響應面法優化超聲輔助提取桃金娘葉三萜工藝及抗氧化活性研究

銀慧慧，廖海洪，趙武，曾雪顏，童艷梅，劉偉*，姜源明，覃振華

（1.廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西壯族自治區畜牧研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005）

三萜類化合物（triterpenoids）[1-3]，又叫靈芝酸，是結構多樣的有機化合物，具有多種生理功能。三萜的基本骨架主要由6個異戊二烯單位組成，可形成20 000多種天然的三萜類化合物，以四環三萜和五環三萜兩大類為主[4-5]。三萜類化合物在自然界中分布廣泛，是中草藥中的有效成分，具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、殺軟體動物等生理活性。在天然植物中發現的熊果酸、齊墩果酸、白樺酯酸、羽扇豆醇、扁塑藤素和雷公藤紅素等三萜類化合物，已被研究發現具有顯著的抗腫瘤和抗炎等特性[6-8]。

桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa（Ation）Hassk]，又名當泥、山稔、崗稔等，是一種優良的野生植物資源，廣泛分布于東南亞國家[9-10]。桃金娘全株可入藥，含有黃酮類、鞣質類、揮發油類、多糖類、萜類等多種成分，其不同部位的藥用價值已被越來越多的學者研究[11-13]。其果實含有豐富的黃酮類、酚類、多糖類和其他活性成分[14]；根有祛風活絡、收斂止瀉的功效[15-16]；葉提取物具有收斂止瀉，止血的功效，可用于緩解急性胃腸炎、消化不良、痢疾等病癥[17-18]。現有對桃金娘葉中三萜成分的研究主要集中在三萜類化合物的結構等方面，已從桃金娘葉中分離出24個三萜類化合物主要為五環三萜皂苷元，五環三萜皂苷元的基本骨架可分為熊果酸、齊墩果酸、羽扇豆醇3種類型[19-21]。而桃金娘葉三萜提取及其抗氧化性研究未見報道。本研究以桃金娘葉為研究對象，采用超聲輔助提取法對桃金娘葉進行提取，采用單因素試驗和響應面法優化桃金娘葉三萜的超聲輔助提取工藝，并探討其抗氧化性，為桃金娘進一步的研究開發和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃金娘葉：采摘于廣西玉林，經廣西獸醫研究所孫建華研究員鑒定為桃金娘植物葉，在65℃下烘干，粉碎后過40目篩，備用；熊果酸對照品（含量99.3%）：中國食品藥品檢定研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、L-抗壞血酸（VC）：美國 Sigma-Aldrich 公司；甲醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸（均為分析純）：成都科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

TECAN model Infinite M200酶標儀：瑞士帝肯公司；HH-S4型恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司；SK7200HP型超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀：密理博中國有限公司；F160型粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司；CAP225D型（精度0.1 mg）電子天平：德國賽多利斯集團。

1.3 試驗方法

1.3.1 三萜提取工藝

桃金娘葉→烘干至恒重→粉碎→過篩→桃金娘葉粉末→提取溶劑→超聲輔助提取→離心→上清液定容→三萜測定

1.3.2 三萜含量測定

以熊果酸為標準品，采用香草醛-高氯酸法[22]在酶標儀下測定三萜含量。標準曲線的制作：準確稱取5mg熊果酸對照品，用甲醇溶解，配制熊果酸標準溶液濃度為 106.4 μg/mL。分別吸取標準溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6只帶塞試管中，80℃水浴蒸干，每管依次加入5%的香草醛冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，迅速搖勻后于70℃水浴15 min。結束后立即冷卻，加入冰乙酸5 mL，搖勻，分別吸取200 μL置于96孔板中，在545 nm處測定吸光度。以熊果酸濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=0.082 7x+0.031，R2=0.998 2。

準確稱取1 g桃金娘葉細粉置于100 mL具塞錐形瓶內，按一定液料比加入提取溶劑，在一定的超聲功率和一定的超聲時間條件下超聲（53 kHz，30℃）提取，離心過濾，收集上清液，取相應提取溶劑定容于50 mL棕色容量瓶中，充分搖勻后按標準曲線方法測定其吸光度并計算三萜含量。

式中：W為三萜含量，mg/g；C為樣品溶液三萜濃度，μg/mL；V為樣品提取液體積，mL；m為桃金娘粉末質量，g。

1.3.3 單因素試驗

在1.3.2的提取方法下，以三萜含量為指標，分別考察提取溶劑（60%乙醇、95%乙醇、100%甲醇、60%甲醇、乙酸乙酯）、液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）]、超聲時間（15、30、45、60、75、90 min）、超聲功率（262、280、298、316、334W）對提取桃金娘葉三萜含量的影響。

1.3.4 桃金娘葉三萜提取工藝優化

根據提取工藝的單因素試驗結果，采用Design Expert 8.0.6的Box-Behnken中心組合試驗設計原理[23]，以三萜含量為響應值，選擇A液料比、B超聲功率、C超聲時間為影響因素設計響應面試驗，對桃金娘葉三萜提取工藝條件進行分析和優化，試驗因素水平見表1。

表1 因素水平設計Table 1 Factor level design

1.3.5 桃金娘葉三萜DPPH自由基清除能力研究

稱取4 mg DPPH固體試劑，甲醇溶解并定容至100 mL，配制成40 μg/mL的DPPH溶液，避光保存備用。精密稱取5 mg VC置于不同棕色容量瓶中，經甲醇溶解并定容至100 mL，稀釋配制成濃度為29.00 μg/mL的陽性對照溶液。準確吸取不同體積最優條件的提取溶液于96微孔板中，再加入100 μL DPPH溶液，輕輕混勻后用甲醇補足體積至200 μL，避光反應30 min，在545 nm下測定吸光度，吸光度為As；空白組以等體積的甲醇代替DPPH溶液，其吸光度為Ab，對照組以等體積的甲醇代替提取溶液，吸光度為Ac。清除率按下式計算。

1.4 數據處理

每組試驗處理設置3個重復，結果用平均值±標準差表示，采用Excel 2016和Design expert 8.0.6軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溶劑對桃金娘葉三萜含量的影響

固定液料比 30∶1（mL/g），加入不同提取溶劑，考察不同提取溶劑對三萜含量的影響，結果見圖1。

圖1 不同提取溶劑對桃金娘葉三萜含量的影響Fig.1 Effect of different solvent on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由圖1可知，乙酸乙酯作為提取溶劑時，三萜含量最大。因此選擇乙酸乙酯進行下一步提取研究。

2.1.2 液料比對桃金娘葉三萜含量的影響

固定提取溶劑為乙酸乙酯，考察不同液料比對三萜含量的影響，結果見圖2。

圖2 液料比對桃金娘葉三萜含量的影響Fig.2 Effect of liquid material ratio on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由圖2可知，當溶劑體積逐漸增大時，加大了提取溶劑對物料的接觸，降低了液料間的黏稠度，有利于超聲波的空化效應，使得桃金娘葉三萜的含量逐漸增高；當液料比超過40∶1（mL/g）時，三萜含量呈現下降趨勢，可能是由于提取溶劑達到一定用量后，三萜已經基本提取完全，此時繼續增加提取溶劑的量，不僅使單位提取液中三萜濃度降低，并且加大了試劑的消耗，因此綜合考慮，選擇液料比40∶1（mL/g）進行提取。

2.1.3 超聲功率對桃金娘葉三萜含量的影響

不同超聲功率對三萜含量的影響見圖3。

圖3 超聲功率對桃金娘葉三萜含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，三萜含量不斷增加，當超聲功率為298 W時，三萜含量達到最大值，繼續增加超聲功率時，含量下降。這是由于超聲功率的增加，超聲作用加強，空化泡的運動越強烈，而隨著超聲功率的進一步增加，加速了提取溶劑的流動，從而影響三萜物質的溶出，此外，功率越大，產生的熱效應也可能會破壞三萜的結構，使得三萜含量下降。故超聲功率選擇298 W進行下一步試驗。

2.1.4 超聲時間對桃金娘葉三萜含量的影響

不同超聲時間對三萜含量的影響見圖4。

圖4 超聲時間對桃金娘葉三萜含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由圖4可知，隨著超聲時間的延長，三萜含量逐漸增高，當超聲時間超過75 min，含量增加不明顯，可能是超聲時間的延長，熱效應的增加、雜質的溶出增加，從而影響了三萜的提取效果。因此，綜合考慮選擇75 min為單因素試驗的最優超聲時間。

2.2 響應面法優化試驗結果

2.2.1 建立模型

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken組合設計原理，以三萜含量為響應值（Y），利用Design Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗，對三萜的提取條件進行優化，共進行17個試驗點，其中包含12個析因點和5個零點試驗，12個析因點試驗用以考察液料比、超聲功率、超聲時間3個因素對三萜含量的影響是否顯著，5次零點試驗用作誤差估計[24-25]。試驗設計和結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案與結果Table 2 Test design and results of response surface methodology

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗

利用軟件對試驗結果進行二次多項式回歸擬合，對表2的數據進行方差分析后得到模型的二次多項式回歸方程為Y=13.68+0.56A-0.66B+0.28C-0.12AB+0.53AC-0.21BC+0.74A2-2.38B2+0.62C2。響應面多元二次模型方差分析結果見表3。

表3 響應面二次模型方差分析Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

由方差分析可知，模型的P＜0.000 1，表明試驗所采用的二次模型顯著，具有統計學意義。失擬項P值為0.240 1＞0.05，差異不顯著，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

從表3可看出，一次項中，A液料比對三萜含量的線性效應呈現極顯著（P＜0.01），B超聲功率對三萜含量的影響差異極顯著（P＜0.01），C超聲時間對三萜含量的線性效應不顯著（P＞0.05），二次項中，B2影響高度顯著（P＜0.001），A2、C2影響極顯著（P＜0.01），交互項中AC 影響顯著（P＜0.05），AB、BC 影響不顯著（P＞0.05）。此模型校正模型的相關系數R2值為0.974 6，決定系數R2Adj值為0.941 9，說明選用的模型與實際情況擬合較好、誤差小，能較好反映出各因素與桃金娘葉三萜含量之間關系。由F值可知，在試驗范圍內各因素對三萜含量的影響大小依次為B（超聲功率）＞A（液料比）＞C（超聲時間）。

2.2.3 交互項對桃金娘葉三萜含量的影響

對A液料比、B超聲功率、C超聲時間3個因素進行兩兩交互作用分析，對其作響應面圖和相應等高線圖，結果見圖5。

圖5 響應面法立體分析圖和相應等高線圖Fig.5 Response surface graph and corresponding contour graph

圖5能夠直觀地反映各因素交互作用對桃金娘葉三萜含量響應值的影響，由圖5可以看出，隨著液料比的增加，三萜含量呈現升高趨勢，而超聲功率的增大，含量先升高后降低；三萜含量隨著液料比和超聲時間的增加而增加；隨著超聲功率的增加，三萜含量先升高后降低，隨著超聲時間的增加含量升高。A液料比和C超聲時間的響應面的極高值出現在等高線的內部，說明A與C的交互作用對響應值的影響是顯著的，A和B、B和C對三萜含量的影響均不顯著，這與方差分析結果一致。

2.2.4 最佳工藝與驗證

通過最優結果分析，最佳的提取條件為液料比為 50∶1（mL/g），超聲功率 294.26 W，超聲時間 90 min，預測含量為16.54 mg/g。考慮在實際操作上的方便性，將各因素修正為液料比50∶1（mL/g）、超聲功率294 W，超聲時間90 min。在此條件下，對桃金娘葉三萜進行3次平行提取，含量為15.72 mg/g，與預測值基本相符。說明此模型能夠很好地模擬桃金娘三萜提取的實際情況，模型有效。

2.3 超聲輔助提取桃金娘葉三萜與其他方法的比較

本研究同時還采用了傳統溶劑浸提法和水浴提取法對桃金娘葉三萜進行提取，得到的試驗結果如表4所示。

由表4可知，超聲輔助提取得到的三萜含量明顯優于傳統浸提法和水浴提取法。

2.4 桃金娘葉三萜DPPH自由基清除能力測定

超聲輔助提取的桃金娘葉三萜樣品DPPH自由基清除能力如圖6所示。

圖6 DPPH自由基清除能力Fig.6 Result of DPPH free radical scavenging activity

提取的三萜樣品對DPPH自由基的清除效果明顯，在濃度 0.77 μg/mL 至 12.27 μg/mL 范圍內，隨著濃度的增加其自由基清除率逐步遞增。與陽性對照VC相比較，三萜樣品在較低濃度下時對DPPH自由基清除能力低于VC，而隨著三萜樣品濃度的增加，其清除能力逐漸趨近于VC。桃金娘葉三萜樣品和VC對DPPH自由基的 IC50分別為 1.284 μg/mL 和 0.639 μg/mL。

3 結論

由單因素試驗確定了桃金娘葉三萜提取溶劑為乙酸乙酯，并通過響應面試驗研究液料比、超聲功率、超聲時間3個因素對三萜含量的影響。結果表明，在試驗范圍內各因素對三萜含量的影響大小依次為超聲功率＞液料比＞超聲時間，液料比和超聲功率對三萜含量的影響較大。三萜最佳提取工藝條件為液料比50∶1（mL/g）、超聲功率 294 W，超聲時間 90 min。在最優的提取條件下，桃金娘葉三萜的平均含量為15.72mg/g，優于傳統浸提法和水浴提取法。在桃金娘葉三萜濃度為12.27μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達92.52%，清除能力逐漸趨近于VC，說明該方法提取的三萜類物質具有較好的抗氧化性，可用于桃金娘葉中三萜的提取。