自然發(fā)酵椰子水中拮抗乳酸菌篩選鑒定及抑菌特性

王雅，姜海燕，馬澤威，王學梅，李從發(fā)，劉四新

（1.海南大學 食品科學與工程學院，海南 海口 570228；2.海南大學 動物科技學院，海南 海口 570228；3.海南大學 理學院，海南 海口 570228）

椰子（Cocos nucifera L.）是海南特有的經(jīng)濟作物和觀賞植物，對海南的經(jīng)濟發(fā)展有重要作用[1]。目前，椰子加工產(chǎn)品從椰衣到椰殼再到椰子食品，種類豐富多樣[2]，是海南唯一開發(fā)和加工利用度最高的作物果實。椰子食品加工的原料一般可分椰肉和椰子水兩大類，絕大多數(shù)椰子加工食品都是以成熟椰肉為原料，椰子水是其加工副產(chǎn)物[3-4]，這種椰子水不同于飲料用的新鮮椰子水，營養(yǎng)和風味較次[5]，取椰肉的工藝也決定了其極易遭受污染而失鮮、變味，不適于飲用。過去，這種椰子水主要用作椰纖果（nata de coco）發(fā)酵生產(chǎn)的原料[6]，目前，由于經(jīng)濟和環(huán)保因素，國內(nèi)椰纖果的發(fā)酵生產(chǎn)基本消失，椰纖果壓縮果片原料基本靠從國外進口，導致國內(nèi)成熟椰子水無法得到有效利用而廢棄，既污染環(huán)境又浪費資源[7]。據(jù)估測，目前，國內(nèi)每天廢棄成熟椰子水可能達數(shù)百噸，經(jīng)濟損失十分嚴重，因此尋找成熟椰子水的新利用方式迫在眉睫。眾所周知，椰子水營養(yǎng)成分種類豐富、全面，濃度適中，常溫下極易繁殖各種微生物而變味、變質(zhì)[8-9]。基于高效利用資源原則，本研究擬將椰肉生產(chǎn)中失鮮、欠鮮的成熟椰子水利用益生菌進行培養(yǎng)和發(fā)酵，制成禽類飼用添加劑、投喂到海南文昌雞的養(yǎng)殖中，以有效促進雞的腸道健康并充分利用椰子水資源，減少浪費和損失，同時可極大提高椰子水的綜合利用附加值。

近年來，由于養(yǎng)殖業(yè)抗生素的大量使用而造成的耐藥性致病菌危害問題日趨嚴峻。在歐盟、日韓陸續(xù)禁用促生長類抗生素之后[10]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也于2020年7月1日全面禁止商品飼料中添加促生長類藥物（中藥類除外）[11]。在“飼料禁抗、養(yǎng)殖減抗”的大背景下，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)因動物產(chǎn)生腸道疾病或亞健康造成養(yǎng)殖成本上升，經(jīng)濟損失風險明顯加大[12]。因此，針對性研發(fā)有益于腸道健康、增強免疫活性、效率高、成本低的飼料或者飼料添加劑勢在必行。乳酸菌對動物機體的健康和腸道菌群的平衡有重要的作用[13-14]，其資源在自然界廣泛存在，常常可從發(fā)酵果蔬、動物腸道或者糞便中篩選獲取到優(yōu)良乳酸菌[15-17]。本試驗從海南自然發(fā)酵的椰子水中篩獲乳酸菌，以篩自病死雞、具有多重耐藥性的致病性大腸桿菌和沙門氏菌為指示菌，首先進行抑菌活性篩選和耐受性測試，然后將益生特性優(yōu)良的菌株進行椰子水高密度發(fā)酵培養(yǎng)，再對其抑菌作用特性進一步研究。基于自然發(fā)酵椰子水中篩選獲取的高活性益生菌在椰子水高密度發(fā)酵培養(yǎng)后進行飼料用途的開發(fā)研究未見報道，可為失鮮而不宜食用的成熟椰子水開發(fā)成飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰子水：市售成熟椰子，破殼取水后紗布過濾。每批次約150個椰子的水混勻、立即分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们敖?jīng)105℃、15 min滅菌。沙門氏菌（Salmonella）（編號：SWX、SXS）、大腸桿菌（Escherichia coli）（編號：ECJX、ECHN、ECXT、ECDY、ECXS）：來源于病死肉雞，由華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院預防醫(yī)學實驗室提供。

供試菌：共29株乳酸菌（編號64-1、131-1、32-1-2、32-2-1、A32、A33、A35、B20、L6、L11、L20、L25、L26、L31、L35、L37、L39、L40、L44、L45、L48、L50、L51、L57、L63、L64、L65、L67、L70），來源于自然發(fā)酵椰子水，由海南大學食品科學與工程學院保存提供。培養(yǎng)基：乳酸菌使用MRS培養(yǎng)基、雞源致病菌使用LB培養(yǎng)基。環(huán)丙沙星、阿米卡星藥敏實驗紙片、有機酸標準品、中性蛋白酶（200 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶（250 U/mg）：SIGMA公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Agilent 1260）：美國安捷倫公司；紫外分光光度計（T6新世紀）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 指示菌的耐藥性測試

指示菌的培養(yǎng)：將斜面和液體活化過的7株雞源致病菌 SWX、SXS、ECJX、ECHN、ECXT、ECDY 和ECXS分別以3%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。

耐藥性測試：分別取100μL指示菌液（活菌數(shù)約為109cfu/mL）以傾注法制備指示菌培養(yǎng)基平板。分別用無菌鑷子將阿米卡星、環(huán)丙沙星藥敏實驗紙片放置于平板內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量藥片的抑菌圈大小[18]。

1.3.2 拮抗乳酸菌的篩選和菌種鑒定

供試乳酸菌的培養(yǎng)：將29株供試乳酸菌以3%接種量分別接種到滅菌的椰子水中，37℃培養(yǎng)1 d～2 d。

抑菌活性初篩：以無菌打孔器于傾注法制備的指示菌平板上打孔（6 mm），注入80 μL乳酸菌發(fā)酵椰子水，每株菌3個平行，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈大小。

耐受性復篩：對抑菌活性大的乳酸菌進行耐受性測定，參考文獻[19]測定在 pH 值為 2.0、3.0、4.0，膽鹽質(zhì)量濃度為0.3%、0.6%、0.9%和未經(jīng)處理的MRS培養(yǎng)基下培養(yǎng)了16 h的OD600值，計算耐受存活率。

菌種鑒定：將篩選到的目標菌株送深圳華大基因公司進行菌種鑒定。

1.3.3 目標乳酸菌在椰子水中的生長規(guī)律

以系列稀釋-平板涂布法測定目標乳酸菌在椰子水中培養(yǎng)時的活菌數(shù)變化規(guī)律。

1.3.4 目標乳酸菌發(fā)酵椰子水的抑菌特性

參考文獻[20]，以 SWX、SXS、ECJX 為指示菌，測定目標乳酸菌發(fā)酵椰子水經(jīng)不同蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶）、在不同 pH 值（4.0、5.0、6.0）以及不同溫度（60、80、100℃）處理后抑菌活性的變化規(guī)律。

測定目標乳酸菌在椰子水中培養(yǎng)的pH值、總酸、有機酸種類及含量[21]隨時間的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析（Duncan），使用GraphPad Prism進行繪圖，數(shù)據(jù)結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 指示菌的耐藥性

環(huán)丙沙星和阿米卡星是常用治療革蘭氏陰性致病菌的抗生素。本研究使用來自于病死肉雞的常見致病菌——大腸桿菌和沙門氏菌作為指示菌，測試其耐藥性后選擇多重耐藥菌株進行拮抗菌篩選。指示菌對環(huán)丙沙星和阿米卡星的敏感性結果見表1。

表1 指示菌對環(huán)丙沙星和阿米卡星的敏感性Table 1 Sensitivity of indicator bacteria to ciprofloxacin and amikacin

表1結果顯示，致病菌株SWX、SXS、ECJX對兩種抗生素均表現(xiàn)耐藥。一般雞場發(fā)病時多表現(xiàn)為多種致病菌交叉感染，故選擇這3株致病菌進行后續(xù)拮抗菌篩選。

2.2 拮抗乳酸菌的篩選和菌種鑒定

2.2.1 抑菌活性初篩

本試驗前期從自然發(fā)酵椰子水中分離篩選到多株乳酸菌，挑選29株在椰子水中生長較好的乳酸菌進行拮抗菌篩選。首先篩選到對7株雞致病菌都有抑制作用的乳酸菌共 5 株：A32、L11、L20、L48 和 L51，對雙重耐藥菌株SWX、SXS和ECJX的抑菌活性如圖1所示，發(fā)現(xiàn)菌株A32、L11、L51的抑菌活性較強于其他菌株，因此選擇這3株乳酸菌進行后續(xù)試驗。

圖1 不同乳酸菌的抑菌圈直徑Fig.1 Diameter of inhibition zone of different lactic acid bacteria

2.2.2 耐受性復篩

為了篩選到對雞腸道健康有利的乳酸菌，對篩選到的3株乳酸菌進行耐受性測試，結果如圖2、圖3所示。

圖2 不同乳酸菌的耐酸存活率Fig.2 The acid-resistant survival rate of different lactic acid bacteria

由圖2可知，在pH4.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后，A32的存活率為45.76%，顯著高于L11和L51（p<0.05），L11的存活率也顯著高于L51（p<0.05）；在pH3.0下，A32和L11的存活率均顯著高于 L51（p<0.05）；在pH2.0的培養(yǎng)基中幾乎不生長。綜上可知，A32和L11的耐酸能力強于L51。

如圖3，隨著膽鹽濃度的增加，乳酸菌的生長受到了不同程度的抑制。在膽鹽濃度為0.6%、0.9%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后，A32的存活率分別為8.38%、5.21%，顯著高于L11和L51（p<0.05）；3株乳酸菌中A32的耐膽鹽能力最好，存活率較高。

圖3 不同乳酸菌的耐膽鹽存活率Fig.3 Bile salt resistant survival rate of different lactic acid bacteria

綜上所述，擬選定抑菌能力強、耐酸和耐膽鹽能力都較好的A32菌株作進一步研究。

2.2.3 菌種鑒定

A32革蘭氏染色鏡檢圖見圖4。

圖4 A32革蘭氏染色鏡檢圖Fig.4 Microscopic view of A32 Gram stain

如圖4（放大倍數(shù)為100×10）所示，A32菌株為兩端鈍圓的短桿菌、革蘭氏陽性菌，單個或成對排列，經(jīng)16S rDNA分子生物學鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。據(jù)報道，發(fā)酵乳桿菌具有較強的抑菌活性、并對腸道環(huán)境有較好的耐受性，同時還具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降解膽固醇等益生特性，是人和動物腸道的正常菌群[22]。

2.3 目標乳酸菌在椰子水中的生長規(guī)律

前述研究已顯現(xiàn)菌株A32能在椰子水中快速生長繁殖，為考察其生長規(guī)律及未來以椰子水液態(tài)制劑直接應用時活力的穩(wěn)定性，研究了培養(yǎng)1 d～5 d活菌數(shù)變化，結果見圖5。

由圖5可知，發(fā)酵24 h其活菌數(shù)可迅速增加至9.05 lg cfu/mL，并在1 d～3 d內(nèi)都趨于穩(wěn)定、活菌數(shù)維持在9 lg cfu/mL左右，發(fā)酵至第4天，活菌數(shù)開始緩慢下降，但仍達8 lg cfu/mL以上，但當至第5天時，活菌數(shù)劇烈下降至6.03 lg cfu/mL。說明該菌株在椰子水中能保持旺盛生長1 d～4 d，初步顯示其進行活菌菌劑開發(fā)應用時的穩(wěn)定性較好。

圖5 目標乳酸菌A32在椰子水中的生長規(guī)律Fig.5 Growth regularity of target strain A32 in coconut water

2.4 目標乳酸菌發(fā)酵椰子水的抑菌特性

為考察篩得的目標乳酸菌A32的抑菌物質(zhì)的特點，開展了其抑菌特性研究。

2.4.1 在椰子水中抑菌活性的變化規(guī)律

A32菌株在椰子水中能維持4 d較好的生長，為考察其抑菌活性與菌體生長之間的關系，以雙重耐藥的致病菌SWX、SXS、ECJX為指示菌，研究了A32發(fā)酵椰子水的抑菌活性變化規(guī)律，結果見圖6。

圖6 A32發(fā)酵椰子水抑菌活性隨發(fā)酵時間的變化Fig.6 Changes of antibacterial activity of fermented coconut water with fermentation time

由圖6可知，抑菌活性在第1天后迅速增強，第3天后不再有明顯增加（p>0.05），維持到第5天時也未出現(xiàn)明顯下降，說明抑菌活性在完成對數(shù)生長后迅速增大，但并不與活菌數(shù)直接相關，由此推測，抑菌物質(zhì)可能主要為初級代謝產(chǎn)物。

2.4.2 目標乳酸菌發(fā)酵椰子水中抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

酶、酸和熱處理對A32發(fā)酵椰子水抑菌活性的影響見表2。

由表2可知，A32菌株發(fā)酵椰子水在經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶等不同蛋白酶處理2 h后的抑菌活性幾乎無變化（p>0.05），說明其抑菌物質(zhì)對蛋白酶不敏感，應該不是蛋白質(zhì)和多肽類。

表2 酶、酸和熱處理對A32發(fā)酵椰子水抑菌活性的影響Table 2 Effects of enzymes，acids and heat treatment on the antibacterial activity of A32 fermented coconut water

在乳酸菌A32抑菌活性對pH值的穩(wěn)定性試驗中發(fā)現(xiàn)，當調(diào)至pH4.0時，其對3株耐藥性致病菌SWX、SXS、ECJX的抑制活性均有所降低；而當pH值調(diào)到5.0或者6.0時，抑菌圈完全消失。在熱穩(wěn)定性試驗中，A32發(fā)酵椰子水分別經(jīng)過60、80、100℃水浴處理30min后對3株指示菌的抑制活性幾乎無變化（p>0.05）。說明A32的抑菌物質(zhì)有較好的耐熱性，且可能主要為有機酸類成分。

2.4.3 目標乳酸菌在椰子水中的產(chǎn)酸規(guī)律

為直接了解菌株A32的產(chǎn)酸規(guī)律，研究了其pH值、總酸和有機酸隨發(fā)酵時間的變化情況，結果見圖7、圖 8。

圖7 A32發(fā)酵椰子水pH值和總酸隨發(fā)酵時間的變化Fig.7 Changes of pH and total acid of A32 fermented coconut water with fermentation time

圖8 A32發(fā)酵椰子水主要有機酸隨發(fā)酵時間的變化Fig.8 Changes of main organic acid in A32 fermented coconut water with fermentation time

由圖7可知，前3 d，A32發(fā)酵椰子水的pH值不斷下降、總酸含量不斷增加，但第3天后pH值與總酸含量趨于穩(wěn)定、不再有顯著性變化（p>0.05），第3天時其pH值為3.55、總酸含量為17.09 g/L。結合圖6的抑菌活性分析，發(fā)現(xiàn)A32發(fā)酵椰子水的抑菌活性與總酸含量呈顯著正相關關系（p<0.05），說明A32在椰子水中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能主要是有機酸類物質(zhì)。

經(jīng)前期檢測，A32發(fā)酵椰子水中產(chǎn)生的有機酸主要有蘋果酸、檸檬酸、乳酸、丙酮酸等，其中蘋果酸、檸檬酸和乳酸的含量約占總有機酸含量的64%、15%、14%。通過測定不同時間3種主要有機酸的變化情況（如圖8）發(fā)現(xiàn)，檸檬酸含量在發(fā)酵第1天就達到較高值（1.255 g/L），之后都未有顯著性增加（p>0.05）。但蘋果酸和乳酸的含量在前4d一直呈顯著性增加（p<0.05），第4天蘋果酸和乳酸的含量分別為5.553、1.232 g/L。檸檬酸、蘋果酸和乳酸對大腸桿菌和沙門氏菌均有一定的抑制作用，同濃度情況下，乳酸的抑菌活性更強[23]。酸類對微生物的抑制作用不僅取決于氫離子濃度，還與酸根離子、未解離的分子及有機酸的種類有關[24]。蘋果酸在高酸性條件下不電離，其殺菌能力比中性時的離解態(tài)大100倍以上，同時，蘋果酸還具有抗氧化作用、螯合作用和高細胞膜透過作用[25]。因此，菌株A32高活性的抑菌作用與其較強的產(chǎn)酸能力和較高的蘋果酸、乳酸含量有關。

3 結論

本文以篩選自自然發(fā)酵椰子水中生長良好的乳酸菌為研究對象，以來自病死肉雞的沙門氏菌和大腸桿菌為指示菌進行抑菌活性初篩，得到抑菌活性較高的A32、L11與L51 3個菌株，再經(jīng)過耐酸耐膽鹽的復篩，獲取了一株優(yōu)良菌株A32，經(jīng)分子生物學鑒定其為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）。A32菌株在椰子水中能保持旺盛生長1 d～4 d，活菌數(shù)維持9 lg cfu/mL左右，這是該株發(fā)酵乳桿菌的一個獨特特性，使其以椰子水活菌制劑用作飼料添加劑成為可能。蛋白酶和高溫處理對其抑菌活性幾乎未產(chǎn)生影響，但調(diào)整pH值至5.0以上時其抑菌活性消失，其抑菌活性與其總酸含量呈顯著正相關關系（p<0.05），因此，推測A32在椰子水中所產(chǎn)抑菌物質(zhì)主要是有機酸類，具體種類主要有蘋果酸、檸檬酸和乳酸，其中蘋果酸含量占64%以上。發(fā)酵乳桿菌A32在椰子水中快速和高密度繁殖后較高活性的抑菌作用可能與其較高的總酸含量和較高蘋果酸含量有關，具體機制有待深入研究。