基于高分辨質(zhì)譜的超高溫滅菌乳和復(fù)原乳判別技術(shù)研究

□ 李 超

（西部第三方檢測(cè)集團(tuán)（寧夏）有限公司食品事業(yè)中心，寧夏 銀川 750001）

牛奶，因?yàn)槠涮厥獾目诟泻拓S富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深得人們的青睞。而市場(chǎng)上最多見(jiàn)的牛奶大多采用兩種殺菌方式：巴氏殺菌和超高溫殺菌。巴氏殺菌常采用72～85℃的加熱殺菌溫度，保質(zhì)期較短，為3～5天。而超高溫滅菌乳加熱殺菌溫度為130～150℃，常溫下可儲(chǔ)藏30天以上。如果是奶粉的話，其加工過(guò)程溫度更高，正常情況下，溫度會(huì)高于150℃，因此其內(nèi)在的物質(zhì)必定會(huì)遭到破壞［1］。

復(fù)原乳是指被大量破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的奶粉中再勾兌一定量的水或者牛奶最后制得的乳制品［2］。近年以來(lái)，國(guó)民對(duì)乳制品的消耗量顯著大幅度提升，不免有不少不法商販?zhǔn)褂脧?fù)原乳以次充好，在市場(chǎng)上流通。國(guó)家相關(guān)部門研究顯示，這種現(xiàn)象存在還是很廣泛的，雖然這些以次充好的復(fù)原乳不會(huì)對(duì)人體有傷害，但是難免會(huì)影響人體營(yíng)養(yǎng)攝入［3］。實(shí)際操作檢驗(yàn)中，由于兩者均為牛乳制成的制品，實(shí)際成分檢測(cè)出來(lái)差異很小，加大了檢測(cè)人員的檢測(cè)難度。為了維護(hù)消費(fèi)者合法權(quán)益，保障牛奶的質(zhì)量，尋找準(zhǔn)確、高效檢測(cè)復(fù)原乳的方法意義重大［4］。

本文實(shí)驗(yàn)中，我們利用脂質(zhì)組學(xué)方法，通過(guò)高分辨質(zhì)譜，研究超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的差異性脂質(zhì)。通過(guò)結(jié)合自建的譜庫(kù)，找到15種差異性脂質(zhì)［5-7］。隨后，利用找到的差異性脂質(zhì)，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立了區(qū)別兩種乳的偏最小二乘方差判別分析模型（PLS-DA）。最后，通過(guò)用10種盲樣檢測(cè)，證明該模型準(zhǔn)確度高，可以用來(lái)區(qū)分超高溫滅菌乳和復(fù)原乳［8-10］。

一、實(shí)驗(yàn)材料及方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

從當(dāng)?shù)馗鞔蟪匈?gòu)買各個(gè)品牌生產(chǎn)日期不一致的5種超高溫滅菌乳、5種全脂奶粉。見(jiàn)表1。

表1 牛奶樣品信息

（二）實(shí)驗(yàn)方法

利用杜馬斯定氮法，測(cè)定各奶粉中蛋白含量，并按蛋白含量為3.0g/100mL將各奶粉溶于63℃熱水中，并置于63℃恒溫水浴鍋中，恒溫30min，配成復(fù)原乳。

量取0.2mL牛奶于10mL玻璃離心管中，加入1mL超純水，室溫下渦旋5min，加入3mL氯仿∶甲醇（2∶1，V/V），室溫下渦旋10min，于4℃離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心15min。將離心后的下層液體轉(zhuǎn)移至新的10mL玻璃離心管中，進(jìn)行氮吹。氮吹后重溶于500μL氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）。進(jìn)樣前，將樣品稀釋20倍，放入進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）脂質(zhì)定性分析

在正、負(fù)離子模式下對(duì)超高溫滅菌乳和復(fù)原乳樣品進(jìn)行檢測(cè)。隨后，利用LipidSearch對(duì)兩種乳脂質(zhì)峰進(jìn)行提取，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。通過(guò)匹配，我們對(duì)自建的脂質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行定性分析。

（二）超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中差異性脂質(zhì)的鑒定

為了篩選出超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中差異性脂質(zhì)，我們采用正交偏最小二乘方差判別分析方法（OPLS-DA）來(lái)區(qū)分超高溫滅菌乳和復(fù)原乳。結(jié)果顯示通過(guò)該方法，能很好地區(qū)分兩種乳。見(jiàn)表2。

表2 15種表征因子的分子式、保留時(shí)間及離子信息

VIP值可評(píng)價(jià)正交偏最小二乘方差判別分析模型中變量的重要程度，其值越大，代表該變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)率越大。當(dāng)VIP值大于1.5，證明變量對(duì)分類有顯著貢獻(xiàn)。因此，選取正離子模式下和負(fù)離子模式下VIP值大于1.5的各9種和6種脂質(zhì)，作為表征因子來(lái)區(qū)分超高溫滅菌乳和復(fù)原乳。

結(jié)果顯示，超高溫滅菌乳中，PE（16：0/18：1），PE（18：0/18：1），PE（18：1/18：1），PE（18：1/20：3），PE（18：1，14：0），TG（6：0/14：1/18：3），TG（15：0/14：0/10：0），PC（18：0/18：1），LPE（18：0），CL（18：1/18：0/18：0/18：1），16-羥基棕櫚酸，12-羥基月桂酸的含量顯著高于復(fù)原乳。然而，TG（16：0/8：0/18：1）、TG（6：0/18：0/18：1）和PE（16：0/18：2）的含量卻低于復(fù)原乳。

三、結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用相關(guān)生物學(xué)及數(shù)學(xué)模擬等方法，同時(shí)采用高分辨質(zhì)譜觀察了復(fù)原乳和其他牛奶之間的差異性脂質(zhì)。最終15種脂質(zhì)被篩選出來(lái)作為區(qū)別兩種乳的表征因子。其中，超高溫滅菌乳中PE（16：0/18：1），PE（18：0/18：1），PE（18：1/18：1），PE（18：1/20：3），PE（18：1，14：0），TG（6：0/14：1/18：3），TG（15：0/14：0/10：0），PC（18：0/18：1），LPE（18：0），CL（18：1/18：0/18：0/18：1），16-羥基棕櫚酸，12-羥基月桂酸的含量顯著高于復(fù)原乳。然而，TG（16：0/8：0/18：1）、TG（6：0/18：0/18：1）和PE（16：0/18：2）的含量卻低于復(fù)原乳。根據(jù)這15種脂質(zhì)，最終建立了判辨模型，結(jié)果顯示該方法實(shí)用性和精確性均較高。