唾液牙齦卟啉單胞菌、MMP-8及TIMP-1水平與牙周炎的相關性分析

李明霞 徐玉 朱斐然 宋琳 李華 劉穎 張子路 楊秋波

[摘要] 目的 探討唾液生物標志物牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）、基質金屬蛋白酶-8（MMP-8）及金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）水平與牙周炎的相關性。 方法 選取2020年10月至2021年1月首都醫科大學附屬北京口腔醫院牙周科收治的牙周炎患者25例作為牙周炎組，另外同期該院牙周健康者22名作為牙周健康組。記錄所有研究對象牙周臨床參數，收集非刺激性唾液，實時定量PCR測定P. gingivalis水平，ELISA測定MMP-8及TIMP-1水平。比較牙周炎組和牙周健康組唾液P. gingivalis、MMP-8、TIMP-1水平及MMP-8/TIMP-1比值，分析生物標志物單獨或聯合應用對牙周炎的診斷效能。 結果 牙周炎組唾液P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值高于牙周健康組，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組TIMP-1水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。唾液P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/ TIMP-1比值與牙周臨床參數均呈正相關。P. gingivalis和MMP-8單獨對Ⅱ期及以上牙周炎的預測價值中等，MMP-8/TIMP-1比值單獨、P. gingivalis聯合MMP-8和P. gingivalis聯合MMP-8/TIMP-1比值對Ⅱ期及以上牙周炎的預測價值均較高。 結論 唾液P. gingivalis，MMP-8，尤其是MMP-8/TIMP-1比值及其聯合是檢測Ⅱ期及以上牙周炎的潛在候選，唾液生物標志物的聯合應用進一步提高了牙周診斷的準確性。

[關鍵詞] 牙周炎;唾液;牙齦卟啉單胞菌;基質金屬蛋白酶-8;金屬蛋白酶組織抑制劑-1

[中圖分類號] R781.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）28-0013-05

Correlation between salivary Porphyromonas gingivalis， MMP-8 and TIMP-1 levels and periodontitis

LI Mingxia1? ?XU Yu1? ?ZHU Feiran1? ?SONG Lin2? ?LI Hua2? ?LIU Ying1? ?ZHANG Zilu1? ?YANG Qiubo1

1.Beijing Institute of Dental Research， Capital Medical University School of Stomatology， Beijing? 100050， China; 2.Department of Periodontics， Beijing Stomatological Hospital， Capital Medical University， Beijing? ?100050， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between salivary biomarkers Porphyromonas gingivalis （P. gingivalis）， matrix metalloproteinase-8 （MMP-8）， and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 （TIMP-1） levels and periodontitis. Methods A total of 25 patients with periodontitis admitted to the Department of Periodontics of Beijing Stomatological Hospital， Capital Medical University from October 2020 to January 2021 were selected as the periodontitis group. Another 22 subjects of periodontal health in the hospital during the same period were selected as the periodontally healthy group. Periodontal clinical parameters were recorded in all study subjects. Unstimulated saliva was collected. Real-time quantitative PCR was performed to determine P. gingivalis level. MMP-8 and TIMP-1 levels were measured by ELISA. The levels of P. gingivalis， MMP-8 and TIMP-1 and MMP-8/TIMP-1 ratio in saliva were compared between the periodontitis and control groups， and the diagnostic power of biomarkers for periodontitis was analyzed. Results Salivary P. gingivalis， MMP-8 levels， and MMP-8/TIMP-1 ratio in the periodontitis group were higher than those in the periodontally healthy group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in TIMP-1 level between the two groups （P>0.05）. Salivary P. gingivalis， MMP-8 levels， and MMP-8/TIMP-1 ratio were positively correlated with periodontal clinical parameters. The predictive value of P. gingivalis and MMP-8 alone for stage Ⅱ and above periodontitis was moderate. The predictive value of MMP-8/TIMP-1 ratio alone， P. gingivalis combined with MMP-8， and P. gingivalis combined with MMP-8/TIMP-1 ratio for stage Ⅱ and above periodontitis was high. Conclusion Salivary P. gingivalis， MMP-8， especially MMP-8/TIMP-1 ratio， and their combinations are potential candidates for detecting stage Ⅱ and above periodontitis， and the combination of salivary biomarkers further improves the accuracy of periodontal diagnosis.

[Key words] Periodontitis; Saliva; Porphyromonas gingivalis; Matrix metalloproteinase-8; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

牙周炎是發生在牙齒支持組織（牙周組織）的疾病，如果不及時診斷和治療，會導致牙周軟組織和硬組織不可逆破壞，最終導致牙齒脫落[1]。牙周炎不僅是導致成年人牙齒喪失的主要原因，還與廣泛的系統性疾病有關[2]。目前牙周炎的診斷主要依靠牙周檢查，而傳統牙周檢查的準確性依賴于檢查者的臨床經驗，主觀性較強，通常需要牙周專科醫師完成。唾液作為無創，易取的一種生物液體，可反映口腔整體情況。研究已經揭示了識別和測定唾液中的生物標志物用于診斷牙周病及監測進展的潛力[3]。目前大多研究僅探究單一生物標志物與牙周炎的關系。然而，使用單一的唾液標志物來檢測牙周炎，受到疾病的偶發性和多因素特征的挑戰，敏感度和特異度較低，聯合使用唾液生物標志物會產生更可靠的結果[3-4]。與牙周炎相關的生物標志物根據其來源可分為微生物源性和宿主源性。在關于牙周病的微生物病因研究中，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）被認為是牙周炎的關鍵病原體[5]。多項研究證實，唾液中P. gingivalis水平與牙周炎相關[6-7]。而牙周組織的降解主要是由炎癥過程中宿主釋放的酶引起的，特別是細胞外基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）[8]。其中，MMP-8被報道為牙周病的主要金屬蛋白酶，多項研究證明其與牙周病的嚴重程度有關，高水平存在于齦溝液和唾液中[8-10]。金屬蛋白酶組織抑制劑-1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMPs的主要抑制劑，分布廣泛，精確調控MMPs的活性和功能[11]，MMP/TIMP比值往往決定細胞外基質蛋白降解的程度。因此本研究提出，將微生物來源的P. gingivalis和宿主來源的MMP-8及TIMP-1聯合應用分析其與牙周炎的關系，為牙周炎生物標志物的聯合應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月至2021年1月首都醫科大學附屬北京口腔醫院牙周科收治的牙周炎患者25例作為牙周炎組，另外同期該院牙周健康者22名作為牙周健康組，根據2018年最新牙周病與植體周病新分類診斷標準[12]。牙周炎（Ⅱ期及以上）組納入標準：①鄰間最嚴重位點臨床附著喪失（Clinical attachment loss，CAL）≥3 mm，伴有探診深度（Probing depth，PD）≥5 mm，影像學骨喪失至少大于牙根全長15%;②患者知情同意并簽署知情同意書。牙周健康組納入標準：①完整牙周組織的牙齦健康，PD≤3 mm且探診出血（Bleeding on probing，BOP）<10%，無附著喪失位點，無牙槽骨破壞影像學征象，無牙周炎病史;②患者知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①年齡<18歲，無自主決定能力者;②有吸煙史者;③有相關系統性疾病或狀況者，如糖尿病;④3個月內服用過抗生素或抗炎藥物者;⑤12個月內接受過牙周治療者;⑥備孕、妊娠或哺乳期女性;⑦口內余留牙少于20顆者;⑧存在唾液過少相關疾病者，如干燥綜合征。記錄所有研究對象牙周臨床參數，包括菌斑指數（Plaque index，PLI）、PD、CAL、BOP及牙齦指數（Gingival index，GI）。本研究已通過首都醫科大學附屬北京口腔醫院醫學倫理委員會審查（CMUSH-IRB-KJ-PJ-2020-16）批準。

1.2 試劑與設備

1.2.1 主要試劑? 細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、引物和質粒（生工生物工程股份有限公司）、PowerUp SYBR Green Master Mix（美國Thermo SCIENTIFIC），人總MMP-8和人TIMP-1 ELISA試劑盒（美國R&D公司）。

1.2.2 主要設備? 臺式高速冷凍離心機和NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計（美國Thermo SCIENTIFIC）、SpectraMax Paradigm多功能酶標儀（美國Molecular Devices）和CFX熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 牙周臨床參數記錄? 記錄所有研究對象牙周臨床參數，包括PLI、PD、CAL、BOP及GI。PLI計分標準：0=齦緣區無菌斑;1=齦緣區的牙面有薄的菌斑，但視診不易見，若用探針尖的側面可刮出菌斑;2=在齦緣或鄰面可見中等量菌斑;3=齦溝內或齦緣區及鄰面有大量軟垢。PD是指齦緣至袋底的距離。CAL是指釉牙骨質界至袋底的距離。BOP是根據探診后15 s牙齦有無出血，記為BOP陽性或陰性。GI計分標準：0=正常牙齦;1=牙齦略有水腫，探針探之不出血;2=牙齦水腫并探診出血;3=牙齦有自發出血傾向或潰瘍。

1.3.2 樣本采集? 采集所有受試者無刺激性唾液樣本，過程如下：2 h禁食、禁水，自來水輕輕漱口，然后取坐位，稍低頭，讓唾液在口腔底部聚集，從口角被動地流入10 mL的無菌離心管內。若唾液中有血液或食物殘渣則棄用該樣本，重新取樣。每管200 μL唾液樣本分裝，10 000×g，4℃離心5 min，收集上清和沉淀，分別于-20℃儲存。

1.3.3 實時定量PCR測定P. gingivalis水平? ①提取細菌DNA：使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取唾液沉淀細菌DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行。紫外分光光度計檢測DNA濃度與純度，A260/A280比值應為1.7～1.9，提取DNA于-20℃儲存。②質粒標準品制備：選取質粒作為標準品，質粒基因序列選取GenBank L16492.1 P. gingivalis ATCC 33277 16S核糖體RNA基因部分序列，測序結果與 GenBank 上提交的序列進行比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。利用紫外分光光度計測A260計算標準質粒的質量濃度，依據以下公式計算：質粒DNA濃度（copies/μL）=質粒濃度（ng/μL）/質粒分子量×NA;質粒分子量=（載體堿基數+插入片段）×2×堿基平均分子量（324.5 g/mol）。NA為阿伏伽德羅常數，其值為6.02×1023 copies/mol。將質粒10倍比稀釋為103～108 copies/μL，制作標準曲線。③實時定量PCR：參照Yang等[13]設計P. gingivalis引物，正向引物：5'-ACTGTCTTCCTTC-ACGCGACTT-3'，反向引物：5'-GGAGGCAGCAGTG-AGGAATATT-3'，擴增長度為72 bp。PCR反應體系的組成：2.0 μL引物，10.0 μL PowerUp SYBR Green Master Mix，2.0 μL 模板DNA，6.0 μL ddH2O，總體積為20.0 μL。PCR反應條件：50℃ UDG酶激活 2 min，95℃ 預變性2 min，40個循環（95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min）。根據標準曲線計算樣本中P. gingivalis濃度。

1.3.4 ELISA測定MMP-8及TIMP-1水平? 使用MMP-8及TIMP-1 ELISA試劑盒檢測唾液上清中MMP-8及TIMP-1水平，操作步驟按照試劑盒說明書進行。在5 min內測定每孔的光密度，酶標儀測定波長設置為450 nm，校正波長設置為540 nm。使用試劑盒提供的標準品構建標準曲線，根據標準曲線計算濃度，再乘以稀釋倍數即為樣本實際濃度。并計算MMP-8/TIMP-1比值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以中位數[M（P25，P75）]表示，各組間數據的比較采用Mann-Whitney U檢驗，采用Spearman 秩相關分析之間的相關性，采用Logistic回歸分析和受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線評價唾液生物標志物與牙周炎的關系，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組牙周臨床參數比較

牙周炎組牙周臨床參數PLI、PD、CAL、BOP陽性率及GI均高于牙周健康組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組唾液生物標志物水平比較

牙周炎組P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/ TIMP-1比值高于牙周健康組，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組TIMP-1水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 唾液生物標志物水平與牙周臨床參數的相關性

通過Spearman 秩相關分析，P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/ TIMP-1比值與牙周各臨床參數之間均呈正相關，其中MMP-8/ TIMP-1比值與牙周各臨床參數之間相關性最強。見表3。

2.4 唾液MMP-8水平、MMP-8/TIMP-1比值與P. gingivalis的相關性

通過Spearman 秩相關分析，MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值與P. gingivalis呈正相關。見表4。

2.5 唾液生物標志物在牙周炎中的診斷效能

ROC曲線，又稱為感受性曲線，是反映敏感度和特異度連續變量的綜合指標，其是根據一系列不同的二分類方式（分界值或決定閾），以敏感度為縱坐標，1-特異度為橫坐標繪制的曲線。見封三圖1～2。

ROC曲線可直觀地比較兩種或兩種以上不同診斷試驗對疾病的識別能力，也可通過ROC曲線下面積（Area under curve，AUC）進行比較。AUC是指ROC曲線下與坐標軸圍成的面積，通常介于0.5～1之間，AUC越大，診斷準確性越高。統計學上一般認為，AUC≤0.7，表示預測價值較低;AUC為0.7～0.9，表示預測價值中等;AUC>0.9，可認為預測價值較高。可知，P. gingivalis和MMP-8水平單獨對Ⅱ期及以上牙周炎的預測價值中等，MMP-8/TIMP-1比值單獨、P. gingivalis聯合MMP-8水平和P. gingivalis聯合MMP-8/TIMP-1比值對Ⅱ期及以上牙周炎的預測價值均較高。其中，P. gingivalis聯合MMP-8/TIMP-1比值對Ⅱ期及以上牙周炎的預測價值最高。使用約登指數（靈敏度和特異度之和減去1）為每個生物標志物獲得區分牙周健康和牙周炎的最佳截點，即臨界值，并求出相應的敏感度和特異度。可知，相較于其他唾液生物標志物，綜合考慮敏感度和特異度時，P. gingivalis聯合MMP-8/TIMP-1比值的臨界值取5.804時，診斷Ⅱ期及以上牙周炎的敏感度和特異性最好，分別為0.880和0.818。見表5。

3 討論

生物標志物是一項經客觀測量能夠反映人體內生理或病理過程改變的代表性指標，其所提供的信息在疾病預測、診斷、預后判斷、療效評價和疾病監測等方面具有重要價值。大量研究證實，唾液中檢測到的特定細菌或宿主來源的生物標志物可表明牙周炎的存在、進展或緩解。研究者提出，在唾液中同時檢測微生物來源和宿主來源的生物標志物可以大大提高牙周診斷的準確性[4]。因此，本研究將聯合應用微生物來源和宿主來源的目前最有用或最有效的生物標志物，分析其對牙周炎的診斷效能，為牙周炎生物標志物的聯合應用提供依據。

本研究結果顯示，牙周炎患者唾液中P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值高于牙周健康組，差異有統計學意義（P<0.05），且與牙周臨床參數呈正相關。O'Brien-Simpson等[6]證實，唾液中P. gingivalis水平與牙周臨床參數呈正相關，且與齦下菌斑中P. gingivalis水平相關。Zhang等[14]研究者表示，牙周炎患者唾液MMP-8水平明顯高于牙周健康組，可作為牙周炎的生物標志物。Gursoy等[15]研究表明，唾液MMP-8水平，特別是MMP-8/TIMP-1比值是晚期牙周炎的潛在檢測對象，而且在吸煙牙周炎和牙周健康組中仍存在差異。研究還發現，牙周炎患者MMP-8水平在牙周非手術治療后降低[16-17]，持續升高的MMP-8濃度可能表明傳統牙周治療反應不良的患者[17]。可知，上述研究與本研究結果一致，均證實唾液P. gingivalis、MMP-8水平及MMP-8/TIMP-1比值可為牙周炎的候選生物標志物。

本研究表明，相對于生物標志物P. gingivalis和MMP-8水平，MMP-8/TIMP-1比值、P. gingivalis聯合MMP-8水平和P. gingivalis聯合MMP-8/TIMP-1比值對牙周炎的預測價值較高。Salminen等[18]研究了唾液四種主要牙周病原體在牙周炎診斷中的價值，發現與四種病原菌單獨分析相比，病原菌組合與牙周炎的相關性更強。Gursoy等[15]研究者證實，唾液MMP-8，TIMP-1，Ⅰ型膠原羧基端吡啶并啉交聯肽，特別是它們的比值和組合是檢測晚期牙周炎的潛在候選生物標志物。Gursoy等[19]研究小組聯合應用P. gingivalis、白細胞介素-1β和MMP-8開發了一種累積風險評分的診斷方法，結果表明該方法在檢測牙周炎中為單一生物標志物的固定閾值帶來了額外的能力。這些研究均證實，牙周炎唾液生物標志物的聯合應用提高了對牙周炎的診斷能力。

雖然ROC曲線分析在生物標志物研究中常用，但選擇的臨界值的診斷能力高度依賴于測量的生物標志物的濃度范圍和研究人群中疾病的患病率[19]。因此，本研究后期應加大樣本量，在大樣本研究中驗證臨界值的診斷能力。研究提出，當考慮在牙周病的個性化模型中使用唾液的可能性時，應該在多個層次上進行，包括篩查、疾病檢測、治療結果監測和難治性或進展性病例的識別[8]。因此，本研究后續也應開展縱向研究，探討唾液生物標志物水平變化與牙周炎進展及治療預后的關系，為牙周炎唾液生物標志物的應用提供更多依據。

綜上所述，在目前的研究范圍內，可以得出結論，唾液P. gingivalis，MMP-8，尤其是MMP-8/TIMP-1比值及其聯合是檢測Ⅱ期及以上牙周炎的潛在候選，唾液標志物的聯合應用進一步提高了牙周診斷的準確性。

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（收稿日期：2021-04-12）