食源性致病菌活菌檢測方法的應用現狀及展望

王純，張若鴻，王曉芳，李曉然，楊洋，崔生輝，郭云昌

（1.河北科技師范學院 食品科技學院，河北 秦皇島 066600；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；3.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

近年來，因食源性致病菌污染食品供應鏈，引發食品安全問題，造成食源性疾病頻繁發生，對其預防與控制已引起世界各國的高度關注。這些致病菌易受到各種環境因素（溫度、pH值、濕度、壓力、光照輻射、極端環境等）的影響，可能會暫時或永久地破壞細胞的主要結構（細胞膜、核酸、蛋白質等）而喪失功能，使其展現出不同的代謝狀態：亞致死狀態、活菌非可培養狀態（viable-but-non-culturable，VBNC）或持留狀態和休眠[1]。因此，在食源性致病菌檢測過程中，某些代謝微弱的活菌無法被檢出，導致漏檢，致病菌仍然存在于食品中，從而威脅消費者健康。反之，如果死菌被檢測成活菌，則會出現假陽性結果，不僅阻礙食品的正常生產，還會造成不必要的產品召回，影響安全食品的供應，而且干擾食品監管部門對食品中致病菌的生長情況的正確判斷，不能及時發現食品安全隱患并有效控制食品安全風險，對食品產業的健康持續發展造成嚴重危害。因此，如何區分死菌與活菌是有效檢測食源性致病菌的關鍵環節，提高活菌檢測的速度、效率和靈敏度對保障安全食品的供應和預防食源性疾病尤為重要。

基于細胞培養的傳統食源性致病菌檢測方法耗時較長且無法有效區分處于不同代謝狀態的食品微生物[2]。為克服細胞培養方法的局限性，人們提出了各種可替代的、更快速的非細胞培養方法來檢測區分食源性致病菌中的死菌或活菌。本文重點介紹了熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）檢測法及其它基于噬菌體的檢測方法，并討論了其在活體食源性致病菌檢測方面的應用及發展前景，以期為進一步探究食源性致病菌的代謝狀態，研發更加快速高效的檢測方法提供參考。

1 基于細胞培養的方法

傳統的細胞培養方法靈敏度較高，成本較低且操作簡單，易于使用，成為食源性致病菌檢測的“金標準”，因此該方法仍然是目前許多食品檢測實驗室的首選方法。但是傳統的致病菌檢測過程相對比較繁瑣，需要經過多步完成，如前增菌、選擇性增菌、分離純化、鏡檢，然后生化鑒定，整個培養時間較長，最多可能需要7 d的時間才能得出檢測結果[3]，不能滿足市場快速準確測定結果的要求。

此外，由于食品基質的異質性，病原體分布不均勻以及食物中目標病原體的含量低等原因可能會干擾選擇性鑒定，影響結果的準確性，限制檢測方法的靈敏度[4]。如果在被檢測的食品中存在處于受損狀態、VBNC狀態或休眠狀態的微生物，基于細胞培養方法的檢測能力可能會受到很大限制，不能有效區分死菌或活菌，造成病原菌感染擴散，成為食品安全的潛在隱患，對人類健康造成嚴重威脅。

2 非細胞培養的方法

非細胞培養方法本質上分為兩種，即基于核酸和基于噬菌體的檢測方法，它們在檢測食源性致病菌活菌方面具有廣闊的應用空間。

2.1 基于核酸的方法

以核酸為基礎的方法是通過檢測特定的DNA或RNA序列來鑒定食源性致病菌。盡管常規及定量PCR檢測方法等具有特異性強、靈敏度高和檢測快速等特點，但由于無法區分是來自活菌還是死菌的DNA或RNA，難以消除死菌殘留DNA導致的假陽性結果，因此單獨使用無法證明細胞活性[5]。

2.1.1 qPCR檢測法

疊氮溴化乙錠（ethidiummonoazide，EMA）或疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）染料是插入型熒光核酸結合染料。EMA（10 μg/mL）[6]或 PMA（4 μg/mL）[7]在強光下可選擇性地透過受損的細胞膜與DNA發生不可逆的共價交聯反應，從而抑制PCR擴增，最終只有來自細胞膜完整的細胞DNA才會被擴增[8]。

ZHOU等[9]將PMA作為前處理手段，結合qPCR，用于檢測牛奶中的活蠟狀芽孢桿菌。選擇催產芽孢桿菌的蠟狀內酯合成酶基因作為引物，并利用3 μg/mL的PMA處理，以抑制死細胞DNA的PCR擴增。在優化的測定參數下，以純培養物和加標牛奶為基質，測得活菌的檢出限（limitofdetection，LOD）均為 102CFU/mL。值得關注的是，EMA/PMA可能在細菌細胞壁合成期間的某個時刻穿孔，抑制DNA擴增導致假陰性結果。而且細胞膜保持完整狀態的細胞不一定具有代謝活性（如VBNC狀態的細胞），可能產生假陽性結果[10]，無法對致病菌進行準確定量檢測，給食品安全帶來潛在的不可控風險。此外，在檢測時需優先使用PMA，因為EMA能夠穿透細胞膜完整的活細胞，容易導致假陰性結果。

2.1.2 mRNA檢測法

致病菌的DNA是穩定的核酸分子，并且死菌的DNA降解較慢，因此細菌內是否存在DNA不能作為判斷細菌是否存活的標志。而mRNA的半衰期較短，僅僅只有幾分鐘，在細菌死后很快降解，通常只存在于活細胞中，因此，測定RNA比DNA更適合作為評估細菌活力的靶標[11]。逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）是最常用的基于RNA的分子技術之一，而且是快速檢測食品中食源性致病菌的首選方法。BAI等[12]基于磁性捕獲探針結合RT-qPCR的mRNA提取法快速檢測牛奶中活的沙門氏菌，其中探針和目標序列的復合體直接用作檢測沙門氏菌的模板，而無需變性和純化步驟。通過磁性捕獲探針來分離稀釋10倍的沙門氏菌人工污染的牛奶中的mRNA，然后利用RT-qPCR檢測mRNA，活菌的檢測靈敏度可達104CFU/mL，經過12 h增菌培養后可以提高到10 CFU/mL。FOUT等[13]從水樣濃縮物中提取病毒的RNA，采用RT-qPCR定量測定飲用水中的腸病毒和諾如病毒的濃度，建立標準曲線，作為RT-qPCR的陽性對照，以每升病毒RNA的基因組拷貝數計算病毒濃度。在處理RNA樣品時應需格外小心，以減少RNA的降解。

由于互補脫氧核苷酸（complementary DNA，cDNA）生成步驟需要更長的時間，且提取RNA比較復雜，因此RT-qPCR方法應用于檢測食源性致病細菌不太常見。XIAO等[14]利用RT-qPCR方法檢測活的單核增生李斯特氏菌細胞，分別在未熱處理及經過熱處理（98℃，30 min）的單核增生李斯特氏菌樣品中提取RNA進行RT-qPCR分析。熱處理的細胞在室溫（25℃）下保存24 h仍可以檢測到RT-qPCR擴增信號，并且信號強度與細胞數量相關，其結果與靶向RNA穩定性有關。可見，不是所有的研究都證明mRNA壽命短，也可能會出現假陽性結果；而且被測樣品中致病菌RNA易降解，也可能導致假陰性結果。因此，以mRNA為基礎的RT-PCR方法不能夠完全區分死菌或活菌，且檢測靈敏度受到mRNA提取不穩定的限制。

2.2 基于噬菌體的方法

因噬菌體僅能高特異性地感染具有代謝活性的細菌，并且在活細胞內復制，因此基于噬菌體的方法可以用來檢測細胞活性[15]。目前，大多數基于噬菌體的檢測方法均把裂解性噬菌體作為裂解劑來檢測新的子代噬菌體或根據目標細菌細胞內釋放的物質來區分細胞活性。

2.2.1 噬菌體擴增方法

將人工污染致病菌的食品樣品與特異性噬菌體一起培養，開始裂解循環，在潛伏期結束之前，用化學殺毒劑（含氯消毒劑、碘伏等）或物理處理（激光、高溫等）[16]殺死所有的外源性噬菌體。在受感染的細菌完成裂解循環后，釋放新的噬菌體顆粒，感染周圍的細菌，12 h培養后產生清除或斑塊的區域，如圖1所示。

圖1 噬菌體擴增（噬斑）試驗Fig.1 Phage amplification（plaque）test

由于噬菌體擴增操作簡單，具有較高的宿主特異性和較短的擴增時間，而且具有區分活菌和死菌細胞的能力，因此目前已被應用于檢測不同的食源性致病菌，例如金黃色葡萄球菌[17]、沙門氏菌[18-19]、大腸桿菌[20]等。如ALCAINE等[20]建立了一種利用生物工程T7噬菌體菌株來提高基于噬菌體擴增的側向流動的方法檢測活菌。該方法在加標肉湯中測得活的大腸桿菌的檢出限為103CFU/mL。此外，該方法在加標河水中的檢出限為100 CFU/100 mL。然而，噬菌體擴增步驟較為繁雜，不適合高通量測試。如果不能完全殺死外源性噬菌體，可能留下假陽性斑塊。雖然可以通過PCR檢測來確定斑塊中心DNA的身份[21]，但可能會延長檢測時間。

2.2.2 噬菌體擴增+qPCR/免疫測定方法

隨著分子生物學技術的進步，研究發現免疫學[22]或分子檢測[23]與噬菌體擴增偶聯分別檢測子代噬菌體或噬菌體DNA，可以達到更快速的檢測時間，檢測原理如圖2所示。噬菌體擴增釋放出子代噬菌體，這些噬菌體可通過qPCR、酶聯免疫吸附測定或側流免疫層析方法進行定量檢測。

圖2 噬菌體擴增+qPCR/免疫學方法檢測致病菌活菌原理Fig.2 The principle of phage amplification+qPCR/immunological method to detect live pathogenic bacteria

目前，研究表明噬菌體擴增結合qPCR可以分別在8 h和2 h內從不同的基質（包括加標牛肉湯[23]和人工污染的水樣品[24]）中高度敏感地檢測出活的大腸桿菌O157：H7。將樣品進行增菌培養后，檢出限分別為10CFU/mL和100 CFU/mL。值得注意的是，噬菌體或宿主DNA要釋放到盡可能小的體積，才能最大限度地提高檢測靈敏度，否則可能需要進行DNA沉淀和柱提。

MIDO等[22]通過 LuminexMAGPIX儀器上的噬菌體MS2（一種大腸桿菌雄性特異性噬菌體）擴增偶聯免疫測定方法來檢測活的大腸桿菌。在大腸桿菌緩沖液中存在死細胞（95℃水浴加熱15 min）的情況下，MS2僅與活細胞選擇性結合，而且大腸桿菌增菌培養3 h之后測得活細胞的靈敏度為 1×102細胞/mL。MARTELET等[25]開發了一種高速靈敏的方法用于檢測食品基質中活的大腸桿菌，該方法首先通過特異性噬菌體復制進行信號放大，然后進行免疫捕獲和靶向質譜分析。該檢測細菌無需進行增菌培養，能夠在不到12 h的時間內直接檢測到加標牛奶中含有1 CFU/mL活的大腸桿菌。該方法可以進一步改進，通過使用大量噬菌體來促進噬菌體宿主識別或使用免疫純化的抗體，可能會獲得更高的特異性和靈敏度。

2.2.3 噬菌體擴增+酶測定方法

在噬菌體裂解周期完成后，不僅釋放子代噬菌體，而且還釋放細胞的內容物，包括必需的生物標志物[26]。樣品產生的生物發光與細胞內化合物的釋放量和樣品中最初的活菌的細胞數量成正比，因此可以通過酶和底物反應來測定化合物的釋放量。由于β-半乳糖苷酶（β-gal）是大腸桿菌乳糖運輸和代謝系統中的必需酶，可以用作檢測其活性的指標。因此CHEN等[27]通過監測和測量β-gal活性，并進一步利用大腸桿菌特異性噬菌體進行檢測。研究發現在大腸桿菌緩沖液中活菌的檢出限可達1×105CFU/mL，該檢測在3 h以內完成。此外，基于熒光素酶[28]、蛋白酶[29]和堿性磷酸酶[30]的噬菌體檢測方法在測定食品樣品中的應用更為廣泛。這些操作方法的測定原理基本相同，都是基于酶催化與發光產物的反應。PACZESNY等[26]將攜帶磷酸酶基因phoA的大腸桿菌噬菌體T7添加到樣品中，如果樣品中存在活的大腸桿菌，則會發生噬菌體感染、復制和堿性磷酸酶表達，然后使用多種底物檢測堿性磷酸酶表達分子，原理如圖3所示。

圖3 噬菌體擴增+酶測定方法檢測原理Fig.3 Detection principle of phage amplification+enzyme assay method

2.2.4 電化學噬菌體生物傳感器

噬菌體作為一類特異性感染活細菌的病毒，具有較高的特異性和選擇性，而且能夠被快速、廉價的大量制備。近年來，利用電化學阻抗譜檢測食源性致病菌的研究越來越多。FAROOP等[31]開發了一種將從污水中分離出的金黃色葡萄球菌特異性噬菌體作為生物識別元件，固定于細菌纖維素為基質的電化學生物傳感器，通過電流響應可以有效區分細胞混合物中的活菌和死菌。該方法在中性pH值下，30 min以內分別在磷酸鹽緩沖液和加標牛奶中檢測到低至3 CFU/mL和5 CFU/mL的活的金黃色葡萄球菌。NIYOMDECHA等[32]開發了一種基于沙門氏菌特異性M13噬菌體/金電極并結合電容技術的生物傳感器，其中M13噬菌體修飾的電極可以特異性結合活的沙門氏菌。該系統提供了良好的重現性，相對標準偏差為1.1%。此外，當以5倍稀釋度的加標雞肉樣品用于活的沙門氏菌檢測時，樣品進入傳感器系統后，該方法能夠在40 min內測得沙門氏菌活菌200 CFU/mL的檢出限。可見，基于噬菌體的電化學生物傳感器在檢測食源性致病菌活菌方面具有較大的應用潛力。

3 食源性致病菌活菌檢測方法存在的問題及展望

食源性致病菌活菌檢測技術在不斷進步，每種方法都有各自的優勢，然而隨著技術的不斷進步，缺陷和不足也逐漸暴露出來。傳統的細胞培養方法是評估病原體生存能力的“金標準”，但檢測速度較慢，而且也存在對持留菌、休眠菌及代謝異質菌無法成功培養的缺陷。近年來，基于核酸的檢測方法可以提供較快的檢測速度，特別是基于mRNA的檢測方法，是一種潛在的快速檢測食源性致病菌活菌的解決方案。通常情況下，RT-qPCR方法檢測病毒的應用較為普遍。然而，細菌mRNA易降解的特性阻礙了RT-qPCR在食品檢測中的大規模應用。而基于噬菌體的檢測方法特異性強（100%），靈敏度高，且操作簡便、快速，已被廣泛應用于食品、臨床等樣品致病菌活菌的檢測，基于噬菌體檢測方法的應用見表1。該方法是目前檢測食源性致病菌活菌的最佳替代方法，在食源性致病菌活菌檢測領域具有巨大的應用前景。

由表1可知，噬菌體擴增+免疫測定與噬菌體擴增+qPCR方法相比，靈敏度略低。噬菌體擴增+qPCR方法可將裂解物直接用作目標噬菌體DNA，用于qPCR分析，而無需任何DNA提取和純化步驟，已應用于不同基質（食品和臨床樣品）中，能夠高度靈敏、快速地檢測不同的食源性致病菌活菌，而且在藥代動力學研究和噬菌體治療期間體內噬菌體繁殖的評估方面具有潛在的應用價值，相信未來在食源性致病菌活菌檢測領域將得到更普遍的應用。目前，盡管噬菌體擴增+酶測定方法在食品中檢測致病菌活菌的應用較少，但工程化噬菌體與特定蛋白酶結合可以實現對活菌病原體的多重檢測[29]，且易于在實驗室中使用，如沙門氏菌和李斯特氏菌[35]的特異性噬菌體已得到充分證明，這種噬菌體-蛋白酶-肽的組合將為樣品中活菌病原體的特異性、靈敏的多重檢測提供新的平臺。可見，噬菌體單獨使用或與酶（從酶抑制劑到磷酸酶）結合使用在食源性致病菌活菌檢測領域具有較好的發展潛力。基于噬菌體的生物傳感器在食源性致病菌活菌檢測方面具有較高的特異性和靈敏度，并且檢測快速。然而，由于不同細菌對應的特異性噬菌體不同或者某些細菌對噬菌體具有抗性，因此，在某些特殊情況下這種技術手段在有效區分細菌病原菌的活性方面還面臨挑戰，相關技術有待進一步深入研究。

表1 基于噬菌體檢測方法的應用Table 1 Application based on phage detection methods

此外，目前基于噬菌體的檢測方法仍存在一些尚未解決的問題，例如自然界中不同的食源性致病菌可能不存在對應的特異性噬菌體，無法有效檢測細菌活性。因此，隨著分子生物學和生物工程技術的發展，有待進一步構建新型噬菌體（對噬菌體進行基因工程改造）或重組噬菌體（構建新型的酶標記的目標噬菌體），進而研究開發出靈敏度更高、更快速的低成本檢測方法，更好地應用在一些特殊的細菌中，并進一步擴大基于噬菌體的檢測方法在實際樣品中的應用范圍。基于噬菌體的檢測方法面臨的另一個重要挑戰是靶細胞的狀態。環境條件、溫度、細菌生長速率和細胞損傷等都是影響噬菌體感染成功和感染效率的重要因素[36]。受損細胞即為受到亞致死損傷的細胞，處理方法（加熱、冷凍、輻射、發酵等）所造成的損傷是可逆性損傷[37]。盡管不是所有的亞致死致病菌都能夠在常規增菌培養條件下修復，但目前研究比較多的食源性亞致死致病菌（包括沙門氏菌、大腸桿菌[38]、李斯特氏菌[39]等）在適當的培養溫度下（處理方式不同，所需的最優溫度和修復時間不同），受損細胞在營養豐富的非選擇性培養基中培養1 h～6 h就能得到修復并進行選擇性增殖以達到檢測所需的細菌濃度水平。一般對于大部分細菌來說，低溫條件下復蘇效果較好。可見，處于亞致死損傷狀態的致病菌在進行基于噬菌體的方法檢測之前，受損細胞需要經過非選擇性修復培養（對損傷關鍵部位進行修復）后再進行選擇性增菌來確保細胞處于有利于感染的狀態，保證靶細胞的正常生長和成功檢測。若受損細胞無法正常修復增殖，則較常應用于PCR的檢測方法[40]，而不適用于基于噬菌體的檢測方法。因此，細菌在檢測之前需要進行增菌培養，在適宜的增菌培養條件下以確保細胞處于有利于感染的狀態。在未來的研究中，無論是基于過濾還是基于噬菌體的磁珠分離[27]，在適當的增菌培養條件下進行細菌濃縮可以確保目標細菌達到必要的細胞濃度，進而加快食源性致病菌活菌的檢測速度，提高檢測靈敏度，對保障食品安全及開發食源性致病菌活菌的研究具有重要意義。

4 結論

本文對食源性致病菌活菌的檢測方法進行了分類與總結，介紹了其在食源性致病菌活菌檢測方面的應用及其優勢與存在的局限性，并對其面臨的機遇和挑戰進行了討論。綜上所述，基于噬菌體的檢測方法憑借特異性強、靈敏度高和檢測時間更短等優勢，尤其是噬菌體擴增結合qPCR方法能夠快速檢測食源性致病菌的細胞活力，區分死菌/活菌，在食源性致病菌活菌檢測領域具有廣闊的應用前景。因此，隨著人們不斷的深入研究，新型噬菌體的構建及噬菌體擴增試驗與一些技術的交聯使用可以有效克服檢測中的缺陷，大大提高我國食源性致病菌的監測和預警能力，以期能為相關研究者開發食源性致病菌活菌的檢測方法提供參考。