14株乳酸菌產酸抗鹽特性研究

羅麗蓉 李宏洋 李升

摘 要：乳酸菌特別是乳桿菌是泡椒發酵過程中的風味微生物。為探究乳酸菌的產酸特性，研究選取從發酵辣椒產品中分離篩選的14株乳酸菌作為試驗材料。通過測OD值、pH、消耗堿的量、活菌數，對14株乳酸菌的生長繁殖、產酸強弱、總酸度、抗鹽性進行分析比較。結果表明，編號為5-1（Lactobacillus plantarum）和29-1（Lactobacillus alimentarius） 的2株菌生長性能好、產酸能力強且適合低鹽環境生長，因此可作為純種強化低鹽發酵泡椒的優良菌種。

關鍵詞：乳酸菌;生長性能;pH;產酸特性;抗鹽性

中圖分類號：TS201.3

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）06-0076-05

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.06.011

Abstract：Lactic acid bacteria，especially Lactobacillus，are the flavor microorganism in the fermentation process of pickled pepper.In order to explore the acid-producing properties of lactic acid bacteria，14 strains of lactic acid bacteria isolated and screened from fermented pepper were selected as experimental materials.The growth and reproduction，acid production strength，total acidity and salt resistance of 14 strains of lactic acid bacteria were analyzed and comparedby measuring the OD value，pH，consumption of the alkali and viable count.The results showed that the strains numbered 5-1（Lactobacillus plantarum） and 29-1（Lactobacillus alimentarius） had good growth performance，strong acid production capacity，and were suitable for low salt environment，so they could be used as excellent strains of pure strain to enhance low salt fermentation of pickled pepper.

Keywords：lactic acid bacteria;growth characteristic;pH;acid production;salt resistance

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類細菌的總稱，這類細菌都能夠發酵糖類[1]產生乳酸（主要產物），其共同特征是過氧化氫酶陰性、革蘭氏染色陽性[2]。乳酸菌可分為乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬等[3]，其中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬與人類身體健康有密切聯系[4-5]。

乳酸菌能促進動物生長[6]，調節胃腸道菌群，維持微生態平衡[7]，從而改善腸道功能[8]，提高食物消化率[9]和生物效價，防止便秘[10]，降低血清膽固醇和血脂[11]，預防心臟病，控制內毒素，抑制腸道內腐敗微生物的生長[12]，促進乳糖消化，調節機體免疫力，延緩機體衰老和抗腫瘤等作用[13]。

乳酸菌是酸奶、泡菜、酸菜、乳制品的主要發酵劑。如今，乳酸菌發酵食品被人們廣泛食用，人們對其健康也越來越關注。乳酸菌發酵食品的生產應引起廣泛的重視，同時乳酸菌的發展對發酵食品專業化和安全化有積極的推動作用[14]，對豐富和挖掘傳統菌劑具有重要的現實意義。因此篩選對微生物發酵有益的菌種已經成為當前研究發展的熱門趨勢。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

待測14株乳酸菌為實驗室保藏菌種，有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、希氏乳桿菌（Lactobacillus higardii）、納木雷氏乳桿菌（Lactobacillus namurensis）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensis），編號為5-1（Lactobacillus plantarum）、16-1（Lactobacillus plantarum）、10-1（Lactobacillus alimentarius）、19-2（Lactobacillus alimentarius）、25-1（Lactobacillus alimentarius）、28-1（Lactobacillus alimentarius）、29-1（Lactobacillus alimentarius）、16-4（Lactobacillus pentosus）、19-1（Lactobacillus pentosus）、21-3（Lactobacillus pentosus）、5-4（Lactobacillus higardii）、9-1（Lactobacillus namurensis）、9-3（Lactobacillus paracasei）、21-4（Lactobacillus harbinensis）。

1.1.2 培養基

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二氨2 g，吐溫80 mL，磷酸氫二鉀2 g，硫酸錳0.25 g，硫酸鎂0.58 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH（6.2～6.6），121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與試劑

儀器：PHS-3C酸度計、高壓蒸汽滅菌鍋、振蕩培養箱、超凈工作臺、分光光度計、堿式滴定管、4 ℃冰箱。

試劑：酚酞、0.1 mol/L的鹽酸、pH=4.0的緩沖液。

1.2 試驗方法

OD值測定方法：取已滅菌的MRS液體培養基3 mL作為空白對照，將已活化的14株菌液將其OD值稀釋至0.03左右，然后按3%的接種量，往80 mLMRS液體培養基中接入待測菌株，37 ℃振蕩培養。用分光光度計每2 h測定菌懸液在波長680 nm處的OD值。

pH值測定方法：用 PHS-3C精密酸度計，每2 h測各菌液的pH值。

酸度測定方法：每2 h取菌液，按酸堿滴定消耗堿的體積來測定乳酸菌的酸度。以吉爾涅爾度（°T） 來表示乳酸菌的酸度，即每100 mL發酵液消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液，記為°T[15]。

抗鹽性測定方法：將挑選的7株菌活化并進行鹽敏感測試，按3%的接種量分別接種于0% NaCl、1% NaCl、3% NaCl、5% NaCl的MRS液體培養基，以37 ℃、180 r/min于振蕩培養箱培養2 h，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的梯度進行稀釋，然后取10-6的菌液0.1 mL分別均勻涂布于含空白、1% NaCl、3% NaCl、5% NaCl的MRS固體培養基，在恒溫培養箱培養48 h，最后采用平板計數法計算活菌數目并對數據進行分析比較，以此來確定各乳酸菌生長的最適鹽濃度及抗鹽能力。

根據測定菌懸液的OD值、pH值、酸度和活菌數來制作乳酸菌生長曲線圖、pH值變化趨勢圖、酸度變化趨勢圖、抗鹽統計表。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

14株乳酸菌生長曲線的測定結果如圖1所示。可見，14株菌的OD值在培養初始沒有明顯的變化，待到6 h之后14株乳酸菌幾乎都開始大量生長繁殖并且進入對數生長時期，但培養20 h后各菌株的生長逐漸變慢，然后到達穩定期。

由表1可知各菌株之間生長速度沒有顯著差異（F=1.038，P=0.418>0.05），但不同時間乳酸菌的生長速度有顯著差異（F=67.879，P=0<0.05）。在14株乳酸菌中，其中5-1、29-1這2株菌的對數生長期開始的最早，培養4 h后開始，從4～16 h這2株菌都快速增長，16～48 h生長速度幾乎一直保持不變。而19-1菌株的對數生長開始的較晚，培養10 h后進入對數生長期且一直持續到48 h，說明此菌的適應時間較長，對于要縮短發酵周期的試驗，顯然是劣勢菌。總的來說，不同的乳酸菌耐酸能力有所不同，因此不同乳酸菌的生長繁殖也表現出一定的差異性。對不同時間的14株菌的生長狀況進行多重比較，結果表明5-1、29-1這2株菌生長性能較好，而9-1、16-1、16-4、21-4、25-1這5株菌的生長性能較差，因此，篩選出5-1和29-1這2株生長繁殖旺盛的菌株。

2.2 乳酸菌的pH變化

pH在一定程度上可反映乳酸菌的產酸性能，14株乳酸菌的pH變化如圖2所示。在培養早期（0～4 h）14株乳酸菌的pH變化不明顯，4 h后14株乳酸菌pH開始下降，在4～18 h pH快速下降，即處于對數生長期，同時此階段菌體生長快速、代謝加快。表明乳酸菌開始大量繁殖，產酸量迅速升高，同時菌體的代謝速度也加快。在18～24 h時，pH下降變緩，產酸能力減弱，表明細菌代謝減慢，菌體生長已進入穩定期。由表1可知，不同乳酸菌菌株pH變化差異不顯著（F=1.407，P=0.162>0.05）。不同時間乳酸菌pH變化差異顯著（F=63.751，P=0<0.05）。

對不同時間的14株乳酸菌的pH進行多重比較，如圖2所示，5-1、29-1這2株乳酸菌的pH在4～16 h下降較快、持續時間長。在18～48 h，pH幾乎不變。其中5-1菌株的pH在4～18 h都下降較快，且5-1菌株的pH曲線圖最陡，因此該階段5-1菌株產酸速度和產酸量最大且明顯優于其他菌株，16 h后開始進入穩定期，產酸速度減小，但產酸量還在增加。5-4菌株的pH下降較快的時間段為培養后的10～26 h，該菌株用于微生物發酵將延長發酵時間。29-1在4-16 h期間pH下降的較快，之后便進入穩定期，同時剩余乳酸菌的pH也有所下降，但下降速度較緩慢。分析發現整個過程幾乎與乳酸菌的活菌數變化情況大體一致。

2.3 乳酸菌酸度變化

酸度在一定程度上也能反映菌株的產酸性能。酸度越大，產酸性能越強，環境的pH也會隨之降低。14株乳酸菌48 h內酸度變化如圖3所示，可看出14株乳酸菌的酸度變化有一定差異性。總的來看，14株乳酸菌在4～36 h產酸速度逐漸增加，此階段處于乳酸菌對數生長期。在36～48 h，乳酸菌的產酸量基本保持不變，菌體的生長從對數期進入到穩定期，之后進入衰亡期。同時，由表1可知，14株菌酸度變化有顯著差異（F=7.18，P=0<0.05），不同時間各菌株的產酸量也存在顯著差異（F=133.381，P=0<0.05）。

對不同時間各株乳酸菌酸度進行多重比較，可以看出5-1、28-1、29-1這3株乳酸菌的產酸能力較強，且產酸量較高的時間段為8～36 h。其中5-1菌株產酸量從6～48 h不斷上升并持續到48 h之后，若要將5-1作為優勢菌株，一定要控制好該菌株的后酸化。9-3菌株從8～36 ?h產酸速度快速增加，36～48 h產酸速度緩慢增加，且一直有增加的趨勢。28-1菌株是從4～14 h產酸量快速增加，14～18 h產酸量幾乎不變，18～48 h產酸量又快速增加。29-1菌株從4～36 h產酸量不斷增加，36～48 h產酸量幾乎不變。從圖中也可看出，其余8株菌的產酸能力相對較弱。14株菌在不同的時間產酸量各不相同，因此應根據實際需要選擇恰當的時間添加乳酸菌株。

2.4 鹽敏感測試

不同菌株在不同鹽濃度中的活菌變化情況如表2。

由表2可以看出，這7株乳酸菌的鹽耐受能力由高到低依次為：28-1>21-3>5-1>16-4>29-1>19-2>10-1。已有研究表明：H+-ATPase在乳酸菌株處于不良鹽環境下時，可以有效調節滲透壓，因此對菌株的耐鹽性有重要作用。當細胞處于逆環境時，要調節細胞內環境的滲透壓，必然需要質子泵為跨膜運輸提供動力，一般認為陽離子的跨膜調節是通過H+-ATPase來完成[16]，從而來調節細胞膜兩側的滲透壓。可見，菌株的耐鹽性與H+-ATPase酶活有密切關系，因此不同菌株表現不同的耐鹽性是合理的[17]。

3 結論與討論

本試驗有7個種的乳桿菌，其中植物乳桿菌的產酸性能最強，植物乳桿菌也常存在于發酵的蔬菜和果汁中[18]，是傳統醬腌菜中的優勢菌[19]。人體腸道常見的乳桿菌，如植物乳桿菌，它對調節人體健康有積極作用，同時也是目前研究和關注的熱點之一[20]。乳酸菌除了具有產酸性能外，還具有降解亞硝酸鹽、富硒性能、酸應激性、抑菌性、預防貧血等眾多性能[21]，但產酸性能是評價乳酸菌優良的基本指標，因此本試驗測了14株菌的生長曲線、pH、酸度和抗鹽性。

本試驗通過測OD值得出5-1、29-1在4～16 h時，菌體數目迅速增加，這可能是由于發酵初期，培養液酸度較低，環境非常適合乳酸菌的生長[22]。結果表明，若將這2株菌用于食品發酵中可能縮短發酵時間提高發酵的效率。通過測pH得出5-1、29-1這2株乳酸菌具有明顯的優越性。結果表明，若有較強的生長繁殖能力，那么也會導致其有較強的產酸能力，因此可通過控制菌體的數量的來控制發酵食品的酸度和后酸化，同時解決后酸化問題是當前乃至未來需關注的熱點問題。通過測發酵液的總酸度得出5-1、29-1這2株菌在4～36 h產酸速度迅速增加，隨著乳酸含量升高，酸度上升變快[23]。在36～48 h時，5-1、29-1這2株乳酸菌的生長從穩定期進入衰亡期，這可能是由于發酵中期和后期，隨著乳酸菌的不斷繁殖，酸度不斷升高，導致高酸度環境對乳酸菌的生長有不同程度的抑制作用[24]。通過對平板活菌數的記錄、統計和分析，得出5-1、29-1適合低鹽環境生長，而21-3、28-1適合在高鹽環境。高鹽食品會導致高血壓、心腦血管等疾病，因此可得出5-1、29-1是低鹽純種強化發酵的最佳菌株。

綜上所述，通過對14株乳酸菌產酸指標的測定，得出5-1（Lactobacillus plantarum）和29-1（Lactobacillus alimentarius）這2株菌的生長繁殖能力強、產酸能力強且適合低鹽環境生長，因此可將這2株優良菌株用來作為發酵泡椒、酸奶、泡菜等發酵食品的優良菌種，同時這2株菌也可作為進一步研究與應用的備選菌株，深入探索和挖掘其產酸的調控機制和產生對人體健康有益的物質。

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