改良激光輔助孵化技術在解凍移植（FET）周期中的應用

江旺航 吳成亮 蘇占營 辜敏

[摘要] 目的 探討改良激光輔助孵化技術（LAH）對凍融胚胎（D3、D5、D6）臨床結局的影響。 方法 回顧性分析2019年1月至2020年12月在本生殖中心實施玻璃化凍融胚胎移植的患者共計786例，其中進行改良激光輔助孵化LAH 338例，傳統激光輔助孵化（LAH）448例。觀察兩組受精胚胎的復蘇率、胚胎植入率、臨床妊娠率、早期流產率、異位妊娠率等臨床指標。 結果 兩組胚胎復蘇率、胚胎植入率、臨床妊娠率、早期流產率、異位妊娠率分別為100.00%和99.32%、49.35%和42.34%、62.43%和57.81%、9.48%和17.76%、1.42%和2.70%;改良LAH組的胚胎植入率、臨床妊娠率、早期流產率、異位妊娠率和傳統LAH組相比較，差異有統計學意義（P<0.05），胚胎復蘇率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;改良LAH組中的囊胚（D5、D6）組臨床妊娠率、胚胎植入率與D3胚胎組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;囊胚（D5、D6）早期流產率、異位妊娠率與D3胚胎組相比較，差異有統計學意義（P<0.05）;兩組的胚胎復蘇率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 改良激光輔助孵化技術比傳統激光輔助孵化技術對凍融胚胎（D3、D5、D6）在臨床結局上有一定的優化作用。

[關鍵詞] 改良激光鐳射;輔助孵化;凍融胚胎;臨床結局

[中圖分類號] R714.8? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）28-0083-05

Application of modified laser-assisted hatching technique in frozen-thawed embryo transfer （FET） cycle

JIANG Wanghang? ?WU Chengliang? ?SU Zhanying? ?GU Min

Department of Assisted Reproduction， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang City， Childrens' Hospital of Jiujiang City in Jiangxi Province， Jiujiang? 332000， China

[Abstract] Objective To explore the impact of modified laser-assisted hatching （LAH） technique on the clinical outcome of frozen-thawed embryos （D3， D5， D6）. Methods A total of 786 patients who underwent vitrification freeze-thaw embryo transfer in our reproductive center from January 2019 to December 2020 were retrospectively analyzed， including 338 cases of modified LAH and 448 cases of traditional LAH. The clinical indicators such as resuscitation rate， embryo implantation rate， clinical pregnancy rate， early miscarriage rate， and ectopic pregnancy rate of the fertilized embryos in the two groups were observed. Results The embryo resuscitation rates， embryo implantation rates， clinical pregnancy rates， early miscarriage rates， and ectopic pregnancy rates in the two groups were respectively 100.00% and 99.32%， 49.35% and 42.34%， 62.43% and 57.81%， 9.48% and 17.76%， 1.42% and 2.70%. The embryo implantation rates， clinical pregnancy rates， early miscarriage rates， and ectopic pregnancy rates in the modified LAH group showed differences with statistical significance （P<0.05） than the traditional LAH group， and there was no significant difference in the rates of embryo resuscitation（P>0.05）. The clinical pregnancy rates and embryo implantation rates of the blastocyst （D5， D6） group in the modified LAH group had statistically significant differences （P<0.05） than the D3 embryo group. The early miscarriage rates and ectopic pregnancy rates of the blastocyst （D5， D6） showed differences with statistical significance （P<0.05） than the D3 embryo group. The difference in embryo resuscitation rates between these two groups was not significant， without statistical significance （P>0.05）. Conclusion The improved laser-assisted incubation （LAH） technique was better than the traditional laser-assisted incubation technique in optimizing the clinical outcome of freeze-thaw embryos （D3， D5， D6）.

[Key words] Modified laser; Assisted hatching; Frozen-thawed embryo; Clinical outcome

透明帶是一種包裹在人類卵母細胞和早期胚胎周圍的由糖蛋白、碳水化合物和透明帶特種蛋白構成13～15 μm厚非細胞結構。透明帶有兩層的，外層稍厚，內層薄而有彈性。透明帶在著床前參與精子頂體反應并促進精子卵子融合，防止多精子受精以維護早期胚胎的三維結構，形成保護屏障。人類在內的大多數哺乳動物胚胎，發育至囊胚階段后，透明帶因囊胚腔擴張逐漸變薄，這一過程叫自然孵化。囊胚先從透明帶中釋放再進入宮腔，以使滋養外胚層細胞與子宮內膜細胞接觸，從而著床。胚胎和子宮共同作用使透明帶在宮腔中消失。一些學者可以觀察到哺乳動物囊胚孵化前的擴張和透明帶變薄及人類囊胚的體外培養中，孵化階段透明帶還會發生周期性的收縮和膨脹，這樣使囊胚擴張和透明帶糖蛋白的張力形成，經過多次周期性的收縮膨脹，透明帶厚度逐漸變薄，直至破裂。滋養層細胞從透明帶破裂口延伸突出，最終整個囊胚孵出于透明帶外，胚胎定位，著床、植入于子宮內膜。胚胎先要能順利孵出，才能在子宮內膜上著床。胚胎在體外培養過程中可能會缺少細胞溶解素等物質，從而導致透明帶變硬，滋養層細胞可以分泌溶解素，使透明帶可以變軟容易破口。Sehiewe等[1]證實過胚胎在體外培養環境中，溶解素的數量會減少，而且質量會變差，從而會導致囊胚很難從透明袋中孵出，從而無法在內膜上著床。Manna等[2]通過評估透明帶消失的時間，也證實胚胎在體外培養透明帶會硬化從而阻礙胚胎孵出或延長囊胚擴張時間，缺少子宮分泌的溶解透明帶物質，也可導致胚胎很難孵出。在體外授精（IVF）過程中，隨著女性年齡增加、卵泡刺激素（FSH）水平升高都可以導致胚胎透明帶加厚或者畸形，也會使胚胎在子宮環境下孵出困難。Wood[3]認為胚胎在冷凍過程中容易受到損傷進而可能會減弱其著床的能力;而且冷凍復蘇過程也增加了透明帶在囊胚孵出過程中的阻力，使囊胚很難孵出，采用輔助孵化（Assisted hatching，AH）可優化早期卵裂胚胎和囊胚[4]的擴張和孵出，從而提高其臨床的各項指標。

輔助孵化激光法（Laserassisted hatching，LAH）是各種輔助孵化技術[5]中的一種，相對于其他輔助孵化技術更簡便、快速、安全[6]，目前大多數生殖中心采用LAH將新鮮胚胎和凍融胚胎的透明帶進行削薄或開口化處理，以望改善其移植后的臨床結局[7]。我中心將傳統的LAH進行改良，經過改良激光輔助孵化技術在進行孵化時，處理的范圍更大，更符合胚胎著床的生理過程，同時切除透明帶的部位更大（<1/4），不會在孵出中產生嵌頓，而且選擇在解凍第二步（細胞仍處于皺縮期）開始激光孵化，不直接接觸透明帶內的細胞，可以最大程度上避免對細胞的熱損傷，接觸透明帶的位置、切除厚度、作用時間等均優于薄化和打小孔。本研究將改良激光輔助孵化技術運用于解凍移植周期中，使凍融胚胎的胚胎植入率和臨床妊娠率提高并且降低異位妊娠率、流產率，對促進試管嬰兒成功率的提高具有一定的臨床意義[8]，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2020年12月在我院生殖醫學中心施行解凍移植周期的患者作為研究對象（共786個周期），納入標準[9]：①年齡<40歲;②施行IVF-ET技術的周期，胚胎發育為D3、D5、D6[10]三期的胚胎;③D5、D6囊胚優胚率（4BB級別以上包括4BB）和D3優胚率（卵裂球數≥7個，碎片率<25%）標準不一樣，三期胚胎優胚率均達到85%以上。排除標準[11-16]：①染色體異常者;②生殖系統畸形者;③輸卵管積水者;④子宮內膜薄者;⑤子宮內膜異位癥者;⑥5期和6期冷凍囊胚者;⑦因胚胎的優劣而影響臨床結局者。根據患者知情同意后進行改良激光輔助孵化技術分為改良LAH組338個周期和傳統LAH組448個周期。

1.2 方法

1.2.1 促排卵和IVF-ET? 采用常規方法進行促排卵、取卵、體外受精和胚胎培養，采用的試劑為瑞典Vitrolife系的G1和G2。胚胎質量評估內容有卵裂球的數目、碎片百分比、大小均勻度及發育速度。D3期移植1～2枚胚胎，移植后剩余的胚胎再經過患者知情同意后，將其冷凍保存或繼續培養成D5/D6期的囊胚再冷凍保存起來。將自然周期或激素替代周期作為FET子宮內膜的準備方案，囊胚評分采用Gardner評分標準，其詳細內容如下[17]。根據囊胚腔的大小和是否孵化將囊胚的發育分為6個時期：1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2;2期：囊胚腔體積≥胚胎總體積的1/2;3期：完全擴張囊胚，囊胚腔完全占據了胚胎的總體積;4期：擴張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄;5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出;6期：孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。處于3～6期的囊胚內細胞團質量分級：A級：細胞數目多，排列緊密;B級：細胞數目少，排列松散;C級：細胞數目很少。3～6期的囊胚滋養層細胞分級：A級：上皮細胞層由較多的細胞組成，結構致密;B級：上皮細胞層由不多的細胞組成，結構松散;C級：上皮細胞層由稀疏的細胞組成。

1.2.2 兩組激光破膜設備和參數? 本中心采用激光破膜儀為Research instrument（Saturn Active），激光功率為300 mW，脈沖寬度為0.001～2.000 ms。在高倍顯微鏡下尋找胚胎，再切換激光物鏡下，電腦鼠標控制位置，科學調整激光發射時間。傳統激光輔助孵化在透明帶打孔薄化和打孔，激光半徑為3.8 μm，脈沖寬度為 0.158 ms;改良激光輔助孵化主要是消除<1/4透明帶（包含冷凍前激光皺縮時透明帶開孔處），激光半徑為 9.7 μm，脈沖寬度為0.405 ms。

1.2.3 玻璃化冷凍和試劑? 囊胚在冷凍前要進行激光法，人工在透明帶打孔皺縮，等到囊腔快完全皺縮后再冷凍。采用的試劑為日本加藤VT101玻璃化冷凍試劑盒，在室溫25℃左右先將胚胎轉移至平衡（ES）液，卵裂球和囊胚分別在ES液中的平衡時間為5～6 min和7～8 min。再將胚胎轉移至玻璃化（VS）液，在60 s內將胚胎裝載到日本加藤Cryotop冷凍載桿上，最后投入液氮中保存。

1.2.4 玻璃化冷凍胚胎的解凍和試劑? 解凍采用的試劑是日本加藤VT102玻璃化解凍試劑盒，將裝載有凍胎的載桿放入事先在37℃預溫的解凍液WS1中停留1 min，轉入WS2液中停留3 min，再依次轉移胚胎至解凍液WS3、WS4液各停留5 min，最后將胚胎轉入已經平衡好的囊胚培養液G2（Vitrolife系列，瑞典）中。胚胎復蘇的標準為解凍后胚胎復蘇的細胞數≥50%總細胞數。

1.2.5 傳統激光輔助孵化及胚胎移植和試劑? 卵裂期胚胎在解凍復蘇完成轉入囊胚培養液G2（Vitrolife系列，瑞典）皿后，進行激光法人工在透明帶打孔薄化和打孔，囊胚在冷凍前要進行激光法人工在透明帶打孔皺縮，復蘇后不進行激光處理。孵化后用含10%人血清蛋白的囊胚培養液G2（Vitrolife系列，瑞典）洗滌數次，移入囊胚培養液，待培養2～3 h后再移植。移植胚胎后給予黃體支持，移植后14 d查驗血HCG，移植后28 d B超檢查見孕囊為臨床妊娠。

1.2.6 改良激光鐳射輔助孵化及胚胎移植和試劑? 卵裂期胚胎、5期以下囊胚在解凍第二步（此時囊胚未完全擴張）立即行改良激光輔助孵化技術，在相對較大或碎片較多的卵周間隙區域，采用非接觸式的激光顯微操作系統RI（Saturn Active），調整其激光靶心定位于該處的透明帶，點擊激光切換成連續發射鍵模式，連續發射激光削除<1/4透明帶（包含冷凍前激光皺縮時透明帶開孔處），保證中心部位完全穿破透明帶。整個輔助孵化過程在30 s內完成。孵化后用含10%人血清蛋白的囊胚培養液G2（Vitrolife系列，瑞典）洗滌數次，移入囊胚培養液，待培養2～3 h后再移植。移植胚胎后給予黃體支持，移植后14 d查驗血HCG，移植后28 d B超檢查見孕囊為臨床妊娠。

1.3觀察指標及評價標準

胚胎移植14 d后進行HCG檢測，移植后28 d行B超監測，觀察到孕囊為臨床妊娠。12周前發生的胚胎停育為早期流產，統計中觀察到胎心搏動孕囊數目即種植胚胎數目同移植胚胎數目的比例為胚胎種植率;臨床妊娠患者數目同進行胚胎移植患者數目的比例為臨床妊娠率;早期流產數目同妊娠患者數目比例為早期流產率。異位妊娠是指孕囊著床位置于子宮體腔外，其中包括宮外妊娠和宮內外同時妊娠。主要觀察這些胚胎復蘇率、胚胎植入率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產率等臨床指標。復蘇（胚胎存活）率=復蘇胚胎存活數/復蘇胚胎總數×100%。臨床妊娠率=凍融臨床妊娠周期數/凍融移植周期數×100%。胚胎植入率（著床率）=孕囊數/凍融總移植周期數×100%。早期流產率=孕12周內自然流產周期數/凍融臨床妊娠周期數×100%。異位妊娠率=異位妊娠周期數/凍融臨床妊娠周期數×100%。

1.4統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組臨床結局比較

通過比較改良LAH組338例和傳統LAH組448例的周期結果，再對周期結果統計分析發現，兩組年齡、不孕年限、不孕類型、內膜厚度、移植胚胎數、胚胎復蘇率比較，差異無統計學意義（P>0.05），改良LAH組在臨床妊娠率、胚胎植入率上數值均高于傳統LAH組（57.81%，42.34%），且早期流產率、異位妊娠率要低于傳統LAH組（17.76%，2.70%），兩組胚胎植入率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產率比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2改良LAH組中D3、D5、D6的各項臨床指標比較

改良LAH組中D3，D5，D6的年齡、不孕年限、不孕類型、內膜厚度、移植胚胎數、胚胎優胚率，胚胎復蘇率比較，差異無統計學意義（P>0.05），改良LAH組中的囊胚（D5、D6）組臨床妊娠率、胚胎植入率與D3胚胎組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;囊胚（D5、D6）組的異位妊娠率、流產率與D3胚胎組的比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3討論

AH是在20世紀90年代得到應用。激光輔助孵化具有定位準確、操作時間短、胚胎暴露于體外時間短、可重復使用、無須昂貴的操作儀器等優勢，可有效降低輔助生殖周期成本，與其他孵化方式相比，是一個相對安全、有效的選擇。理論上將AH應用于解凍移植（FET）可以提高FET中凍融胚胎的臨床效果[18]。馮清等[19]首先在卵裂胚胎上采用AH技術，從而展開AH的臨床實踐研究。也有學者經研究表明，采用AH技術顯著提高臨床妊娠率[20]。還有研究表明，凍融復蘇周期、高齡、高FSH、胚胎透明帶異常是AH的常見適應證[21-23]。雖然傳統LAH有以上諸多優點但傳統LAH有以下缺點：一傳統LAH開孔過大，卵裂球容易跑出透明帶，開孔過小容易發生卵裂球嵌頓;二激光光束過大，且激光時機不當，易損傷卵裂球。這兩點也會影響著床率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產率。改良LAH在透明帶上開孔的大小通常是30～40 μm，而且選擇在解凍第二步（細胞仍處于皺縮期）開始激光孵化，不直接接觸透明帶內的細胞，可以最大程度上避免對細胞的熱損傷[24]。

本研究中，兩組數據按激光打孔方式和時機不同分為傳統激光輔助孵化和改良激光輔助孵化兩組，兩組年齡，不孕年限，不孕類型，內膜厚度，移植胚胎，胚胎復蘇率等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），說明兩組的一般資料一致。而且研究中的冷凍解凍胚胎都是有兩名熟練掌握人類胚胎冷凍解凍臨床操作技術的胚胎師隨機完成的。操作人員對標準化操作規程和試劑使用、載桿使用熟練并嚴格執行，盡量消除研究過程中的由操作人員引起的試驗誤差。本研究結果顯示，改良LAH組在臨床妊娠率、胚胎植入率上數值均高于傳統LAH組（57.81%，42.34%），且早期流產率、異位妊娠率要低于傳統LAH組（17.76%，2.70%），兩組胚胎植入率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產率比較，差異有統計學意義（P<0.05），可能是改良LAH的熱損傷小，不易發生卵裂球嵌頓，從改良激光輔助孵化技術看要優于傳統激光輔助孵化技術，從而胚胎植入率高，臨床妊娠率也高，透明帶打孔直接將胚胎暴露于子宮環境，人為地干擾了胚胎的內環境，內膜和胚胎的分子交互可能會影響胚胎著床，改良LAH組在臨床妊娠率、胚胎植入率上數值均不同程度高于傳統LAH組，且流產率、異位妊娠率要低于傳統LAH組。

胚胎發育至囊胚階段后透明帶已經比卵裂胚更薄。故兩種激光輔助孵化方式對囊胚都能有效減少冷凍過程中透明帶變硬帶來的阻力。這兩種激光孵化方式的作用效果可能被囊胚的高著床率和高妊娠率的特點掩蓋而無明顯差異。如果后續再統計傳統激光輔助孵化的D3，D5，D6分組，可能還會得知主要差距是在D3這組里。本研究顯示，改良LAH組D3，D5，D6在年齡、不孕年限、不孕類型、內膜厚度、移植胚胎數、胚胎復蘇率上比較，差異無統計學意義（P>0.05），其中改良LAH組中的D3臨床妊娠率和胚胎植入率均低于D5和D6的，且異位妊娠率和早期流產率都偏高于D5和D6的。

本研究也有局限性：一作為回顧性研究，在患者選擇上有一定隨機性，二兩組時間跨度比較大，樣本量相差也比較大，三部分患者還在待孕狀態，無法統計總流產率和活產率，在后期追蹤活產率等臨床數據，再進行兩組中的D3、D5、D6分別比較。

綜上所述，改良LAH組在臨床結局上要優于傳統LAH組，并且在改良LAH組中，D5和D6胚胎的臨床結局均優于D3胚胎的臨床結局。

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（收稿日期：2021-04-07）