復(fù)方大黃素黃芩素及其拆方對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎的治療作用*

周蕊 張健 黃娜 陳海燕 譚婷 朱建宏 張愛(ài)軍 楊軍 李君 李宗芳

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1.生物診斷治療國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心；2.干部病房普通外科，陜西 西安 710004)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis, SAP)并發(fā)癥多，危及患者生命[1-4]。SAP中醫(yī)病機(jī)為濕熱蘊(yùn)結(jié)、血瘀血熱、腑實(shí)不通[5-6]。清胰湯是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療SAP的經(jīng)典方劑，由大黃、柴胡、白芍、黃芩、黃連等多味中藥組成，已被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院的臨床實(shí)踐[7-9]。應(yīng)用清胰湯通里攻下，活血化瘀，在大量動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)均得到良好療效[10-13]，可有效控制SAP時(shí)的全身炎癥反應(yīng)，減輕SAP對(duì)機(jī)體造成的損害，保護(hù)各臟器功能，降低死亡率[14-15]。本課題組前期依據(jù)中醫(yī)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論、中藥配伍原則，對(duì)清胰湯進(jìn)行了精煉，篩選出君藥大黃及臣藥黃芩的有效成分大黃素、黃芩素，首次提出復(fù)方大黃素黃芩素配方(已獲國(guó)家發(fā)明專利，專利號(hào)：ZL200310105814.3)，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)大鼠SAP有很好的治療作用，且與生長(zhǎng)抑素類似物善得定療效相似[16]，同時(shí)對(duì)復(fù)方大黃素黃芩素中大黃素、黃芩素最佳組方配比進(jìn)行了探討[17]。但大黃素、黃芩素的交互作用(協(xié)同、相加、拮抗)及組方的合理性尚未可知。本研究采用拆方研究的方法，對(duì)此進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 50i型正置顯微鏡(日本Nikon)，EG1150型石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica)，RM2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)，HI1220型烤片機(jī)(德國(guó)Leica)，cobasc311型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Roche)。大黃素購(gòu)自西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：XC100321，含量>98.15%，黃芩素購(gòu)自西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：XC100312，含量>98.14%，牛磺膽酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：BCBG6336V，含量>97.0%，臨用前用注射用水配成5%水溶液，0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾。SPF級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠120只，體質(zhì)量210～230 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(陜2007-003)。本文涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)XJTULAC2017-764。

1.2 拆方設(shè)計(jì) SPF級(jí)雄性SD大鼠120只，采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉的方法制備SAP模型[18]96只，隨機(jī)分為8組；另選正常大鼠24只作為對(duì)照，再分為正常組、假手術(shù)組，每組均12只。8組SAP模型具體用藥情況如下：?jiǎn)渭僑AP模型組(不用藥物)、A組(大黃素3.2 mg/kg)、2A組(大黃素6.4 mg/kg)、B組(黃芩素7 mg/kg)、2B組(黃芩素14 mg/kg)、1/2AB組(大黃素1.6 mg/kg+黃芩素3.5 mg/kg)、AB組(大黃素3.2 mg/kg+黃芩素7 mg/kg)、2AB組(大黃素6.4 mg/kg+黃芩素14 mg/kg)，正常組(不做任何處理)，假手術(shù)組(開腹后僅翻動(dòng)十二指腸、胰腺后關(guān)腹)。各組干預(yù)藥物均于模型復(fù)制后立即尾靜脈注射(藥物溶液2 mL/kg)，正常組、假手術(shù)組、單純SAP組尾靜脈注射等量生理鹽水。12 h后各組大鼠腹腔注射麻醉后，開胸，右心室取血，3000 r/min低溫離心10 min，取上清液，由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科羅氏cobasc311全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ɑ-淀粉酶活性。同時(shí)收集胰腺組織，肉眼觀察胰腺組織大體形態(tài)，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切4 μm連續(xù)切片，行HE染色，顯微鏡下觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化。病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照 Schmidt 法(表1)[19]。依據(jù)上述胰腺組織病理學(xué)評(píng)分和血清α-淀粉酶活性結(jié)果作為療效評(píng)價(jià)指標(biāo)、判斷AB交互作用：若療效AB>2A，且AB>2B，則A、B協(xié)同；若AB>A或B，則A、B相加；若AB

表1 Schmidt胰腺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 一般情況 SAP組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、不好活動(dòng)、四肢皮溫較低等表現(xiàn)。各給藥組均有所改善。

2.2 病理組織學(xué)變化 肉眼可見(jiàn)，正常組和假手術(shù)組腹腔正常，胰腺組織為粉紅色，質(zhì)地柔軟，未見(jiàn)異常；單純SAP組可見(jiàn)胰腺明顯水腫，腹腔內(nèi)有大量血性或黃色渾濁腹水，大網(wǎng)膜、腸系膜、腹后壁、腸壁可見(jiàn)大量淺黃色皂化斑。各給藥組胰腺不同程度水腫，有的可見(jiàn)散在點(diǎn)狀褐色壞死區(qū)，有少量腹水，但明顯輕于單純SAP組。鏡下可見(jiàn)正常組和假手術(shù)組胰腺結(jié)構(gòu)正常，無(wú)葉間隔增寬；單純SAP組胰腺小葉間距增寬，腺泡細(xì)胞壞死，壞死區(qū)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；各給藥組胰腺組織病變均有不同程度減輕。與正常組相比，單純SAP組和各治療組病理學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.05)，各治療組均明顯低于單純SAP組(P<0.05)，AB組均明顯低于2A和2B組(P<0.05)。各復(fù)方(1/2AB、AB、2AB組)隨著劑量增加，胰腺組織病理學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)，呈顯著量效關(guān)系(圖1、2)。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

2.3 血清α-淀粉酶活性變化 與正常組相比，單純SAP組和各治療組血清α-淀粉酶活性均明顯升高(P<0.05)；各治療組均明顯低于單純SAP組(P<0.05)，AB組均明顯低于2A和2B組(P<0.05)，各復(fù)方組(1/2AB、AB、2AB組)之間血清α-淀粉酶活性之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖2 各組大鼠胰腺組織HE染色(100×)

圖3 各組大鼠血清α-淀粉酶活性

3 討論

復(fù)方是利用藥物相互作用來(lái)提高整體療效的常見(jiàn)制劑手段，復(fù)方藥物廣泛應(yīng)用于臨床[20-22]。配比試驗(yàn)及拆方分析是驗(yàn)證復(fù)方配伍合理性的重要考量方法[23-25]，因此也就成為對(duì)復(fù)方藥物進(jìn)行多因素多水平分析的必須步驟。復(fù)方大黃素黃芩素是課題組對(duì)SAP經(jīng)典方劑清胰湯進(jìn)行精煉，篩選出的配方。前期已經(jīng)完成的配比實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方大黃素黃芩素中大黃素是主藥，黃芩素是次藥[17]，最佳組方劑量為大黃素3.24 mg/kg和黃芩素7.12 mg/kg，大黃素、黃芩素的最佳劑量配比為1∶2.2。

拆方分析實(shí)施中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性與療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的正確選擇。我們以5%牛磺膽酸鈉逆行胰膽管注射制備的SAP大鼠為研究對(duì)象，根據(jù)拆方分析的原則設(shè)計(jì)各組干預(yù)藥物及動(dòng)物分組：選擇大黃素為陽(yáng)性對(duì)照藥，并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照藥單倍劑量大黃素組(A組)、陽(yáng)性對(duì)照藥2倍劑量大黃素組(2A組)、單倍劑量黃芩素組(B組)、2倍劑量黃芩素組(2B組)、復(fù)方低劑量組(1/2AB組)、復(fù)方中劑量組(AB組)、復(fù)方高劑量組(2AB組)，對(duì)復(fù)方大黃素黃芩素的二組分藥大黃素、黃芩素的交互作用性質(zhì)進(jìn)行分析。拆方分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將復(fù)方中的主組分藥大黃素作為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過(guò)設(shè)置不同劑量拆方組，分析與主藥大黃素相比復(fù)方藥物是否提高了療效(協(xié)同、相加)、是否不良反應(yīng)降低(拮抗)。按照拆方分析的實(shí)驗(yàn)要求，所有試驗(yàn)均可選用復(fù)方中的主組分藥大黃素作為陽(yáng)性對(duì)照藥，這種設(shè)計(jì)明顯減少了拆方分析的實(shí)驗(yàn)分組數(shù)，大大提高了試驗(yàn)效率[25]。

病理學(xué)為疾病的診斷、分類和確定治療方案以及為判斷疾病進(jìn)展、預(yù)后和療效提供了客觀依據(jù)，故本實(shí)驗(yàn)采用胰腺組織病理學(xué)變化作為評(píng)價(jià)SAP胰腺病變程度的主要指標(biāo)。α-淀粉酶也是用于SAP輔助診斷的常用實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，二者結(jié)合常用以評(píng)價(jià)SAP病情。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各治療組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分和血清α-淀粉酶活性均明顯低于單純SAP組，AB組均明顯低于2A和2B組(P<0.05)。1/2AB、AB、2AB組隨著藥物劑量增加，胰腺組織病理學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)，血清α-淀粉酶活性下降趨勢(shì)不明顯(P>0.05)。由于病理學(xué)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為復(fù)方大黃素黃芩素小、中、大劑量范圍內(nèi)存在顯著量效關(guān)系。

根據(jù)拆方分析判斷藥物相互作用關(guān)系(協(xié)同、相加、拮抗)的標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為，復(fù)方大黃素黃芩素的療效好于2倍劑量大黃素，也好于2倍劑量黃芩素。說(shuō)明組方中大黃素、黃芩素之間為協(xié)同作用，二者合用提高了復(fù)方的療效，為復(fù)方大黃素黃芩素組方的合理性提供了有利的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但是，復(fù)方大黃素黃芩素通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮作用，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

復(fù)方大黃素黃芩素治療SAP的療效好于2倍劑量大黃素，也好于2倍劑量黃芩素，組方中大黃素、黃芩素之間為協(xié)同作用，復(fù)方大黃素黃芩素組方合理，可用于SAP的治療研究。