儀,德國格哈特分析儀器有限公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀,日本日立公司；LC20AD型高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 石斑魚肉酶解產物超濾組分的制備

采用課題組前期優化的酶法工藝[9]制備珍珠龍膽石斑魚肉酶解產物(enzymatic hydrolysates,EH)：魚肉與水的比例1∶3.5(g∶mL)、pH 7、溫度53 ℃、風味蛋白酶添加量1 050 U/g,酶解5.5 h后煮沸滅酶,再冷卻至室溫,離心取上清液。分別采用8 k、5 k、3 kDa的超濾膜對酶解液進行分離,獲得4種組分：EH-1(>8 kDa)、EH-2(5 k～8 kDa)、EH-3(3 k～5 kDa)和EH-4(<3 kDa)；對4種組分分別進行蒸發濃縮和真空冷凍干燥,獲得4種魚肉肽粉產品。

1.3.2 蛋白質含量測定

參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》,采用凱式定氮法測定魚肉肽粉的蛋白質含量。

1.3.3 膠原蛋白含量測定

羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白中,而在其他蛋白中含量較少,甚至不存在。本實驗采用試劑盒法測定魚肉肽粉中的羥脯氨酸含量,然后乘以換算系數轉換為膠原蛋白含量。水生動物的換算系數一般為11.1[10],膠原蛋白含量計算如公式(1)所示：

膠原蛋白含量/(μg·mg-1)=羥脯氨酸含量(μg·mg-1)×11.1

(1)

1.3.4 氨基酸組成測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》,采用酸水解進行前處理后測定魚肉肽粉的氨基酸組成。

1.3.5 相對分子質量分布測定

參考GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》,采用高效凝膠過濾色譜法測定魚肉肽粉的相對分子質量分布。

1.3.6 營養價值評價

采用氨基酸評分(amino acid score,AAS)、化學評分(chemical score,CS)、氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系數(ratio coefficient,RC)、氨基酸比值系數分(score of ratio coefficient,SRC),對魚肉肽粉進行營養價值評價[11-12]。

1.3.7 數據處理與分析

每個試驗重復3次,數據用平均值±標準差表示；用SPSS軟件進行單因素方差分析和Duncan多重比較進行組間顯著性分析,P<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 魚肉肽粉的粗蛋白和膠原蛋白含量測定

從表1可知,石斑魚肉肽粉中粗蛋白含量較高,達到63%以上,是優質的蛋白質來源。包斐[13]采用酶解法制備長蛇鯔魚肉蛋白粉,其蛋白含量高達74.68%,略高于本實驗結果,這可能與酶解制備工藝有關,還可能與魚的品種有關。石斑魚肉肽粉的膠原蛋白含量較低,在5%左右。張延華等[14]測定了鱸魚、鮻魚、草魚和鯉魚等魚肉中的膠原蛋白,其含量與本實驗結果接近。雖然石斑魚肉肽粉中膠原蛋白含量偏低,但其具有較強的抗氧化等生物活性,可以增強其肽粉的功能特性。

表1 魚肉肽粉的粗蛋白與膠原蛋白含量 單位：g/100 g

2.2 魚肉肽粉的氨基酸組成

從表2可知,EH-2未檢出天冬氨酸和絲氨酸,EH、EH-1、EH-3、EH-4均含有16種氨基酸；5種魚肉肽粉均含有7種人體EAA(色氨酸未測),總氨基酸含量(total amino acids,TAA)在16.47～18.81 g/100 g,EAA含量在11.11～13.44 g/100 g,其EAA占TAA的比例在67.09%～71.52%。F值是指支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)與芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)含量的比值,F值越大說明蛋白質潛在的生物活性可能越好[15]。從表2可知,魚肉肽粉經過超濾分離后,各分離組分的F值比未分離EH高,說明超濾分離可以提高肽粉的潛在生物活性功能。

從表2還可知,石斑魚肉肽粉的亮氨酸含量最高(2.95～3.85 g/100 g),較高的亮氨酸水平飲食對激活胰島素信號通路有著重要作用,從而增強機體的糖酵解和脂肪酸的合成[16],此外,與亮氨酸同屬于支鏈氨基酸的纈氨酸和異亮氨酸的含量也比較豐富,有增強免疫力、防止肌肉損傷的功能。石斑魚肉肽粉的賴氨酸含量也較高,占氨基酸總量的8.6%以上。賴氨酸是谷物類食品的第一限制氨基酸,故石斑魚肉肽粉可作為以谷物為主的膳食模式的賴氨酸補充劑,同時賴氨酸還具有促鈣吸收、促食欲、促進幼兒生長發育、減輕焦慮等功能[17]。石斑魚肉肽粉的苯丙氨酸含量也較高,達到了1.96 g/100 g以上。苯丙氨酸可以調節人體中酪氨酸的濃度[18],合成神經遞質和激素,參與機體代謝。石斑魚魚肉肽粉的精氨酸同樣含量豐富,均在1.7 g/100 g以上,占TAA含量的10%左右。精氨酸是嬰兒的EAA,也是人體多種物質的合成底物,如肌酸、NO、多胺、脯氨酸、谷氨酸和高精氨酸等,與血管舒張、免疫、神經傳遞、能量代謝和預防多個系統的功能障礙有關[19]。因此,石斑魚肉肽粉是一種較好的人體EAA來源,可作為開發適合各年齡階段的功能食品原料。

表2 石斑魚肉肽粉的氨基酸含量 單位：g/100 g

2.3 魚肉肽粉的呈味特征

蛋白酶解產物的呈味特征很大程度取決于氨基酸的種類與含量[20]。味道強度值(taste activity value,TAV)是評價呈味物質對呈味特征貢獻程度的重要指標,它是指呈味物質的濃度與其呈味閾值的比值。當TAV<1時,該呈味物質對呈味特征的貢獻較小；TAV越大說明該呈味物質對呈味特征的貢獻越大。石斑魚肉肽粉的呈味特征見表3。石斑魚肉肽粉的呈味特征為苦味>鮮味>甜味。且除脯氨酸和酪氨酸TAV<1外,魚肉肽粉中其他氨基酸TAV均>1。

谷氨酸和天冬氨酸能為食品提供鮮味,決定食品的鮮美程度,且普遍認為谷氨酸對鮮味的作用大于天冬氨酸,同時各組分谷氨酸的TAV值均>天冬氨酸的TAV值,因此,谷氨酸是石斑魚肉肽粉的主要鮮味來源。各組分的甜味氨基酸TAV值均為丙氨酸最高,明顯高于其他甜味氨基酸,是甜味的主要來源。研究表明[15],丙氨酸是水產品中重要的甜味氨基酸,可與谷氨酸等鮮味氨基酸協同呈鮮。

表3 石斑魚肉肽粉氨基酸的TAVTable 3 TAV of amino acids in peptides powder from grouper muscle

蛋氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等為魚肉肽粉貢獻較多的苦味,故該肽粉整體呈現苦味。有研究表明[23],水產蛋白的酶解產物通常具有一定的苦味,這是由于在酶解過程中大分子蛋白質水解成小肽,較多的疏水性氨基酸和堿性氨基酸暴露。根據相關研究[24],含有苦味的物質分子質量在1 kDa以下的占85.1%,而魚肉肽粉正是小分子肽產品。通過促進多肽的卷曲,使疏水性氨基酸隱藏在肽鏈內部,以及深度酶解促使疏水性氨基酸殘基轉化為游離氨基酸,都能使肽粉的苦味減少[25]。

2.4 魚肉肽粉的營養價值評價

AAS和CS是評價氨基酸營養價值最主要的方法,但是具有片面性,而世界衛生組織(World Health Organization,WHO)/聯合國糧食及農業組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)提出以氨基酸模式來評價蛋白質營養價值,同時根據氨基酸模式來計算RAA、RC以及SRC,可以較為直觀反映樣品氨基酸含量偏離氨基酸模式的程度及EAA對氨基酸平衡的影響[26],綜合運用這些方法可以較為全面、準確地評價樣品的相對營養價值。

AAS是指樣品中某種EAA的含量與FAO/WTO推薦的理想蛋白同種氨基酸含量的比值,其中最小的AAS值就是該樣品的氨基酸評分,AAS最小的EAA被稱為該樣品的第一限制氨基酸。如果樣品中某種EAA的AAS<1,說明該樣品的EAA模式不滿足FAO/WTO推薦的理想蛋白模式,其蛋白質的營養價值偏低；如果樣品所有EAA的AAS都>1,說明該樣品的蛋白質營養價值較高。

石斑魚肉肽粉的AAS為1.56(表4),經超濾處理后除了EH-2組分外,其他分離組分的AAS均>1,這也說明石斑魚肉肽粉及其超濾分離組分均有較高的營養價值。李慧凝等[27]以酶解法制備鰹魚肽,鰹魚肽的AAS均近似或大于1.0。因此,從蛋白質角度來講,魚肉肽具有較高的營養價值。

表4 石斑魚肉肽粉的氨基酸評分Table 4 Amino acid score(AAS) of peptides powder from grouper muscle

CS是指樣品中某種EAA含量與雞蛋蛋白中同種氨基酸含量的比值,其比值的意義與AAS一樣。石斑魚肉肽粉的CS分別為1.19、1.19、0.32、1.12、1.10(表5),說明除EH-2外其他組分的蛋白質營養價值在一定程度上優于雞蛋蛋白質。

表5 石斑魚肉肽粉的化學評分Table 5 Chemical score(CS) of peptides powder from grouper muscle

蛋白質的營養價值與其EAA的種類、數量及平衡狀態密切相關。從表6可知,石斑魚肉肽粉的EAA占TAA的比值除EH-2組分的蘇氨酸外,均優于模式值。石斑魚肉肽粉EAA中亮氨酸占比特別高,為模式值的2.5倍以上；苯丙氨酸+酪氨酸以及賴氨酸占比也較高,為模式值的2倍左右。單個氨基酸占比過高或過低于模式值均會影響氨基酸平衡,但是各組分的EAA占比的變化規律與模式值相似。總體而言,該肽粉的EAA種類齊全,含量豐富,且組成合理,是1種優質氨基酸產品。

表6 石斑魚肉肽粉的EAA模式 單位：%

通過計算EAA的RAA、RC、SRC來評價樣品的營養價值。從表7可知,EH-3的SRC值最高達到了80.43,EH-2的SRC值較低為53.44,各樣品的氨基酸平衡性為：EH-3>EH-1>EH>EH-4>EH-2,且蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸及苯丙氨酸+酪氨酸的RC值接近1,表明5種EAA含量比例與氨基酸模式最接近。各組分的亮氨酸的RC值最高,但蘇氨酸和纈氨酸的RC值均<1,EH、EH-1、EH-2的第一限制氨基酸為蘇氨酸,同時EH-2的蘇氨酸RC值只有0.19,對氨基酸平衡起著很大的負作用；而EH-3、EH-4的第一限制氨基酸為纈氨酸。綜上所述,石斑魚肉肽粉是1種營養價值較高的海洋來源蛋白。

表7 石斑魚肉肽粉EAA的RAA、RC、SRCTable 7 RAA,RC and SRC of EAA in peptides powder from grouper muscle

2.5 魚肉肽粉的相對分子質量分布

根據實驗前期結果[9]及SRC,選取石斑魚肉肽粉中抗氧化活性較高同時比值系數分最高的組分EH-3,分析其相對分子質量分布。EH-3分子質量為249 Da,且EH-3組分中分子質量在1 kDa以下的含量為97%,說明經過酶解之后的魚肉大部分降解為小分子肽,容易被人體吸收[29]。巫楚君等[30]通過復合蛋白酶酶解黃鰭金槍魚肉,其酶解產物分子質量大部分在1 kDa以下,本試驗結果與之相似。

3 結論

珍珠龍膽石斑魚肉肽粉是一種高蛋白食物,粗蛋白質含量達63.41%以上；魚肉肽粉的EAA組成齊全、含量豐富、比例相對均衡,具有較高的營養價值。經過超濾分離的石斑魚肉肽粉為開發具有多種生物活性功能產品提供了優質的原料,然而肽粉還呈現出一定的苦味,如何消減或消除肽粉的苦味還有待于進一步深入研究。