豬苓多糖對LPS誘導的急性肺損傷模型大鼠炎癥因子的影響

李全有 劉海軍

河南省安陽市中醫院藥劑科，河南 安陽 455000

急性肺損傷(Acute lung injuny,ALI)是一種具有高發病率和死亡率的炎性疾病[1]。ALI或更嚴重的形式是急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)，其特征是嚴重的肺水腫，肺炎細胞聚集和炎性細胞因子的過量產生，導致強烈的肺部炎癥反應[2]。流行病學研究報告[3]指出，ALI仍然是世界范圍內重要的公共衛生問題，也是臨床醫生面臨的重大挑戰[3]。盡管已采取一些治療策略來改善功能結局，但ALI患者的死亡率仍然很高，故需要研究ALI的潛在機制和新的治療方法。豬苓多糖是由中藥豬苓提取的多糖類物質，能夠提高機體的細胞免疫功能[4]，豬苓多糖膠囊和注射劑均已獲得中國食品藥品監督管理局(SFDA)批準，已在中國單獨或與多種臨床藥物聯合使用來治療乙型肝炎，肺癌和肝癌等疾病[5]。在肺部疾病中，豬苓多糖可以通過抑制成纖維細胞向成肌纖維細胞的轉化，抑制肺成纖維細胞的增殖和遷移而發揮有效的抗纖維化作用[6]，說明了在肺部疾病中豬苓多糖可以發揮調控作用，但是在ALI中尚未有相關研究，本項目的開展可能為ALI的治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠(182～218 g)，18只，購自上海Slaccas實驗動物有限公司，并以12 h光照/黑暗周期飼養在SPF實驗動物室中，實驗過程中對動物的處置均符合動物倫理學標準。

1.2 藥物和試劑 豬苓多糖(國藥準字Z10970134，廣東華南藥業集團有限公司)，按劑量溶于生理鹽水；脂多糖(LPS)(北京索萊寶科技有限公司)，酶聯免疫吸附法ELISA試劑盒(abcam)。

1.3 動物分組和模型制備 將18只大鼠隨機分為三組，每組各6只：Control組，生理鹽水灌胃，腹腔注射生理鹽水；Model組，生理鹽水灌胃，腹腔注射LPS(5 mg/kg)；豬苓多糖組，豬苓多糖(250 mg/kg)灌胃，腹腔注射LPS(5 mg/kg)。每天灌胃一次，連續5 d，之后用腹腔注射LPS(5 mg/kg)建模。建模成功后6 h，麻醉斷頭處死，取出左肺組織稱濕重(W) ，于110 ℃烘烤24 h，稱重即為干重(D) ，計算肺組織濕干重比：W/D=W(mg) /D(mg) 。收集血清以及右肺組織進行后續試驗。

1.4 HE染色 提取肺組織，在緩沖液中保持48 h，之后進行脫水、浸蠟等操作，進行HE染色，蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.5 血清炎癥因子水平檢測 收集血液，4 ℃離心分離血清，分離后的血清放置在-80 ℃保存。使用ELISA試劑盒檢測血清中轉化生長因子(TGF)-α、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和白介素-1β的水平。

1.6 氧化自由基相關指標檢測 根據ELISA試劑盒說明，檢測肺組織中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、髓過氧化物酶(MPO) 和超氧化物歧化酶(SOD)的表達水平。

1.7 統計學分析 采用SPSS21.0版本用于統計分析。計量數據采用Mean±SD表示，服從正態分布，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學觀察 如圖1顯示，Control組肺泡未見出血和水腫，細胞浸潤結構清晰；Model組炎性細胞出現浸潤，肺泡損傷明顯，肺泡、肺間質和肺毛細血管發生水腫，肺泡壁增厚；豬苓多糖組水腫程度改善，損傷程度有一定減輕，出現少量炎性細胞浸潤。

圖1 HE染色

2.2 肺組織濕干重比 如表1所示，與Control組肺組織濕干重比相比，Model組肺組織濕干重比升高(P<0.05)，與Model組肺組織濕干重比相比，豬苓多糖組肺組織濕干重比降低(P<0.05)，說明豬苓多糖的治療能夠降低LPS誘導的急性肺損傷模型大鼠肺組織濕干重比。

表1 各組肺組織濕干重比

2.3 各組炎癥因子水平比較 如表2所示，與Control組相比，Model組TGF-α、 IL-18、IL-6和IL-1β表達明顯升高，而與Model組相比，豬苓多糖組TGF-α、 IL-18、IL-6和IL-1β表達水平有所降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組炎癥因子水平比較

2.4 氧化自由基相關指標檢測 如表3所示，與Control組相比，Model組MDA和MPO表達水平升高，而GSH-Px和SOD表達水平明顯降低，而與Model組相比，豬苓多糖組MDA和MPO表達水平有所降低，而GSH-Px和SOD表達水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組氧化自由基相關指標檢測

3 討論

ALI是一種進展性綜合征，其發病率和死亡率較高[7]。 ALI的生理特征是肺泡-毛細血管膜屏障的破壞，導致跨上皮炎性細胞的遷移和促炎性細胞因子的釋放顯著增加[8]。肺內皮細胞和肺泡上皮細胞均會發生損傷，導致肺功能喪失[9]。其特征在于促炎性介質的過度產生，炎性細胞的浸潤以及肺泡上皮細胞的凋亡，因此抑制失控的炎癥反應可能是治療ALI的關鍵。豬苓的使用在中國已經有2000多年的歷史，豬苓多糖是豬苓的主要成分，研究[10]表明，豬苓多糖可以通過調控有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)減輕LPS刺激的J774細胞的炎癥反應，在巨噬細胞免疫調控的研究中發現，豬苓多糖可以抑制M2巨噬細胞的黏附和偽足生成，能夠激活TLR2/TLR4-NF-κB信號通路，顯著增強免疫調節能力[11]，說明了豬苓多糖能夠參與疾病炎癥反應的調控作用。

LPS是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，已被廣泛用于通過氣管內插管法誘導ALI的動物模型。與Toll樣受體4(TLR4)結合后，LPS誘導下游信號傳導通路的激活，這些信號通路負責向肺內注入炎癥性細胞(即嗜中性白細胞)并產生炎癥原性細胞因子[12]。LPS與TLR4的結合還誘導IκB-α磷酸化和降解，促進核易位和NF-κB活化，并隨后導致過度釋放促炎性細胞因子，例如，腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，白介素(IL)-1β，IL-6][13]。此外，LPS可以激活MAPK家族成員JNK，活化的JNK可以磷酸化許多線粒體蛋白，包括Bcl-2和Bcl-xl[14]。

研究通過LPS構建急性肺損傷模型大鼠進行實驗操作，用豬苓多糖處理急性肺損傷模型大鼠，檢測結果發現Model組肺組織損傷嚴重，而豬苓多糖治療能夠有一定程度緩解肺損傷；與Control組相比，Model組肺組織濕干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表達，以及MDA和MPO表達水平升高，而GSH-Px和SOD表達水平明顯降低；與Model組相比，豬苓多糖組肺組織濕干重比，TGF-α、IL-18、IL-6和IL-1β表達水平，以及MDA和MPO表達水平有所降低，而GSH-Px和SOD表達水平升高。說明了豬苓多糖可以緩解LPS誘導的急性肺損傷模型大鼠炎癥反應，對于急性肺損傷的治療研究有一定的指導意義。