金花菌發酵對蘭花香型漳平水仙茶的生化成分及抗氧化性的影響

許文璨，張戀芳，吳 雙，陳文君，王文鳳，王越悅，黃友誼，林細柳

（1.華中農業大學園藝林學學院，湖北 武漢 430070；2.福建省龍巖市農業農村局；3.龍巖市天淳茶葉研究所，福建 龍巖 364000）

漳平水仙茶產自福建省漳平市，外形為扁平四方塊，分為蘭花香型和桂花香型兩種[1]，是唯一緊壓的初加工烏龍茶[2]，其香氣清高悠長，滋味濃醇鮮爽，深受閩西、廈門、廣東和東南亞等地區消費者喜愛。金花菌是茯磚茶品質形成的關鍵微生物[3]，茶葉由金花菌發酵后降脂功能顯著提升[4]，抑菌活性和抗氧化活性等也有所提高[5]。因其獨特功能，金花菌已應用于發酵綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶、黃茶等茶類[6]，開發出的新產品受到了人們的歡迎。當前漳平水仙茶的發展存在產品種類單一、競爭大、經濟效益低等問題[7]，為此嘗試以金花菌發酵蘭花香型漳平水仙茶，為豐富漳平水仙茶產品提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種為華中農業大學茶學系茶葉加工與生物技術課題組從茯磚茶中篩選保存的優勢金花菌（E.cristatumHT1）。市售蘭花香型漳平水仙茶為2018年4月生產后放置一年多的產品。

兒茶素標品、沒食子酸標品和咖啡堿標品，均為色譜純，購于美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，甲酸為色譜純購自天津市科密歐化學試劑有限公司、色譜純甲醇購自 Thermo Fisher Scientific 公司，其它試劑均為分析純，為國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.2 金花菌菌種的制備

以馬鈴薯培養基（Potato dextrose agar，PDA）接種培養金花菌，于28℃下恒溫培養約一周。待金花菌的菌落上形成大量孢子粉時，將孢子粉刮落到無菌水中，振蕩5min，以3000r/min離心5min，取上清液，得孢子懸浮液。經計數，稀釋制成1×107cfu/mL孢子懸浮液。

1.3 金花漳平水仙茶的制備

取約20g蘭花香型漳平水仙茶裝入250mL發酵瓶，加入適量水，使茶葉含水量在40%左右，封口膜封口，以121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻后，每個發酵罐中加入2mL金花菌孢子懸浮液，混合均勻，然后置于28℃靜置發酵7d，最后在40℃環境下烘干。設置不接菌的對照組，同時將對照組也放置在同樣條件下一周，最后以40 ℃烘干。試驗設置3個重復。

1.4 金花漳平水仙茶的生化成分測定

水分測定采用快速法（GB/T 8304-2013）。茶多酚測定為福林酚法（GB/T 8313-2018）。游離氨基酸總量測定為茚三酮顯色法（GB/T8314-2013）。可溶性糖含量測定為蒽酮比色法[8]。水浸出物含量測定為減壓抽濾法（GB/T8305-2013）。茶色素的測定為系統分析法[9]。

沒食子酸、咖啡堿、兒茶素組分的測定采用高效液相色譜法（HPLC）：稱取0.3g茶粉于10mL離心管，加入5mL于70℃水浴的70%甲醇溶液，混勻，超聲波振蕩15min，然后在4℃下浸提12h。濾液過0.45μm濾膜，然后上樣進行HPLC測定。HPLC儀器型號：島津高效液相儀，色譜柱為安捷倫TC-C18（250mm×4.60 mm×0.45μm）。流動相A為0.1%甲酸，流動相B為100%甲醇。采用梯度洗脫，流動相B的濃度為：0-10 min（10%-20%），10-35min（20%-45%），35-45min（45%-45%）。流速為0.5mL/min，進樣量5μL，檢測波長278nm[10]。

1.5 金花漳平水仙茶的抗氧化活性測定

將發酵后的漳平水仙茶用粉碎機磨碎并過40目篩，然后稱取1.5g過篩茶粉，加入20mL沸蒸餾水于90℃水浴鍋中水浴浸提30min，每15min搖一次。待冷卻后，以3500r/min離心5min，將上清液以蒸餾水定容到25 mL容量瓶中，得待測樣品液。

1.5.1 清除羥自由基能力的測定（hydroxyl radical scavenging activity，HSA）

依次取4mmol/L的水楊酸-無水乙醇、FeSO4溶液、H2O2溶液及稀釋6倍的樣品液各1mL于離心管中，于37℃水浴反應30min，以3600r/min離心5min得上清液，于510nm處測定吸光值AX、AX0和A0（AX為樣品組吸光值；AX0為試劑空白吸光值，以蒸餾水代替H2O2；A0為樣品空白吸光值，是以蒸餾水代替樣品液）。清除率S（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100[11]。

1.5.2 總抗氧化能力的測定（ferric reducing ability of plasma，FRAP）

取3mL FRAP至試管中，于37℃中水浴預熱10min后，加入0.1mL的待測樣品液，反應30min，然后將其取出冷卻至室溫，以蒸餾水為對照，于595nm處測定其吸光值X。以0.2-2mmol/L FeSO4標準溶液代替樣品來測定，繪制標準曲線。標準曲線：C=0.4026*X+0.0008，R2=0.9993（C表示相當于硫酸亞鐵的濃度，單位g/L）。計算1g茶相當于硫酸亞鐵的mg量，單位%：M=C*25*d*10/m*m0（d為稀釋倍數，m為茶葉質量，m0為茶葉干物質量）[12]。

1.5.3 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性測定（DPPH free radical scavenging activity，DSA）

取0.1mL茶湯和3.9mL的0.15mmol/L DPPH溶液于試管中混合均勻，室溫避光條件下反應30min，于517nm測定吸光值AX、AX0和A0。（AX為樣品組吸光值；AX0為試劑空白吸光值，以95%乙醇代替DPPH溶液；A0為樣品空白吸光值，是以蒸餾水代替待測樣品液）。清除率S（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100[13]。

1.6 數據處理

數據經Excel 2019和SPSS 25處理，然后通過Origin 2019b軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 金花漳平水仙茶中水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖、沒食子酸含量

經金花菌發酵后，蘭花香型漳平水仙茶中水浸出物含量極顯著性增加（p ＜0.01），增加了11.44%。這說明經過金花菌發酵，可以將漳平水仙茶中非水溶性大分子物質部分分解成水溶性小分子物質，從而增加了水浸出物含量，有利于提高茶湯的口感，使其更加醇厚。而游離氨基酸的含量極顯著性降低（p＜0.01），降低了56.90%，這一結果與金花菌發酵綠茶[14]和金花菌發酵茶湯[15]的變化一致，可能與美拉德反應和金花菌在生長過程中利用氨基酸等相關[16]。

經過人工接種金花菌發酵后，蘭花香型漳平水仙的可溶性糖含量與對照組相比略有增加，這一結果與金花菌發酵藤茶、白茶類似[17,18]，而沒食子酸含量極顯著性增加（p＜0.01），增加了182.71%，這與用金花菌發酵普洱茶（熟茶）的結果一致[19]。

2.2 金花漳平水仙茶中茶多酚和咖啡堿含量

由圖1可知，經過金花菌發酵后，蘭花香型漳平水仙的茶多酚含量與對照組相比極顯著性降低（p＜0.01），降低了17.30%，可能是金花菌發酵使茶多酚氧化聚合[20]，這與金花菌發酵其它茶的結果類似[14,17,21-23]。茶多酚在茶葉中主要呈現澀的滋味特性[24]，經過金花菌發酵后含量顯著降低，可見能在一定程度上降低茶葉的澀味，改善茶葉的口感。而發酵前后咖啡堿含量分別為27.33g/kg和27.36g/kg，幾乎沒有變化，這一結果與金花菌發酵鐵觀音的結果一致[20]，可能是金花菌難以分解利用咖啡堿[22]。

2.3 金花漳平水仙茶中兒茶素組分

如圖2可知，漳平水仙茶經金花菌發酵后，沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）和表兒茶素（EC）等4種簡單兒茶素極顯著性增加（p＜0.01），分別增加了65.19%、80.23%、25.17%和77.49%，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）等4種酯型兒茶素極顯著性降低（p＜0.01），分別降低63.07%、77.02%、63.10%和69.41%，應該是金花菌在發酵過程中產生的酶將酯型兒茶素水解成了簡單兒茶素，而且酯型兒茶素是茶葉中重要的苦澀味物質[25]，可見金花菌發酵能降低茶葉的苦澀口感，有利于改善茶葉滋味。而鄒金美等人[20]的研究也發現鐵觀音經過金花菌發酵后，EGC、CE和C顯著性增加，而EGCG和ECG顯著性降低。

2.4 金花漳平水仙茶中茶色素含量

茶色素是茶葉中具有生物活性的一類氧化聚合物，有一定的保健功能[26]。由圖3可知，經過接種金花菌發酵，蘭花香型漳平水仙的茶黃素含量與對照組相比極顯著性降低（p＜0.01），降低了38.54%，這一結果與金花菌發酵綠茶類似[27]，而茶紅素含量與對照組相比有所降低但并不顯著（p＞0.05）。茶褐素有較高的生物學活性，其含量的增加使茶湯呈現褐色，同時它可能是發酵茶的主要呈味物質[14]。經過金花菌發酵后，蘭花香型漳平水仙的茶褐素含量增加了13.92%。在金花菌發酵黑茶茶湯中，發現初期兒茶素被酶氧化為茶黃素，而茶黃素繼續氧化聚合形成茶紅素和茶褐素[28]。鄒金美等[20]人用金花菌發酵鐵觀音發現，發酵茶中的茶紅素和茶褐素含量均顯著增加，而茶黃素減少。這些可能是金花菌在生長的過程中分泌了氧化酚類的酶，促使茶葉中的酚類物質氧化成茶黃素，然后使茶黃素繼續氧化成茶紅素和茶褐素[6,29]。

2.5 金花漳平水仙茶的抗氧化能力

2.5.1 清除羥自由基活性。由圖4可知，蘭花香型漳平水仙茶經過金花菌發酵后，其清除羥自由基能力有所提高，提高了12.84%（p＞0.05），這一結果與金花菌發酵普洱茶類似[4]。

2.5.2 總抗氧化活性。由圖4可知，蘭花香型漳平水仙經過人工接種金花菌發酵后，其總抗氧化活性與對照組相比極顯著性增加（p＜0.01），增加123.30%，這一結果與金花菌發酵普洱茶和甜茶類似[4,30]。由此可見，人工接種金花菌發酵漳平水仙能有效提高茶葉的總抗氧化活性。

2.5.3 DPPH自由基清除活性。由圖4可知，在DPPH自由基清除活性方面，接種金花菌的蘭花香型漳平水仙與對照組相比，其清除活性極顯著性降低（p＜0.01），降低了20.39%，這與陳皓睿等[15]用前期從六堡茶中篩選并鑒定的三株金花菌發酵茶葉和朱雯等[30]用金花菌發酵甜茶的結果類似。

2.6 金花漳平水仙茶中生化成分與抗氧化活性的相關性

為了解蘭花香型漳平水仙茶中內含成分與抗氧化活性之間的關系，進一步進行了相關性分析。由圖5可知，DPPH自由基清除活性（DSA）與茶多酚、CG、ECG和EGCG的含量呈顯著正相關（p＜0.05），這與周琦等研究不同品種花茶的抗氧化能力的結果類似[31]，DSA與游離氨基酸、茶黃素和GCG的含量呈極顯著正相關（p＜0.01），而與茶褐素和水浸出物的含量呈顯著負相關（p＜0.05），與GA和四種簡單兒茶素（C、EC、EGC和GC）呈極顯著負相關（p＜0.01）。總抗氧化能力（FRAP）與四種酯型兒茶素（GCG、CG、ECG、EGCG）、茶多酚、游離氨基酸和茶黃素的含量呈極顯著負相關（p＜0.01），Wang Z[32]等用七種茶源真菌發酵熟普時也發現，FRAP與茶多酚、GCG、CG、ECG呈極顯著負相關（p＜0.01）。FRAP與水浸出物和C呈顯著正相關（p＜0.05），與EC、GA、EGC和GC呈極顯著正相關（p＜0.01）。清除羥自由基能力（HAS）僅與GCG呈極顯著負相關（p＜0.01），與茶多酚、游離氨基酸、茶黃素、ECG和EGCG呈顯著負相關（p＜0.05），與水浸出物含量呈極顯著正相關（p＜0.01），與C、EC、GA、EGC和GC呈顯著正相關（p＜0.05）。

3 小結

蘭花香型漳平水仙經人工接種金花菌發酵后，其水浸出物、沒食子酸和4種簡單兒茶素（GC、EGC、C 和EC）等含量極顯著性增加（p＜0.01），其可溶性糖含量無明顯變化，其茶多酚、游離氨基酸、4種酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）和茶黃素含量極顯著性降低（p＜0.01），咖啡堿和茶紅素含量無顯著性變化（p＞0.05），茶褐素含量有所增加。漳平水仙茶生化成分的變化影響其生物活性[6]，蘭花香型漳平水仙接種金花菌發酵后，其總抗氧化活性極顯著性增加（p＜0.01），而清除羥自由基能力略有增加，DPPH自由基清除活性極顯著性降低（p＜0.01）。總之，漳平水仙經過金花菌發酵后，其有助于茶湯醇厚的水浸出物含量增加，具有苦澀味的茶多酚和酯型兒茶素含量降低，茶褐素增加，散發獨特菌香[33]，且總抗氧化能力提高，由此可見，利用金花菌發酵漳平水仙茶能賦予漳平水仙新的風味，在一定程度上提高漳平水仙的品質和抗氧化活性，具有一定的開發前景。