基于響應面的紅曲色素液態發酵培養基優化

王芳慧，張靜，王昌祿，李貞景，楊華，劉歡歡

(天津科技大學 食品工程與生物技術學院/省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457)

紅曲霉(Monascus)又名丹曲[1]，是一種小型絲狀腐生真菌，是目前世界上能產食用色素的重要微生物之一，在我國已有1000多年藥食兩用的歷史，可促進消化和血液循環[2]。紅曲色素作為一種安全、無毒的天然食用色素，是由多種物質組成的聚酮類混合物，屬于紅曲霉的次級代謝產物，目前已被鑒定的紅曲色素多達上百種，其中研究最多的是6種醇溶性色素[3]，包括2種紅色素：紅斑紅曲胺(Rubropunctamine，R1)和紅曲玉紅胺(Monascorubramine，R2)；2種黃色素：紅曲素(Monascin，Y1)和紅曲黃素(Ankaflavin，Y2)；2種橙色素：紅斑紅曲素(Rubropunctatin，O1)和紅曲玉紅素(Monascorubrin，O2)[4-6]。紅曲色素作為天然色素，相較于化學合成色素具有無毒副作用的優點，同時具有降膽固醇、降血脂、抗腫瘤等功能[7-9]，在食品行業、醫療保健品及化妝品行業具有廣闊的應用前景[10-11]。目前，紅曲色素已被廣泛應用于肉制品、調味品、釀酒等行業。隨著紅曲色素在各行業的推廣，人們對其的需求量越來越大，提高紅曲色素產量成為亟待解決的問題。

紅曲霉發酵產紅曲色素的傳統工藝為固態發酵，操作簡單，成本較低，但是衛生條件難以控制，菌種純度低，勞動強度大[12-13]。與固態發酵相比，紅曲液態發酵生長周期短，雜質少。發酵培養基是菌體生長和產物合成的基礎，適宜的培養基配方可以使目標產物產量少，產品質量穩定[14-16]，具有更大的優勢，但是液態發酵紅曲色素產量較低，使其發展受到大幅度提高，因此高效、準確的培養基優化方法就顯得尤為重要。

響應面方法(RSM)是一種在單變量和多變量系統中尋求最優條件的有效統計方法，中心組合設計(CCD)實驗是響應面分析法[17]中的一種，適用于多因素多水平實驗，有連續變量存在，可作為一種優化方法。CCD實驗是將體系的響應值作為一個或多個因素的函數，用圖形技術將這種函數關系表示出來，以供實驗設計中選擇最優化條件。本實驗運用Plackett-Burman實驗(PB實驗)[18]篩選對響應值具有顯著影響的因素后，即用CCD實驗對紅曲霉發酵培養基進行優化，以提高紅曲色素產量。

續 表

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1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉M-7：保藏于天津科技大學食品科學與工程學院發酵食品與微生物資源開發研究室。

1.1.2 試劑

瓊脂粉、可溶性淀粉：分析純，北京索萊寶生物科技公司；甲酸、乙腈：色譜純，天津康科德有限公司；無水乙醇：分析純，天津康科德有限公司；土豆、大米粉：食品級，市售；其余試劑：分析純，購自天津市化學試劑一廠。

1.1.3 培養基

固體培養基：土豆葡萄糖培養基(PDA)。

種子培養基：大米粉30 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH自然。

基礎發酵培養基：葡萄糖50 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L和FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 6。

以上培養基均在0.1 MPa，在121 ℃條件下濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZQWY-200N型振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；TDZ5-WS型低速多管架自動平衡離心機 長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；LRH-250-GⅡ型恒溫培養箱 廣東省醫療器械廠；KQ8200B型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 菌株培養與發酵

固體培養：菌種劃線接種于固體斜面后，在28 ℃條件下培養4～5 d。

種子培養：用10 mL無菌水洗斜面得孢子懸浮液，移取1 mL至裝有40 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，置于30 ℃，180 r/min的搖床中培養48 h。

發酵培養：將種子液轉接到發酵培養基中，接種量為10%，裝液量為40 mL/250 mL，搖床溫度30 ℃，轉速180 r/min，培養4 d。

1.4 分析方法

菌體量的測定：取10 mL發酵液在3800 r/min條件下離心15 min，棄上清液，將菌體沉淀于60 ℃烘箱烘干至恒重后稱重，計算菌體量。

紅曲色素含量的測定：紅曲色素含量的測定采用高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX SB-C18，流動相A為超純水(含0.1%(V/V)甲酸)，流動相B為乙腈(色譜純)，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫為25 ℃。提取方法：取發酵液10 mL于離心管中，在3800 r/min條件下離心15 min，棄上清液，加入5 mL 70%(V/V)乙醇混勻后(此處計為濃縮2倍)，置于60 ℃水浴鍋中水浴1 h，水浴期間不定時上下翻動。水浴結束后超聲30 min，以3800 r/min離心15 min，得紅曲色素乙醇溶液。根據濃度(X)與峰面積(Y)建立標準曲線并計算色素含量(mg/L)。

1.5 實驗設計方法

1.5.1 PB實驗

使用Minitab 18軟件進行N=21的PB實驗設計，對可用于發酵培養基的2種碳源和5種氮源共7個因子進行研究，以葡萄糖和淀粉取代原始培養基中的葡萄糖組分，以硝酸鈉、硫酸銨、尿素、氯化銨和硝酸銨取代硫酸銨組分。各因子分別取高(1)和低(-1)兩個水平。以6種醇溶性紅曲色素(R1、R2、Y1、Y2、O1、O2)產量和菌體量(DCW)為響應值，仿行數為2。各因子水平設置見表1。

表1 PB實驗各因子水平值Table 1 The factors and levels of PB experiment g/L

1.5.2 最陡爬坡實驗設計

根據PB實驗結果，選擇對7種響應值影響顯著的因素進行下一步優化，并以此作為CCD實驗中設置中心水平的參考。各組因子水平設計見表2，每組3個平行。

表2 最陡爬坡實驗中各因子水平值Table 2 The level value of each factor of the steepest climbing experiment g/L

1.5.3 CCD實驗設計

以最陡爬坡實驗的最優條件為參考，綜合考慮6種紅曲色素產量和菌體量確定CCD實驗中各因素的中心值，使用Minitab 18軟件設計實驗。各因子水平見表3。將各組6種色素產量和DCW數據輸入軟件后，使用響應優化器功能對所有響應值進行優化，得到最適培養基結果，發酵驗證。

表3 CCD實驗各因子水平值Table 3 The factors and levels of CCD experiment g/L

2 結果與分析

2.1 PB實驗結果

對發酵培養基的2種碳源——葡萄糖、淀粉和5種氮源——硝酸鈉、硫酸銨、尿素、氯化銨、硝酸銨進行顯著因素篩選，考察其對6種紅曲色素產量及DCW的影響，發酵結果見表4。用Minitab 18對實驗結果進行統計學分析，分析結果見表5。

表4 PB實驗結果Table 4 The PB experimental results

表5 PB實驗中各因素效應值Table 5 The effect values of various factors of the PB experiment

由表5可知，尿素對7種響應值均有顯著影響，對紅曲色素R1、R2表現為正效應，其余為負效應；葡萄糖除了對紅曲色素O2和DCW的影響不顯著外，對其他5種響應值的影響均顯著，且對所有響應值均表現為負效應；淀粉對紅曲色素O1、O2有顯著影響，表現為負效應；硝酸鈉對紅曲色素Y1有顯著影響，表現為正效應；氯化銨對紅曲色素Y2有顯著影響，表現為負效應；在5種氮源中，硫酸銨和硝酸銨對7種響應值的影響均不顯著，接下來的實驗質量分數均取1 g/L。

2.2 最陡爬坡實驗

在PB實驗的基礎上，對影響顯著的5個因素——尿素、硝酸鈉、氯化銨、葡萄糖和淀粉進行進一步優化，結合7個響應值各方面因素確定最陡爬坡實驗各因素水平，實驗結果見表6。

表6 最陡爬坡實驗結果Table 6 The steepest climbing experimental results

由表6可知，第3組實驗產紅曲色素總量最高。與第3組相比，第4組色素產量較低，但菌體量較高。綜合考慮7個響應值，同時參考PB實驗中5個因子正負效應確定葡萄糖、淀粉、尿素、硝酸鈉、氯化銨在CCD實驗中的中心值分別為42.5，11，0.55，0.7，1.1 g/L。

2.3 CCD實驗

使用Minitab 18設計N=32的5因素5水平的CCD實驗，其中包括16個立方點實驗，6個中心點實驗和10個軸點實驗，實驗結果見表7。

表7 CCD實驗結果Table 7 The CCD experimental results

利用軟件Minitab 18對實驗數據進行二次多項回歸分析并繪制響應面等高曲線圖，分析因素間的交互作用與各因素對各響應值的影響。以紅曲色素R1、R2、Y1、Y2、O1、O2與尿素、淀粉的等值線圖為例進行分析(因素數和響應值較多，此處不逐一列出)，見圖1。尿素與淀粉之間的交互作用對紅曲色素R1、R2、Y2均不顯著，而對Y1顯著。在其他條件都固定在最佳水平時，淀粉含量在6～16 g/L時4種色素均能達到最大值；對于尿素這一成分，兩種紅色素的需求量較低，在0～0.5 g/L之間能達到最高產量，而兩種黃色素對其需求較高，在0.4～0.7 g/L之間才能達到最高產量。

圖1 R1、R2、Y1、Y2與尿素、淀粉的等值線圖Fig.1 The isograms of R1,R2,Y1,Y2 with urea and starch

由于響應值和因素均較多，需要整體考慮各響應值高低確定各因素水平，故采用響應優化器功能對所有響應值進行優化，得到各因素推薦濃度(葡萄糖35 g/L、淀粉16 g/L、尿素0.8 g/L、硝酸鈉1 g/L、氯化銨1.6 g/L)和7種響應值預測值，經過發酵驗證(3個平行)，與對照組進行對比，見表8。

表8 響應優化器優化結果預測與實際產量對比Table 8 Comparison of optimization results prediction and actual yield of the response optimizer

由表8可知，響應優化器預測結果與實際結果較符合，但總產量與預測值仍有一定差距，可能是微生物液態發酵的不穩定性導致，而紅曲色素作為次級代謝產物，其合成又受到多方面因素影響。與對照組相比，兩種紅色素產量顯著上升，占色素總產量的76%，該培養基配方對生產單一紅曲紅色素提供了一定的參考；黃色素和橙色素產量顯著下降，這可能是由于培養基中添加了尿素，尿素被紅曲霉代謝過程中產生的蛋白酶分解為多種氨基酸，使橙色素轉換為紅色素[19]。Martinkova等[20]研究表明，紅曲橙色素具有一定的胚胎致畸性和毒性，在生產中應降低其產量，本實驗中，兩種橙色素僅占色素總產量的7%，在實際生產中有一定意義；菌體量的提高也有利于色素總產量的增加，本實驗中色素總產量提高了31%。

3 討論

培養基組成對紅曲色素的種類和產量有很大影響，其中，碳源直接為菌體的生長和繁殖提供能量，濃度高低影響著細胞滲透壓及微生物代謝水平；氮源控制著紅曲霉菌絲體的生長，濃度過高可能使菌絲體生長過度并纏繞成球，影響營養物質和氧氣傳遞，不利于色素合成，所以合適的碳、氮源選擇及配比對菌體生長與色素合成尤為重要。

相較于傳統的利用線性數學模型設計試驗的正交試驗，響應面采用非線性模型，可以近似構造一個具有明確表達形式的多項式來表達隱式功能函數，從而找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值，而且可以同時優化多種響應值。本實驗采用響應面法對紅曲發酵培養基進行優化，使色素總產量提高了31%，其中兩種紅色素產量占總色素的76%，該結果可為色素的工業化生產提供一定理論參考。