響應面法優化大果木姜子多糖提取工藝及抗氧化研究

魏晴，梁珊珊，3，孫慶文

（1.貴州中醫藥大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學 大果木姜子研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州中醫藥大學 植物多糖研究中心，貴州 貴陽 550025）

大果木姜子是樟科樟屬米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果實，主要分布在我國西南地區，如貴州、云南和廣西等地[1-2]，具有溫中散寒、理氣止痛的治療作用。可用于治療胃痛、腹痛、胸痛等疾病[3]。大果木姜子在貴州是一種藥食兩用的植物，大果木姜子油常用于調味、去腥。而近年來研究表明大果木姜子具有抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化的作用，以大果木姜子作為原料制成的中成藥在臨床中有很好的治療作用[3-4]。此外，大果木姜子常用于治療胃潰瘍，已經有數百年歷史，且效果顯著。

近年來研究主要集中在大果木姜子的藥理作用上，而對大果木姜子成分及提取工藝的研究未見報道[5-8]。傳統的提取方法存在耗時長、溶劑使用量大、工藝復雜等弊端，不利于產業化生產；而超聲輔助提取法具有操作簡單、超聲時間短、節省溶劑、提取效率高等優點，有利于大果木姜子的提取規模化和產業化生產。多糖被認為是生命科學中生物基材料（例如食品、化妝品、醫療設備和藥物）生產的關鍵成分[9]。在過去的幾十年中，多糖的生物活性已在生物化學和醫學中引起越來越多的關注。在各種天然抗氧化劑中，多糖通常具有強抗氧化活性。抗氧化作用是多糖的主要的生物活性之一，多糖可以作為新型潛在的抗氧化劑而被探索[10-11]。大果木姜子抗氧化活性的研究目前尚未報道[12]，因此本文采用響應面分析法優化大果木姜子多糖的提取工藝，并對多糖的抗氧化活性進行了研究，為大果木姜子深度開發提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DR3900臺式可見分光光度計：美國哈希公司；ES-A分析天平：天津市德安特傳感技術有限公司；BKE-1006HT小型超聲波清洗儀：山東博可超聲設備有限公司。

葡萄糖標準品、DPPH：美國默克公司。其它化學試劑均為分析純試劑。

1.2 材料

大果木姜子：采摘自貴州省黔南州羅甸縣壩碰村，經貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為樟科樟屬植物米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果實。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

將新鮮的大果木姜子置于陰涼處快速晾干，防止發霉，除去雜質，粉碎，過篩，即得大果木姜子粉末。

1.3.2 超聲輔助提取的單因素試驗

分別稱取大果木姜子粉末5 g，以液料比、提取功率和超聲時間為考察因素，考察不同單因素對多糖得率的影響。按照固定2個條件，考察另一個因素對多糖得率的影響程度，進行單因素試驗，測定多糖得率。固定液料比20∶1（mL/g），提取功率80 W，考察超聲時間在 25、30、35、40、45、50 min 時對多糖得率的影響；固定液料比 20∶1（mL/g），超聲時間 30 min，考察提取功率在 20、40、60、80、100、120 W 時對多糖得率的影響；固定提取功率80 W，超聲時間30 min，考察液料比在 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）時對多糖得率的影響。

1.3.3 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，對3個影響因素進行三因素三水平試驗，試驗方法參照文獻中方法進行設計[13]，表1為響應面因子水平及編碼。

表1 響應面設計試驗因素水平及編碼Table 1 Response surface design test factor level and coding

1.3.4 多糖得率的測定

通過參考文獻中的方法得到葡萄糖標準曲線為Y=7.999 8x+0.069 9，R2=0.999 6，樣品多糖得率的測定參考文獻[14]的方法。

1.3.5 大果木姜子多糖抗氧化活性研究

樣品前處理參考文獻[15]的方法，將溶液稀釋分別得到 40、80、160、320、640、1 280 μg/mL 的待測樣品溶液。大果木姜子對DPPH自由基清除能力[15-16]、對超氧陰離子自由基的清除作用[17-18]和對羥基自由基的清除作用[19]分別參考文獻中的方法進行測定。

1.4 數據處理

將測得的數據用SPSS 22.0軟件進行統計計算，運用Design-Expert 8.0.7軟件進行響應面優化分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

超聲時間對大果木姜子多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲時間對大果木姜子多糖得率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides

由圖1可知，固定液料比和提取功率，改變超聲時間，大果木姜子多糖得率在35 min達到最高值，多糖得率為5.54%，35 min后多糖得率顯著下降，可能是隨著超聲時間增加，大果木姜子中其他易溶于水的成分也被提取出來，使多糖在溶液中的占比下降，在45 min后水提液達到飽和，無更多成分被提取出來。

提取功率對大果木姜子多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取功率對大果木姜子多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction power on the yield of polysaccharides

由圖2可知，固定液料比和超聲時間，改變提取功率，大果木姜子多糖得率在80 W達到峰值，多糖得率為5.13%，當提取功率超過80 W后，多糖得率顯著下降，可能是隨著提取功率增大，超聲波對多糖連接的鍵起到破壞作用，使得多糖結構破碎，得率下降。

液料比對大果木姜子多糖得率的影響見圖3。

圖3 液料比對大果木姜子多糖得率的影響Fig.3 The effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharides

由圖3可知，固定超聲時間和提取功率，改變液料比，大果木姜子多糖得率在40∶1（mL/g）時達到最高值5.79%，當液料比超過40∶1（mL/g）后多糖得率顯著下降，可能原因是溶劑量過大，雜質分子被溶出，與多糖分子競爭溶出空間導致得率下降。

2.2 響應面方案與試驗結果

利用響應面軟件Design Expert 8.0.7設計三因素三水平的試驗，設計方案及結果見表2，測定多糖得率，得到回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面設計及結果Table 2 Response surface design and results

表3 響應面二次模型多糖得率的方差和回歸系數分析Table 3 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model

將自變量超聲時間（A）、提取功率（B）、液料比（C）與大果木姜子多糖得率（Y）的數據進行回歸擬合，得到二次多元回歸方程如下。

由表3可知，矯正系數R2Adj=0.956 3，預測復相關系數R2=0.963 7，預測相關系數R2（Pred）=0.956 3與預測復相關系數接近，說明擬合度比較好。失擬項P=0.5125>0.05，表明差異不顯著，變異系數C.V.%為3.94%，說明選擇的模型對該試驗的擬合度較好。由表3可知，3個因素對大果木姜子多糖得率的影響程度的大小順序為提取功率>超聲時間＞液料比。

2.3 響應面分析

當液料比固定時，提取功率與超聲時間相互作用見圖4。

圖4 超聲時間和提取功率對多糖得率響應面圖Fig.4 Response surface graph of ultrasonic time and extraction power versus polysaccharide yield

由圖4可知，在提取功率一定時，隨著超聲時間的變化，多糖得率先增大后趨于平緩，但響應面坡度不明顯；在超聲時間一定時，隨著提取功率的變化，多糖得率先增加再降低，響應面坡度較大。

當提取功率固定時，超聲時間和液料比相互作用見圖5。

圖5 超聲時間和液料比對多糖得率響應面圖Fig.5 Response surface graph of ultrasonic time and materialliquid ratio versus polysaccharide yield

由圖5可知，在液料比一定時，隨著超聲時間的變化，多糖得率變化不大，響應面坡度較平緩，先增加后趨于平緩；在超聲時間一定時，隨著液料比的變化，多糖得率先顯著增加后顯著降低，響應面坡度較陡峭。

當超聲時間固定時，提取功率和液料比相互作用見圖6。

圖6 液料比和提取功率對多糖得率的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the ratio of material to liquid and extraction power to the yield of polysaccharide

由圖6可知，在提取功率一定時，隨著液料比的變化，多糖得率先增大后顯著降低，響應面坡度較大；在液料比一定時，隨著提取功率的改變，多糖得率先顯著增加后降低，但降低的不明顯，響應面坡度較大，液料比和提取功率的交互作用顯著。

2.4 優化與驗證試驗

經響應面優化后最優條件為超聲時間35.12min、提取功率 80.64 W、液料比 40.16∶1（mL/g），多糖得率為5.99%。依據實際操作條件，將工藝修正為超聲時間35 min、提取功率80 W、液料比 40∶1（mL/g），得到實測多糖得率為5.92%。實際值與預測值之間相差較小，驗證了該響應面模型的有效性。因此，響應面法對大果木姜子多糖最佳優化工藝為超聲時間35 min、提取功率 80 W、液料比 40∶1（mL/g）。

2.5 大果木姜子多糖抗氧化活性結果

大果木姜子多糖抗氧化作用結果見表4。

表4 大果木姜子多糖抗氧化作用Table 4 Antioxidant effect of Cinnamomum migao H.W.Li polysaccharide

由表4可知，大果木姜子多糖對DPPH自由基的最大清除率為92.88%，經計算IC50為219.60 μg/mL。對超氧陰離子自由基最大清除率為91.89%，IC50為244.37 μg/mL。對羥基自由基的最大清除率為90.23%，IC50為258.26 μg/mL。因此，大果木姜子多糖有一定的抗氧化活性。研究表明，抗氧化療法可以在治療疾病中發揮關鍵作用。在潛在的藥物資源中，植物多糖是天然抗氧化成分，其應用歷史悠久，廣泛的可獲得性以及食用的副作用小，被認為對人體健康至關重要[20]。在實驗室研究和臨床研究中，多種疾病模型均顯示出植物多糖具有抗氧化性、抗炎癥、促進細胞活力、免疫調節和抗腫瘤的功能[21-22]。

多糖發揮抗氧化作用機制之一是由于多糖中含有大量的氫離子，氫可以與自由基結合形成穩定的自由基以終止自由基鏈反應。多糖還可以通過降低脂質過氧化（lipid peroxidation，LPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平發揮抗氧化作用[23]。此外，多糖還可以在體外與自由基發生反應，從而終止自由基鏈反應。通過增強過氧化氫酶（catalase，CAT）活性來增強抗氧化活性，催化H2O2的分解[24]。多糖可以防止谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）消耗，并增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。最后，多糖還可以刺激產生自由基酶的合成，建立氧化還原循環來保護細胞免受氧化應激的影響[25]。

3 結論

本試驗利用超聲輔助提取法獲得大果木姜子多糖，通過響應面法優化了多糖的提取工藝。研究表明最佳超聲輔助提取工藝條件為超聲時間35 min、提取功率 80 W、液料比 40∶1（mL/g），多糖得率為5.92%。此外，大果木姜子多糖還具有較強的抗氧化能力。

綜上所述，大果木姜子多糖可通過超聲方法優化提取，大果木姜子多糖還表現出較強的體外抗氧化能力，本研究為大果木姜子新產品的開發提供了理論依據。