基于響應(yīng)面的紅曲色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

王芳慧，張靜，王昌祿，李貞景，楊華，劉歡歡

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457)

紅曲霉(Monascus)又名丹曲[1]，是一種小型絲狀腐生真菌，是目前世界上能產(chǎn)食用色素的重要微生物之一，在我國已有1000多年藥食兩用的歷史，可促進(jìn)消化和血液循環(huán)[2]。紅曲色素作為一種安全、無毒的天然食用色素，是由多種物質(zhì)組成的聚酮類混合物，屬于紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物，目前已被鑒定的紅曲色素多達(dá)上百種，其中研究最多的是6種醇溶性色素[3]，包括2種紅色素：紅斑紅曲胺(Rubropunctamine，R1)和紅曲玉紅胺(Monascorubramine，R2)；2種黃色素：紅曲素(Monascin，Y1)和紅曲黃素(Ankaflavin，Y2)；2種橙色素：紅斑紅曲素(Rubropunctatin，O1)和紅曲玉紅素(Monascorubrin，O2)[4-6]。紅曲色素作為天然色素，相較于化學(xué)合成色素具有無毒副作用的優(yōu)點，同時具有降膽固醇、降血脂、抗腫瘤等功能[7-9]，在食品行業(yè)、醫(yī)療保健品及化妝品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。目前，紅曲色素已被廣泛應(yīng)用于肉制品、調(diào)味品、釀酒等行業(yè)。隨著紅曲色素在各行業(yè)的推廣，人們對其的需求量越來越大，提高紅曲色素產(chǎn)量成為亟待解決的問題。

紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的傳統(tǒng)工藝為固態(tài)發(fā)酵，操作簡單，成本較低，但是衛(wèi)生條件難以控制，菌種純度低，勞動強(qiáng)度大[12-13]。與固態(tài)發(fā)酵相比，紅曲液態(tài)發(fā)酵生長周期短，雜質(zhì)少。發(fā)酵培養(yǎng)基是菌體生長和產(chǎn)物合成的基礎(chǔ)，適宜的培養(yǎng)基配方可以使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量少，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定[14-16]，具有更大的優(yōu)勢，但是液態(tài)發(fā)酵紅曲色素產(chǎn)量較低，使其發(fā)展受到大幅度提高，因此高效、準(zhǔn)確的培養(yǎng)基優(yōu)化方法就顯得尤為重要。

響應(yīng)面方法(RSM)是一種在單變量和多變量系統(tǒng)中尋求最優(yōu)條件的有效統(tǒng)計方法，中心組合設(shè)計(CCD)實驗是響應(yīng)面分析法[17]中的一種，適用于多因素多水平實驗，有連續(xù)變量存在，可作為一種優(yōu)化方法。CCD實驗是將體系的響應(yīng)值作為一個或多個因素的函數(shù)，用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系表示出來，以供實驗設(shè)計中選擇最優(yōu)化條件。本實驗運(yùn)用Plackett-Burman實驗(PB實驗)[18]篩選對響應(yīng)值具有顯著影響的因素后，即用CCD實驗對紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高紅曲色素產(chǎn)量。

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉M-7：保藏于天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室。

1.1.2 試劑

瓊脂粉、可溶性淀粉：分析純，北京索萊寶生物科技公司；甲酸、乙腈：色譜純，天津康科德有限公司；無水乙醇：分析純，天津康科德有限公司；土豆、大米粉：食品級，市售；其余試劑：分析純，購自天津市化學(xué)試劑一廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：土豆葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)。

種子培養(yǎng)基：大米粉30 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH自然。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L和FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 6。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa，在121 ℃條件下濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQWY-200N型振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；TDZ5-WS型低速多管架自動平衡離心機(jī) 長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LRH-250-GⅡ型恒溫培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；KQ8200B型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 菌株培養(yǎng)與發(fā)酵

固體培養(yǎng)：菌種劃線接種于固體斜面后，在28 ℃條件下培養(yǎng)4～5 d。

種子培養(yǎng)：用10 mL無菌水洗斜面得孢子懸浮液，移取1 mL至裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于30 ℃，180 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，裝液量為40 mL/250 mL，搖床溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)4 d。

1.4 分析方法

菌體量的測定：取10 mL發(fā)酵液在3800 r/min條件下離心15 min，棄上清液，將菌體沉淀于60 ℃烘箱烘干至恒重后稱重，計算菌體量。

紅曲色素含量的測定：紅曲色素含量的測定采用高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX SB-C18，流動相A為超純水(含0.1%(V/V)甲酸)，流動相B為乙腈(色譜純)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為25 ℃。提取方法：取發(fā)酵液10 mL于離心管中，在3800 r/min條件下離心15 min，棄上清液，加入5 mL 70%(V/V)乙醇混勻后(此處計為濃縮2倍)，置于60 ℃水浴鍋中水浴1 h，水浴期間不定時上下翻動。水浴結(jié)束后超聲30 min，以3800 r/min離心15 min，得紅曲色素乙醇溶液。根據(jù)濃度(X)與峰面積(Y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算色素含量(mg/L)。

1.5 實驗設(shè)計方法

1.5.1 PB實驗

使用Minitab 18軟件進(jìn)行N=21的PB實驗設(shè)計，對可用于發(fā)酵培養(yǎng)基的2種碳源和5種氮源共7個因子進(jìn)行研究，以葡萄糖和淀粉取代原始培養(yǎng)基中的葡萄糖組分，以硝酸鈉、硫酸銨、尿素、氯化銨和硝酸銨取代硫酸銨組分。各因子分別取高(1)和低(-1)兩個水平。以6種醇溶性紅曲色素(R1、R2、Y1、Y2、O1、O2)產(chǎn)量和菌體量(DCW)為響應(yīng)值，仿行數(shù)為2。各因子水平設(shè)置見表1。

表1 PB實驗各因子水平值Table 1 The factors and levels of PB experiment g/L

1.5.2 最陡爬坡實驗設(shè)計

根據(jù)PB實驗結(jié)果，選擇對7種響應(yīng)值影響顯著的因素進(jìn)行下一步優(yōu)化，并以此作為CCD實驗中設(shè)置中心水平的參考。各組因子水平設(shè)計見表2，每組3個平行。

表2 最陡爬坡實驗中各因子水平值Table 2 The level value of each factor of the steepest climbing experiment g/L

1.5.3 CCD實驗設(shè)計

以最陡爬坡實驗的最優(yōu)條件為參考，綜合考慮6種紅曲色素產(chǎn)量和菌體量確定CCD實驗中各因素的中心值，使用Minitab 18軟件設(shè)計實驗。各因子水平見表3。將各組6種色素產(chǎn)量和DCW數(shù)據(jù)輸入軟件后，使用響應(yīng)優(yōu)化器功能對所有響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基結(jié)果，發(fā)酵驗證。

表3 CCD實驗各因子水平值Table 3 The factors and levels of CCD experiment g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 PB實驗結(jié)果

對發(fā)酵培養(yǎng)基的2種碳源——葡萄糖、淀粉和5種氮源——硝酸鈉、硫酸銨、尿素、氯化銨、硝酸銨進(jìn)行顯著因素篩選，考察其對6種紅曲色素產(chǎn)量及DCW的影響，發(fā)酵結(jié)果見表4。用Minitab 18對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，分析結(jié)果見表5。

表4 PB實驗結(jié)果Table 4 The PB experimental results

表5 PB實驗中各因素效應(yīng)值Table 5 The effect values of various factors of the PB experiment

由表5可知，尿素對7種響應(yīng)值均有顯著影響，對紅曲色素R1、R2表現(xiàn)為正效應(yīng)，其余為負(fù)效應(yīng)；葡萄糖除了對紅曲色素O2和DCW的影響不顯著外，對其他5種響應(yīng)值的影響均顯著，且對所有響應(yīng)值均表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)；淀粉對紅曲色素O1、O2有顯著影響，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)；硝酸鈉對紅曲色素Y1有顯著影響，表現(xiàn)為正效應(yīng)；氯化銨對紅曲色素Y2有顯著影響，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)；在5種氮源中，硫酸銨和硝酸銨對7種響應(yīng)值的影響均不顯著，接下來的實驗質(zhì)量分?jǐn)?shù)均取1 g/L。

2.2 最陡爬坡實驗

在PB實驗的基礎(chǔ)上，對影響顯著的5個因素——尿素、硝酸鈉、氯化銨、葡萄糖和淀粉進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)合7個響應(yīng)值各方面因素確定最陡爬坡實驗各因素水平，實驗結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡實驗結(jié)果Table 6 The steepest climbing experimental results

由表6可知，第3組實驗產(chǎn)紅曲色素總量最高。與第3組相比，第4組色素產(chǎn)量較低，但菌體量較高。綜合考慮7個響應(yīng)值，同時參考PB實驗中5個因子正負(fù)效應(yīng)確定葡萄糖、淀粉、尿素、硝酸鈉、氯化銨在CCD實驗中的中心值分別為42.5，11，0.55，0.7，1.1 g/L。

2.3 CCD實驗

使用Minitab 18設(shè)計N=32的5因素5水平的CCD實驗，其中包括16個立方點實驗，6個中心點實驗和10個軸點實驗，實驗結(jié)果見表7。

表7 CCD實驗結(jié)果Table 7 The CCD experimental results

利用軟件Minitab 18對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸分析并繪制響應(yīng)面等高曲線圖，分析因素間的交互作用與各因素對各響應(yīng)值的影響。以紅曲色素R1、R2、Y1、Y2、O1、O2與尿素、淀粉的等值線圖為例進(jìn)行分析(因素數(shù)和響應(yīng)值較多，此處不逐一列出)，見圖1。尿素與淀粉之間的交互作用對紅曲色素R1、R2、Y2均不顯著，而對Y1顯著。在其他條件都固定在最佳水平時，淀粉含量在6～16 g/L時4種色素均能達(dá)到最大值；對于尿素這一成分，兩種紅色素的需求量較低，在0～0.5 g/L之間能達(dá)到最高產(chǎn)量，而兩種黃色素對其需求較高，在0.4～0.7 g/L之間才能達(dá)到最高產(chǎn)量。

圖1 R1、R2、Y1、Y2與尿素、淀粉的等值線圖Fig.1 The isograms of R1,R2,Y1,Y2 with urea and starch

由于響應(yīng)值和因素均較多，需要整體考慮各響應(yīng)值高低確定各因素水平，故采用響應(yīng)優(yōu)化器功能對所有響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，得到各因素推薦濃度(葡萄糖35 g/L、淀粉16 g/L、尿素0.8 g/L、硝酸鈉1 g/L、氯化銨1.6 g/L)和7種響應(yīng)值預(yù)測值，經(jīng)過發(fā)酵驗證(3個平行)，與對照組進(jìn)行對比，見表8。

表8 響應(yīng)優(yōu)化器優(yōu)化結(jié)果預(yù)測與實際產(chǎn)量對比Table 8 Comparison of optimization results prediction and actual yield of the response optimizer

由表8可知，響應(yīng)優(yōu)化器預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果較符合，但總產(chǎn)量與預(yù)測值仍有一定差距，可能是微生物液態(tài)發(fā)酵的不穩(wěn)定性導(dǎo)致，而紅曲色素作為次級代謝產(chǎn)物，其合成又受到多方面因素影響。與對照組相比，兩種紅色素產(chǎn)量顯著上升，占色素總產(chǎn)量的76%，該培養(yǎng)基配方對生產(chǎn)單一紅曲紅色素提供了一定的參考；黃色素和橙色素產(chǎn)量顯著下降，這可能是由于培養(yǎng)基中添加了尿素，尿素被紅曲霉代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶分解為多種氨基酸，使橙色素轉(zhuǎn)換為紅色素[19]。Martinkova等[20]研究表明，紅曲橙色素具有一定的胚胎致畸性和毒性，在生產(chǎn)中應(yīng)降低其產(chǎn)量，本實驗中，兩種橙色素僅占色素總產(chǎn)量的7%，在實際生產(chǎn)中有一定意義；菌體量的提高也有利于色素總產(chǎn)量的增加，本實驗中色素總產(chǎn)量提高了31%。

3 討論

培養(yǎng)基組成對紅曲色素的種類和產(chǎn)量有很大影響，其中，碳源直接為菌體的生長和繁殖提供能量，濃度高低影響著細(xì)胞滲透壓及微生物代謝水平；氮源控制著紅曲霉菌絲體的生長，濃度過高可能使菌絲體生長過度并纏繞成球，影響營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣傳遞，不利于色素合成，所以合適的碳、氮源選擇及配比對菌體生長與色素合成尤為重要。

相較于傳統(tǒng)的利用線性數(shù)學(xué)模型設(shè)計試驗的正交試驗，響應(yīng)面采用非線性模型，可以近似構(gòu)造一個具有明確表達(dá)形式的多項式來表達(dá)隱式功能函數(shù)，從而找到整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，而且可以同時優(yōu)化多種響應(yīng)值。本實驗采用響應(yīng)面法對紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使色素總產(chǎn)量提高了31%，其中兩種紅色素產(chǎn)量占總色素的76%，該結(jié)果可為色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論參考。