Checkerboard法對ε-聚賴氨酸和殼聚糖抑菌作用的研究

魏奇，白偉娟，鐘鑫榮，王曉贇，張承康，張維瑞，3，陳美霞*，劉盛榮，3*

（1.寧德師范學院 生命科學學院，福建 寧德 352100；2.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350000；3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100；4.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司，福建 廈門 361100）

近年來，隨著消費習慣的變化，消費者對食品的需求也隨之發生變化。防腐劑在食物當中所起到的關鍵作用是抑制食品中微生物的生長，防止食品出現因微生物產生的腐敗變質現象，從而延長食品的貯藏期[1]。天然食品防腐劑，具有較好的抑菌和保鮮的作用，能夠避免化學防腐劑殘留物對人體產生較大的毒副作用。因此，天然防腐劑也越來越受到消費者的青睞[2-4]。

ε-聚賴氨酸是一種從微生物中篩選出的天然防腐抑菌劑，具有良好防腐性能和熱穩定性等特點，存在巨大的商業潛力[5]。ε-聚賴氨酸是由鏈霉菌好氧發酵產生，研究表明其在人體中能夠直接降解成賴氨酸，對人體無毒無害，是一種天然的生物防腐劑[6-7]。ε-聚賴氨酸已被證實不會對生物體的生長、生育繁殖、神經和免疫方面產生毒副作用，因此可作為一種天然、安全的食品防腐劑[8]。ε-聚賴氨酸主要的抑菌機制是通過破壞微生物的細胞形態，損傷細胞膜，引起細胞內物質的泄漏，導致細胞內的酶及蛋白質的代謝紊亂，從而引起機體的氧化應激反應，最終破壞細胞的功能，導致細胞死亡[9]。殼聚糖是一種天然的氨基酸多糖，具有廣譜抑菌作用，能夠有效抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等食源性致病菌，并且有自發成膜的物理特性，能夠在食品的表面形成透明無色的薄膜。因其無毒無害且無副作用，所以廣泛應用于食品的生產和加工[10-11]。殼聚糖的抑菌作用主要是通過抑制微生物的生長，降低三羧酸循環中的關鍵酶活性，破壞細胞膜結構，最終導致菌體死亡[12]。目前，殼聚糖可以廣泛應用于果蔬保鮮，達到延緩果實衰老、抑菌防腐、保證果蔬品質、延長果蔬貯藏期的效果。因此，殼聚糖可以延長食品的貯藏期。

殼聚糖和ε-聚賴氨酸是一種天然食品防腐抑菌劑，具有較好的抑菌和保鮮作用。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配使用時，殼聚糖形成薄膜吸附在細胞膜上，影響了營養物質進入，從而達到抑菌的作用[13-15]。有研究報道，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復合涂膜能夠延長中國對蝦的保質期，減少中國對蝦的汁液流失，減少微生物數量[16]。殼聚糖和ε-聚賴氨酸具有協同作用，能夠改善貯藏期間櫻桃的硬度和色澤，可以提高櫻桃的貯藏品質[17]。因此，開發殼聚糖和ε-聚賴氨酸復合保鮮劑對提高食品品質和延長食品貯藏期具有十分重要的意義。

天然食品防腐劑的復配應用，有助于提高防腐劑的保鮮效果，增加抑菌譜，減少用量而降低成本。本文對殼聚糖與ε-聚賴氨酸復配的抑菌效果進行研究，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，采用微量稀釋法來測定殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復配溶液的最低抑菌濃度，采用Checkerboard法探究殼聚糖和ε-聚賴氨酸抑菌活性，并分析兩者復配溶液對細菌的影響，該研究可為ε-聚賴氨酸和殼聚糖在食品中的科學復配應用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：寧德師范學院微生物室提供。

1.1.2 試劑

ε-聚賴氨酸（食品級）：浙江新銀象生物工程有限公司；殼聚糖（食品級）：北京索萊寶科技有限公司；營養瓊脂、營養肉湯：廣州環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9272A電熱恒溫培養箱、DHG-9070A鼓風干燥箱：上海飛越實驗儀器有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺、YXQ-SG46-280S全自動高壓滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；THZ-100恒溫培養搖床：上海一恒科學儀器有限公司；YP802N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；YC-300L數控低溫保存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶劑配制

ε-聚賴氨酸溶液制備：用去離子水配制ε-聚賴氨酸溶液（2%）。殼聚糖溶液制備：用0.5%冰醋酸制備殼聚糖溶液（0.1%）。

1.3.2 培養基配制

營養瓊脂培養基的配制：稱取營養瓊脂干粉（33 g）加入1 L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15 min）。營養肉湯培養基的配制：稱取營養肉湯干粉（18 g）加入1 L蒸餾水，高溫高壓滅菌（121℃，15 min）。

1.3.3 菌種活化

在超凈工作臺中，將兩種供試菌接種至營養肉湯培養基，置于37℃恒溫培養箱中培養24 h。

1.3.4 菌液制備

在超凈工作臺中，分別取上述少量活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，接種至30 mL營養肉湯培養基中于恒溫搖床中培養24 h（150 r/min，35℃）。

1.3.5 最小抑菌濃度測定

96孔板中加入100 μL ε-聚賴氨酸溶液（或殼聚糖溶液）和100 μL菌液濃度為106CFU/mL的大腸桿菌（或金黃色葡萄球菌）。分別在24、48 h和72 h后觀察，測定最小抑菌濃度。表1為ε-聚賴氨酸和殼聚糖溶液的濃度。

表1 殼聚糖和ε-聚賴氨酸的濃度Table 1 The concentration of ε-polylysine and chitosan

1.3.6 Checkerboard法測試

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液的濃度如表2所示。按照Checkboard法測定殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液的聯合抑菌作用。

表2 殼聚糖、ε-聚賴氨酸復配濃度Table 2 The combined concentration of ε-polylysine and chitosan

1.3.7 Checkerboard法計算聯合抑菌指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）值

采用Checkerboard法計算FICI值，從而評估殼聚糖和ε-聚賴氨酸相互抑菌作用[18-19]。FICI計算公式如下。FICI=殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液MIC/殼聚糖MIC+殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液MIC/ε-聚賴氨酸MIC

當 FICI≤0.5 時，為協同效應；0.5＜FICI≤1，為相加效應；1＜FICI≤2，為無關效應；FICI>2，為拮抗效應。

1.3.8 蛋白質泄漏量的測定

參考文獻[20]的方法，測定蛋白質泄漏量。取5 mL的金黃色葡萄球菌菌液，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后棄上清液，用0.85%的生理鹽水將菌液重懸至40 mL。吸取 2 mL ε-聚賴氨酸溶液（35 μg/mL）、殼聚糖溶液（180 μg/mL）和復配溶液（16 μg/mL ε-聚賴氨酸、100 μg/mL殼聚糖）分別與2 mL金黃色葡萄球菌菌液混勻，處理時間為72 h。樣品用0.85%的生理鹽水稀釋5倍，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后測定蛋白質濃度，無菌生理鹽水作為空白對照，計算蛋白質泄漏量。

取5 mL的大腸桿菌菌液，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后棄上清液，用0.85%的生理鹽水將菌液重懸至40 mL。吸取 2 mL ε-聚賴氨酸溶液（20 μg/mL）、殼聚糖溶液（240 μg/mL）和復配溶液（6 μg/mL ε-聚賴氨酸、100 μg/mL殼聚糖）分別與2 mL大腸桿菌菌液混勻，處理時間為72 h。樣品用生理鹽水稀釋5倍，離心5 min（8 000 r/min，4℃）后測定蛋白質濃度，無菌生理鹽水作為空白對照，計算蛋白質泄漏量。

1.4 數據處理

每個試驗重復測定3次，取其平均值，應用SPSS 16.0對數據進行處理，并用Graphpad Prism 9作圖。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響

殼聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度見表3。

表3 殼聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of chitosan against Staphylococcus aureus and Escherichia coli

由表3可知，殼聚糖的抑菌活性隨著殼聚糖濃度增加而增強。不同處理時間下，殼聚糖對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為180 μg/mL。當抑制時間24 h時，殼聚糖對大腸桿菌的最小抑菌濃度為200 μg/mL。當抑制時間48、72 h時，殼聚糖對大腸桿菌的最小抑菌濃度為240 μg/mL。由此可知，當抑制時間為72 h時，殼聚糖對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（180 μg/mL）小于對大腸桿菌的最小抑菌濃度（240 μg/mL）。

2.2 ε-聚賴氨酸對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響

ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度見表4。

表4 ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration of ε-polylysine against Staphylococcus aureus and Escherichia coli

由表4可知，當抑制時間為24 h時，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為25 μg/mL；ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為15 μg/mL。當抑制時間為48 h時，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為35 μg/mL，ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL。當抑制時間為72 h時，ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為35 μg/mL；ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL。由此可知，ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度小于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。

2.3 Checkerboard法測試抑菌效果

2.3.1 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對金黃色葡萄球菌的影響

采用Checkerboard法評價殼聚糖和ε-聚賴氨酸的復配溶液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果，并根據FICI指數預測殼聚糖和ε-聚賴氨酸之間的相互抑菌作用的類型。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表5。

表5 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 5 The antibacterial activity of the combination of chitosan and ε-polylysine against Staphylococcus aureus

由表5可知，當抑制時間為24、48 h時，殼聚糖和ε-聚賴氨酸的 FICI值為 1.01～1.29（1＜FICI≤2），由此提示殼聚糖對金黃色葡萄球菌的相互作用的類型為無關效應。當抑制時間為72 h時，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對金黃色葡萄球菌具有疊加抑菌的作用（0.5＜FICI≤1）。由此可知：當抑制時間為72 h時，16 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL 殼聚糖的復配溶液對金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。

2.3.2 殼聚糖和ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的影響

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌的抑菌效果見表6。

由表6可知，當抑制時間為48、72 h時，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌均具有疊加抑菌的作用（0.5＜FICI≤1）。與抑制時間24 h相比，在抑制時間為48、72 h條件下，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌疊加抑菌作用更加穩定。由此可知，抑制時間為 72 h 時，6 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL 殼聚糖的復配溶液對大腸桿菌的抑制作用最佳。

表6 殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌的抑菌效果Table 6 The antibacterial activity of the combination of chitosan and ε-polylysine against Escherichia coli

2.3.3 不同抑菌劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌蛋白質泄漏量的影響

不同抑菌劑對金黃色葡萄球菌的蛋白質泄漏量的影響見圖1。

通過測定蛋白質的泄漏可以用于評價抑菌劑的抑菌效果。由圖1可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對金黃色葡萄球菌的蛋白質泄漏量顯著高于空白對照組（P<0.05）。由此可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復配溶液能夠導致金黃色葡萄球菌的蛋白質發生泄漏，由此導致金黃色葡萄球菌的失活。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液導致的金黃色葡萄球菌蛋白質泄漏作用顯著高于單獨使用殼聚糖和ε-聚賴氨酸（P<0.05）。由此可知，殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性強于殼聚糖和ε-聚賴氨酸單獨使用的抑菌效果。

圖1 不同抑菌劑對金黃色葡萄球菌的蛋白質泄露量的影響Fig.1 Effect of different preservative on the protein released from Staphylococcus aureus

不同抑菌劑對大腸桿菌的蛋白質泄漏量的影響見圖2。

圖2 不同抑菌劑對大腸桿菌的蛋白質泄漏量的影響Fig.2 Effect of different preservative on the protein released from Escherichia coli

由圖2可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液對大腸桿菌的蛋白質泄漏量顯著高于空白對照組（P<0.05）。由此可知，殼聚糖、ε-聚賴氨酸及其復配溶液能夠導致大腸桿菌的蛋白質發生泄漏，導致大腸桿菌失活。殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液導致的大腸桿菌的蛋白質泄漏量顯著高于單獨使用殼聚糖和ε-聚賴氨酸（P<0.05）。

3 討論與結論

殼聚糖和ε-聚賴氨酸復配溶液會產生聚合物，增加微生物蛋白質的泄漏量，使微生物失活，兩者對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有疊加抑菌作用。6 μg/mL ε-聚賴氨酸和100 μg/mL殼聚糖的復配溶液對大腸桿菌的抑制作用最佳。16 μg/mL ε-聚賴氨酸和 100 μg/mL殼聚糖的復配溶液對金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳。葉青青等[21]研究發現殼聚糖/聚賴氨酸復合膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑菌作用，試驗結果與本研究結果一致。通過研究殼聚糖及ε-聚賴氨酸的復配溶液的抑菌效果，改變過去單一的保鮮方式，提高殼聚糖成膜的均勻性，增加ε-聚賴氨酸保鮮抑菌效果，為兩者在天然食品防腐劑中的配合應用提供了理論參考。