聯檢速測卡快速檢測保健食品中他達拉非與西地那非

歐愛芬,羅奕銘,趙肅清

1(廣東工業大學 生物醫藥學院,廣東 廣州,511400)2(廣州城市職業學院,廣東 廣州,510405) 3(廣州瑞森生物科技有限公司,廣東 廣州,511400)

保健食品是指具有特定保健功能或者以補充維生素、礦物質為目的的食品,適宜于特定人群食用,具有調節機體功能,不以治療疾病為目的,并且對人體不產生任何急性、亞急性或者慢性危害的食品[1-3]。目前保健食品可以申報的功能有27類,其中緩解體力疲勞類保健食品就是通過保健食品中的功效成分對人體進行修復和調整,提升人體的精氣神,緩解體力疲勞[4]。但是不法商家在利益的驅使下,通過添加一些化學藥品到緩解體力疲勞類保健食品中來增強效果,尤以大量添加治療臨床勃起功能障礙的化學藥物最為普遍,其中最容易添加的是拉非和那非類[5-7]。而這些西藥必須在醫生的指導下才能使用,過量的使用他達拉非或者西地那非,容易導致神經系統、心血管系統、呼吸系統出現異常等現象[8-10]。2020年四平市食品藥品檢驗所共篩查壯陽類保健品206批,其中185批含有非法添加成分枸櫞酸西地那非,檢出率高達89.8%。因此對保健食品中的非法添加物質進行檢測是非常有意義的[11]。

目前保健食品中禁限用物質的檢測方法主要是色譜[12-13]、色譜質譜聯用技術[14-15]和免疫分析技術[16-17]等。其中色譜技術包括高效液相色譜、氣相色譜、離子色譜等,色譜質譜聯用包括氣質聯用、液質聯用等,均具有檢測精密度高、準確性好等優點[18-19],但是需要專門的儀器設備,專人技術人員操作,并且前處理與檢測時間長,適用于實驗室小批量樣品的檢測。免疫分析檢測包括放射性免疫分析技術、酶免疫分析技術和金標免疫分析技術等[20]。免疫分析方法均具有特異性強、靈敏度高、準確、快速、操作簡便等優點[21-23],其中放射性免疫分析技術使用的放射性同位素存在輻射和污染,常規的酶聯免疫檢測與金標免疫檢測一次只能檢測一種違禁藥物,若要對同一種物質的多種違禁藥物同時進行檢測需要進行多次實驗,操作繁瑣費時,因此,亟需建立一種能夠同時檢測多種違禁藥物的新型檢測方法。

本實驗制備金標記他達拉非-西地那非單克隆抗體,建立他達拉非與西地那非聯檢速測卡,并對聯檢速測卡的靈敏度、準確性及穩定性進行實驗。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

他達拉非標準品、西地那非標準品,德國Dr.Ehrenstorfer公司；他達拉非(抗原11.3 mg/mL,抗體8.5 mg/mL)、西地那非(抗原14.5 mg/mL,抗體9.8 mg/mL),廣州優抗多生物技術有限公司；羊抗鼠二抗(5 mg/mL),洛陽佰奧通實驗材料中心；60份緩解疲勞類保健品樣品,第三方檢測單位。

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),北京正將高科公司；氯金酸,國藥集團化學試劑有限公司；聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、三羥甲基氨基甲烷(Tris),北京鼎國生物；檸檬酸三鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇,廣州化學試劑廠；曲拉通100、聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)、三(羥甲基)氨基甲烷、海藻糖、酪蛋白,廣州國藥中心；硝酸纖維素膜,Sartorius；玻璃纖維,韓感中國；吸水紙、pvc底板、鋁箔袋,廣州正明生物科技有限公司；表面活性劑S9(Tetronic1307)、表面活性劑S17(RHODASURF ON-870)、表面活性劑S21(BRIJ 35),揚州惠爾科技有限公司；吐溫-20、吐溫-100,默克化工技術(上海)有限公司。

R5DD-2連續點膜機,韓感；85-2數顯恒溫磁力攪拌器,常州越新儀器制作有限公司；HM3030三維劃膜噴金儀、WM-100金標試紙分切機,上海金標生物科技有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機,湖南湘儀實驗設備有限公司；紫外分光光度儀,廣州分析測試中心；JEM 1400透射電鏡,日本電子株式會社；Nano Series Nano AS90型粒度測定儀,英國馬爾文儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜-6410 三重四極桿串聯質譜儀,Agilent 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)：稱取7.9 g NaCl,0.2 g KCl,0.24 g KH2PO4和1.8 g K2HPO4,溶于800 mL蒸餾水中,用HCl溶液調節溶液pH值至7.4,最后加蒸餾水定容至1 L。保存于4 ℃冰箱中備用。

他達拉非標準工作液：精密稱取10.00 mg他達拉非標準品用甲醇定容至10 mL,配制質量濃度為1 mg/mL的他達拉非標準儲備液；精密移取5 mL儲備液用PBS定容至50 mL,配制100 μg/mL的他達拉非標準工作液。

西地那非標準工作液：精密稱取10.00 mg西地那非標準品用甲醇定容至10 mL,配制質量濃度為1 mg/mL的西地那非標準儲備液；精密移取5 mL儲備液用PBS溶液定容至50 mL,配制100 μg/mL的西地那非標準工作液。

重懸液：稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)5.85 g,蔗糖2.5 g,海藻糖2.5 g,BSA 1 g溶于150 mL水中,再加入2 mL吐溫-20。

1.2.2 膠體金溶液的制備

金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關,一旦顆粒大小發生變化,光散射也隨之發生改變,產生肉眼可見的顯著的顏色變化,這就是金溶膠用于免疫沉淀或免疫凝集試驗的基礎[24-26]。

利用檸檬酸三鈉還原法制備金納米粒子,還原劑的含量與金納米粒子的粒徑大小密切相關。在其他條件保持不變的情況下,僅改變加入的檸檬酸三鈉的含量,可制得不同顏色的金溶膠,即不同粒徑的金溶膠。其中在紫紅色向酒紅色過渡的過程中,溶液最大吸收波長528 nm的吸光度峰值最高,為最好的金顆粒選擇條件[25,27]。

檸檬酸三鈉的含量優化：取6個150 mL的圓底燒杯進行鉻酸浸泡后用純水進行洗滌,隨后分別加入質量分數0.01%氯金酸水溶液100 mL,用加熱型磁力攪拌器加熱至沸騰,在攪拌狀態中于6個圓底燒杯中分別加入質量分數1%檸檬酸三鈉水溶液0.3、0.45、0.7、1.0、1.5、2.0 mL,金黃色的氯金酸水溶液在5 min內變色,保持沸騰15 min后停止加熱,冷卻后用蒸餾水定容到原體積,通過紫外分光光度儀、透射電鏡觀察選擇最佳顏色、吸收峰及粒徑指標。

將最優的膠體金溶液裝入棕色密封容量瓶中,避光4～10 ℃保存待用。

1.2.3 金標記他達拉非和西地那非單克隆抗體的制備

取6個1.5 mL的離心管,各吸取1 mL膠體金溶液于潔凈離心管中,加入一定量0.1 mol/L碳酸鉀溶液調節膠體金溶液pH值至6.5,混勻5 min后,在一系列裝有1 mL膠體金溶液的試管中加入他達拉非/西地那非抗體量分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL,振蕩混勻,室溫放置20 min后,觀察離心管顏色,使溶液顏色保持紅色的最低濃度為最適抗體濃度。

在確定的最適金標抗體濃度中加入質量分數10% BSA封閉15 min；在冷凍離心機11 000 r/min離心15 min,去除上清液后加入100 μL重懸液(標記上的抗體膠體金,10倍濃縮),分別得到金標記他達拉非和西地那非單克隆抗體溶液。

1.2.4 金標抗體結合墊的制備

設定金標噴金儀儀器程序,噴金體積為3 μL/cm2,速度為100 mm/s,將烘干好的樣品墊放置在噴金儀平臺上,設定好儀器,分別將標記好的金標記他達拉非和西地那非單克隆抗體溶液均勻地噴在金墊上后在烘房(35～40 ℃)放置6 h,待測。

1.2.5 樣品墊的制備

樣品墊處理液的選擇：制備20份基礎液,取400 mL PBS液體,加入2.75 g海藻糖、1.5 g BSA、1.9 g酪蛋白、1 mL曲拉通100作為基礎液。

配制不同濃度的吐溫-100、吐溫-20、表面活性劑S9、S17、S21作為樣品墊處理液分別加入到基礎液中,充分混勻,取適量的玻璃纖維完全浸泡,浸泡時間8～10 s,靜置后50 ℃烘箱烘烤10 h至完全烘干,組裝試劑卡后配合金標墊使用,對比不同樣品墊處理液對膠體金免疫分析顯色效果的影響,篩選合適的樣品墊處理液體系。

1.2.6 劃膜

配制他達拉非抗原劃膜液：將原質量濃度他達拉非抗原(11.3 mg/mL)用質量分數1%海藻糖PBS溶液稀釋至0.5 mg/mL(30 μL)；

配制西地那非抗原劃膜液：將原質量濃度西地那非抗原(14.5 mg/mL)用PBS稀釋至0.3 mg/mL(30 μL)；

配制二抗劃膜液：將原質量濃度羊抗鼠二抗(5 mg/mL)用1%海藻糖5%甲醇PBS溶液稀釋至1 mg/mL(60 μL)。

將配制好的劃膜液倒吸在劃膜針管上,硝酸纖維素膜粘在PVC底板上,放置于劃膜儀平臺,設定劃膜儀主機程序,劃膜寬度為0.8 μL/cm,速度為110 mm/s；將包被好的硝酸纖維素膜放置于溫度35～40 ℃、濕度30%下的烘房或烘箱,烘干24～48 h,干燥后封袋保存備用,使他達拉非-OVA所劃線標記為檢測線T1,西地那非-OVA所劃線標記為檢測線T2,羊抗鼠二抗所劃線標記為質控線C。

1.2.7 膠體金免疫層析他達拉非-西地那非聯檢速測卡組裝

將樣品墊、膠體金墊、已包被好抗原和二抗的硝酸纖維素(nitrocellulose filter,NC)膜、吸水紙依次粘貼到PVC底板上,切割成條,裝卡封口密封,置于干燥器中常溫保存備用。

該法將他達拉非偶聯OVA,西地那非偶聯OVA作為包被抗原分別劃在NC膜上,當樣品不含有他達拉非(西地那非)或含量低于其檢測靈敏度時,金標墊上釋放的金標記特異性抗體與NC膜上的他達拉非(西地那非)偶聯OVA結合,因而被截留在該處顯紅色線。但當樣品中他達拉非(西地那非)的含量高于其檢測靈敏度時,金標記特異性抗體會先與他達拉非(西地那非)結合,當流到他達拉非(西地那非)偶聯OVA檢測線時,則僅有少量或沒有金標記特異性抗體能與相應的包被抗原結合,此時在他達拉非(西地那非)上的檢測線不顯色或者顏色弱于質控線。無論樣品中是否含有他達拉非(西地那非),金標記鼠源特異性單克隆抗體都能與質控線上的羊抗鼠二抗結合形成膠體金滯留而顯紅色。因此,結果的判定為當T線的顏色與C線的顏色一樣或者強于C線時,結果為陰性；當T線的顏色弱于C線,或者無色時,結果為陽性；當C線無色時,則該試紙條無效。

1.2.8 樣品制備

1.2.8.1 陰性樣品的制備

采用第三方檢測公司提供的40份他達拉非、西地那非陰性保健品樣品。第三方檢測公司依據質檢總局發布的2014年第4批119項出入境檢驗檢疫行業標準的通知“國質檢認〔2014〕614號”,采用標準SN/T 4054—2014《出口保健食品中育亨賓、伐地那非、西地那非、他達那非的測定 液相色譜-質譜/質譜法》,用液質聯用(HPLC-MS/MS)法對40份抗疲勞類保健樣品(均為液體)進行測定,結果均為陰性。

1.2.8.2 他達拉非和西地那非加標陽性樣品的制備

他達拉非(西地那非)加標陽性樣品的制備：分別移取他達拉非(西地那非)標準工作液0.5、1、2 μL于999.0、998.0、996.0 μL陰性樣品中混勻,配制成質量濃度為50、100、200 μg/L的他達拉非(西地那非)加標陽性樣品。

1.2.8.3 實測陽性樣品的準備

采用第三方檢測公司提供的10份他達拉非與10份西地那非陽性保健品樣品。第三方檢測公司依據質檢總局發布的2014年第4批119項出入境檢驗檢疫行業標準的通知“國質檢認〔2014〕614號”,采用標準SN/T 4054—2014,用HPLC-MS/MS法對20份抗疲勞類保健品樣品(均為液體)進行測定,結果見表1。

表1 他達拉非與西地那非陽性樣品結果 單位：μg/L

1.2.9 靈敏度

分別用PBS溶液將他達拉非和西地那非標準品稀釋至0、50、100、200 μg/L的樣品液各10份。分別加100 μL于加樣口,反應10 min,觀察試紙條的顯色情況,以T線顯色最淺時的稀釋度作為試紙條最低檢測濃度。

1.2.10 假陽性率試驗

采用他達拉非-西地那非聯檢速測卡對40份經HPLC-MS/MS檢測為陰性的樣品進行檢測,并分別以含他達拉非/西地那非為0和100 μg/L的樣品液作為陰性對照和陽性對照,計算假陽性率。

1.2.11 假陰性率試驗

采用他達拉非-西地那非聯檢速測卡對40份陽性樣品液(10份為200 μg/L他達拉非加標陽性樣品,10份為200 μg/L西地那非加標陽性樣品,10份他達拉非實測陽性樣品,10份西地那非實測陽性樣品)進行檢測,并分別以含他達拉非/西地那非為0和100 μg/L的樣品液作為陰性對照和陽性對照,計算假陰性率。

1.2.12 他達拉非-西地那非聯檢速測卡的重復性

測試基質為抗疲勞口服液,采用空白樣品及他達拉非與西地那非添加量分別為200 μg/L的加標樣本進行驗證,取3個批號的檢測卡進行檢測,每一個水平10個平行,計算檢出概率(probability of detection,POD)值(檢出陽性結果次數占所有檢測結果的比率)。

2 結果與分析

2.1 膠體金溶液的制備

由表2、圖2可知,當1%檸檬酸加入量為1 mL時,制備的金溶膠顏色及粒徑最適用于膠體金免疫層析檢測,如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在525 nm。

2.2 金標記他達拉非-西地那非單克隆抗體的制備

膠體金溶液與不同質量濃度他達拉非-西地那非單克隆抗體結合,混勻靜置后,通過顏色判斷,使溶液保持通透紅色,且使用量最低的為最適抗體質量濃度,最終確定他達拉非-西地那非單克隆抗體為8.5和7.84 μg/mL。

表2 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對金溶膠粒徑的影響Table 2 Effect of the amount of Trisodium citrate in chloroauric acid on the particle size of gold Sol

圖2 金溶膠結合效果圖Fig.2 Results of Gold Sol binding effect注:1～6分別表示1%檸檬酸0.3、0.45、0.7、1、1.5、2 mL

2.3 樣品墊處理液的優化

處理液中加入表面活性劑可起到增溶的作用,促使分子的有效基團暴露并進行充分的反應,從而提升反應的靈敏度。由表3可知,基礎液中添加不同的表面活性劑對樣品測定時的顯色效果影響較大,基礎液中添加質量濃度為0.5%的吐溫-20效果為最佳。

表3 不同表面活性劑的選擇結果Table 3 Selection results of different surfactant

2.4 靈敏度

如圖3所示,他達拉非和西地那非在各梯度濃度下的顯色檢測呈現梯度變化。當他達拉非和西地那非質量濃度在200 μg/L時,2種檢測物的檢測線均無明顯顯色,質控線顯色；2種檢測物含量分別在50、100 μg/L時,檢測線稍有顯色,質控線顯色；當樣品中不含他達拉非和西地那非時,質控線和檢測線都有明顯的顯色。這表明了所制備的膠體金免疫層析試紙條具有良好的敏感性與特異性,可判定該膠體金檢

圖3 梯度質量濃度顯色結果Fig.3 The results of color gradient concentration

測試紙卡對他達拉非和西地那非的檢測限均為200 μg/L。此外,當滴液量為100～120 μL,判讀結果無明顯差異。但是當滴液量超過200 μL,膠體金試紙條會出現死金現象,或者層析墊因浸泡太多液體而出現假陽性。因此優選滴液量為100～120 μL。通過圖3可知,檢測卡的穩定性及色度辨析達到判讀要求,可以實現現場快速檢測,對監管檢測工作提供便捷的檢測利器。

2.5 假陽性率試驗

對40份經HPLC-MS/MS法檢測為陰性的樣品進行檢測,以他達拉非200 μg/L、西地那非200 μg/L為判定限進行判斷,40份樣品均為陰性,該40份樣品的假陽性率為0,見圖4。

圖4 前10個樣品顯色結果Fig.4 Color rendering results of the first 10 samples

2.6 假陰性率試驗

他達拉非-西地那非聯檢速測卡對20份陽性樣品進行檢測,以他達拉非200 μg/L、西地那非200 μg/L為判定限進行判斷,20份樣品均為陽性,該20份樣品的假陰性率為0,見表4。

表4 樣品陽性樣本檢測結果Table 4 Test results of positive samples

2.7 他達拉非-西地那非聯檢速測卡的重復性測試

由表5可知,3個不同批次的他達拉非-西地那非聯檢速測卡的檢測結果均未出現陽性反應,表明方法重復性較好。

表5 重復性測試結果Table 5 Result of repeatability

3 結論與討論

目前還沒有關于同時檢測他達拉非與西地那非的免疫層析分析方法的報道。本文成功建立快速檢測保健食品中非法添加抗疲勞藥物他達拉非與西地那非聯檢速測卡,通過大量樣本的測試,梯度濃度顯色結果表明：他達拉非-西地那非聯檢速測卡的靈敏度分別為西地那非200 μg/L、他達拉非200 μg/L,質量濃度梯度性可以有效確認樣本的半定量結果,整個檢測時間不超過10 min。通過大批實際樣品及加標樣品的測試,假陽性率和假陰性率均為0,重復性好,達到預期的測試效果。同時通過測試,檢測滴液量為100～120 μL。

該方法采用膠體金免疫層析技術,一個檢測卡用于同一個樣品中2種類似的違禁藥物的檢測,有效降低了制作成本,縮短檢測時間,比單檢技術更快捷方便,適應于抽檢現場大批量的樣品初篩。但是本研究沒有體系化的測試檢測卡的保質期,沒法確保產品在長期保存條件下的穩定性,后續應進行保質期穩定性測試。