海洋產蛋白酶Bacillus amyloliquefaciens MSP05發酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白條件優化

武波飛，丁志雯，蘇永成，楊光，侯曉月，房耀維,2，劉姝,2*

(1.江蘇海洋大學 食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇 連云港 222000)

南美白對蝦又稱白腳蝦(Penaeusvannamei)，是對蝦科、對蝦屬蝦類，是迄今世界上養殖產量最高的三大優良蝦種之一[1]。南美白對蝦蛋白質含量較高，富含氨基酸、維生素和礦物質元素，蝦肉中多不飽和脂肪酸(EPA和DHA)含量豐富，具有一定的保健功能[2]。南美白對蝦蝦殼比較柔軟，蝦肉、蝦殼容易剝離，質地松軟[3]。我國南美白對蝦淡水養殖產量為67.12萬噸，海水養殖產量為114.44萬噸，占甲殼類水產品養殖總產量的32%[4]。蝦肉富含蛋白質和18種氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸總數的38.78%，是一種營養均衡的優質蛋白來源[5-6]。目前，南美白對蝦出口數量越來越大，會產生大量的蝦殼及蝦頭廢棄物，這部分約占蝦總量的30%～40%[7]。以干基計，這些廢棄物蝦殼中占5.21%的蛋白質、5.32%的礦物質、6.77%的幾丁質和1.29%的脂肪[8]。這些廢棄物不僅造成了營養物質的浪費，而且造成了環境污染，導致水環境的富營養化。如果能對這些廢棄物進行開發利用，則可變廢為寶，既解決了環境污染，又帶來了經濟效益。

幾丁質(chitin)，又稱殼多糖、甲殼素，是自然界中唯一的天然堿性多糖，無毒性、無刺激性、無免疫抗原性，廣泛應用于醫藥、化工和保健食品等領域[9]。幾丁質的溶解性較差，經脫除乙酰基達到55%以上后形成殼聚糖。殼聚糖的溶解性能好，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性，并能進行化學修飾反應。因此，殼聚糖被認為是極具應用潛力的功能性生物材料，廣泛應用于食品、輕工、農業、環保、美容等領域[10]。

由蝦殼制備幾丁質最關鍵的步驟之一是脫蛋白。傳統的脫蛋白方法是濃堿法。該方法對幾丁質的結構有一定的破壞，耗能高，其中的蛋白、碳酸鈣和其余礦物質均作為廢棄物排放，會對環境產生嚴重污染。運用添加蛋白酶水解的方式脫蛋白可以大大降低環境污染，減少能耗，但是成本較高[11]。運用產蛋白酶微生物對蝦蟹殼進行發酵脫蛋白綠色環保，水解產物用回收利用且成本較低，成為極具潛力的蝦蟹殼脫蛋白方式[12-13]。本課題組從海洋樣品中篩選獲得了產耐有機溶劑蛋白酶菌株B.amyloliquefaciensMSP05[14]。本研究利用B.amyloliquefaciensMSP05發酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白，對發酵條件進行優化。

1 材料

1.1 材料與試劑

南美白對蝦蝦殼：青島康鏡海洋生物科技有限公司；發酵菌種：B.amyloliquefaciensMSP05菌，于實驗室-80 ℃保藏；酵母粉、蛋白胨：美國OXOID公司；可溶性淀粉、MnSO4、FeSO4、MgSO4、Tween-20、NaH2PO4、K2HPO4：南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MC型電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；FE20型pH計 上海梅特勒-托利多有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JXN-26型高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蝦殼預處理

將蝦殼在100 ℃烘干至恒重，使用組織搗碎機破碎，過篩40目粒徑的蝦殼。

1.3.2 菌種活化

在無菌條件下，從斜面接種至LB液體培養基，在37 ℃以180 r/min培養至OD600為0.8后作為種子液。按4%接種量將種子液接種至發酵培養基，對發酵條件進行優化。

1.3.3 培養基

固體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂2 g/L，pH 7.2～7.4，在121 ℃滅菌20 min。

種子培養基：液體LB培養基。

初始發酵培養基：可溶性淀粉14.06 g/L，蛋白胨16.28 g/L，酵母膏2.5 g/L，MnSO40.1 g/L，Tween-20 0.1 g/L，NaH2PO43.46 g/L，K2HPO41 g/L，FeSO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，蝦殼處理物10%，pH 6.7，在121 ℃滅菌20 min。

1.3.4 南美白對蝦蝦殼蛋白質的測定

參照國標GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》。

1.3.5 南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的測定

稱取20 g南美白對蝦蝦殼，用200 mL 6% NaOH溶液煮沸1 h，用紗布過濾，將濾渣水洗至中性，用5%的HCl溶液浸泡24 h，每4 h攪拌一次，紗布過濾，將濾渣水洗至中性后烘干，測定蛋白質含量，計算脫蛋白率[15]。

蛋白質去除率(%)=(原料中總蛋白質量-濾渣中蛋白質量)/原料中總蛋白質量×100。

1.3.6 發酵條件對產蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白的影響

發酵時間60 h，發酵轉速200 r/min，初始pH 6.7，發酵溫度37 ℃，裝液量20%，接種量4%，蝦殼處理物10%。依次對發酵時間(0，12，24，36，48，60，72 h)、發酵轉速(160，180，200，220 r/min)、初始pH值(6.3，6.5，6.7，6.9，7.1)、發酵溫度(35，37，39，41 ℃)、裝液量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、接種量(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)進行單因素試驗，以脫蛋白率為指標，探討蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發酵南美白對蝦殼脫蛋白的影響。

1.3.7 響應面優化產蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白條件

根據單因素結果，選擇對發酵脫蛋白影響最顯著的轉速、溫度和裝液量為因素，以脫蛋白率高低為響應值，運用Design Expert 11設計3因素3水平共17個Box-Behnken響應面分析試驗[16]。在最佳條件下對響應面分析結果進行驗證，測定脫蛋白率。

1.3.8 數據處理

所有試驗數據均為重復3次試驗后的平均值，響應值試驗結果采用Design Expert 11軟件進行分析處理，數據繪圖采用Origin 2018軟件。

2 結果與分析

2.1 發酵條件對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

2.1.1 發酵時間對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

發酵時間對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響見圖1。

圖1 發酵時間對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖1可知，脫蛋白率隨著發酵時間的延長而不斷增加，在菌株發酵培養48 h時，脫蛋白率達到最高值91.94%，之后隨著發酵時間的延長，脫蛋白率下降。隨著反應的進行，培養基的營養物質及生長因子不斷地消耗，菌株產蛋白酶水平下降[17]。

2.1.2 發酵轉速對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖2可知，轉速為200 r/min時脫蛋白率最高，為94.99%，轉速在160～200 r/min之間，隨著轉速的增加，蛋白酶活力增大，說明轉速增大，溶氧增大，有利于產酶；當轉速大于200 r/min時，蛋白酶活力不再升高反而有所下降，可能是轉速繼續增大，剪切力會導致蛋白酶失活[18]。

圖2 發酵轉速對發酵時間對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.2 Effect of rotating speed on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.1.3 初始pH對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

發酵初始pH對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響見圖3。

圖3 初始pH對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.3 Effect of initial pH value on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖3可知，隨著初始pH的升高，脫蛋白率先升高后下降，在初始pH值為6.7時最高，脫蛋白率為91.65%。pH影響酶的活性和穩定性，從而影響脫蛋白效率[19]。

2.1.4 發酵溫度對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖4可知，在39 ℃時脫蛋白率達到最高95.49%，當溫度超過39 ℃時，脫蛋白率持續下降。溫度影響微生物發酵產酶水平，也影響酶活性，從而影響蛋白脫除率[20]。

圖4 發酵溫度對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

續 表

2.1.5 裝液量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

裝液量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響結果見圖5。

圖5 裝液量對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.5 Effect of liquid loading volume on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖5可知，當搖瓶的裝液量為20%時，脫蛋白率達到最高值，為90.75%。裝液量與發酵液溶氧相關，裝液量過高，溶氧偏低，導致菌株生長變緩，發酵產酶水平降低。

2.1.6 接種量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖6可知，接種量的大小影響脫蛋白的效率。接種量為4%時，脫蛋白率達到最高值90.35%。進一步增加接種量，脫蛋白率不再顯著增加。接種量過小會導致菌株延滯期變長、發酵產酶水平低。考慮到成本問題，選擇4%為最佳接種量。

圖6 接種量對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.2 響應面優化產蛋白酶B. amyloliquefaciens MSP05發酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白

2.2.1 響應面試驗設計

以發酵轉速B(r/min)、溫度(℃)和裝液量(%)為顯著影響因素，見表1。運用Design Expert 11設計三因素三水平共17個試驗點的Box-Behnken進行組合優化，其中包括5個最優試驗點，試驗結果見表2。

表1 響應面優化法各因素和水平設計Table 1 The factors and levels of response surface experiment

表2 響應面試驗設計結果Table 2 The response surface experiment design and results

利用Design Expert 11軟件對表3中的數據進行分析處理，得到以Y為因變量，發酵轉速、溫度和裝液量為自變量的二次多項式方程：Y=93.89+2A-2.4B+0.4775C+0.1075AB-3.57AC+3.92BC-0.1278A2-3.04B2-8.92C2。

使用Design Expert進一步對擬合出的回歸方程進行誤差統計分析，對方差和多元相關系數進行計算，對此模型進行方差分析及顯著性變化，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析和系數顯著性檢驗Table 3 The variance analysis and coefficient significance test of regression model

由表3可知，回歸模型的P值為0.0001，顯著性分析(P<0.01)為極顯著；失擬項的P值為0.8511>0.05，說明模型的擬合程度良好，影響擬合的因素對試驗結果干擾很小[21]。A、B、AC、BC、B2和C2對脫蛋白效果的影響極顯著。方程的決定系數R2=0.9760>0.9，表明產蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發酵南美白對蝦殼脫蛋白率預測結果具有一致性，模型相關度好。試驗模型的校正系數RAdj2=0.9450，表明模型的擬合程度較高[22]，說明有94.5%的試驗結果可以用此模型來解釋，因此結果可靠，模型可以對產蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發酵南美白對蝦殼脫蛋白率值進行分析和預測，由回歸方程式中一次項系數可知，各因素對產蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白率作用大小順序為：溫度(B)>轉速(A)>裝液量(C)。

2.2.2 響應面分析與條件優化

響應曲面的形狀反映各因素間的交互作用的顯著性，響應曲面越陡峭，表明該因素對試驗結果的影響越顯著，曲面頂點為交互因素最佳取值的試驗結果[23-24]。由圖7可知，溫度與轉速、轉速與裝液量以及裝液量與溫度交互作用的顯著性與表3中交互項P值的分析結果一致，(a)，(c)，(e)均呈橢圓形，表明因素間的交互作用顯著，等高線的形狀可以判斷交互作用的強弱，3組等高線圖中轉速和溫度作用最好，等高線中的曲面圍繞著響應面在中間處形成頂點，即脫蛋白率最大值，a，c，e響應面圖開口朝下，隨著每個因素的增加而響應值減小，響應面的頂點即為最大響應值。

(a)

2.2.3 響應面優化驗證試驗

利用Design Expert 11軟件得到脫蛋白的最佳發酵工藝：轉速200.5 r/min、溫度38.5 ℃、裝液量19.5%。為方便實際操作，將最佳工藝條件設為：轉速200 r/min、溫度39 ℃、裝液量20%。在此條件下做3次試驗，脫蛋白率達95.40%±0.014%，接近理論預測值96.47%。

2.2.4 熱堿法脫南美白對蝦蝦殼蛋白

利用熱堿法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白，脫蛋白率達到 97.8%±2.1%，高于最佳條件下發酵法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白率。但是熱堿法能耗高，排出大量污染廢水，污染環境。另外，強酸、強堿對幾丁質的分子結構有一定的破壞[25]。因此，本研究優化獲得的發酵法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白綠色環保、能耗較低，具有工業應用潛力。

3 結論

以 南美白對蝦蝦殼為原料，采用產蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05通過發酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白，以脫蛋白率為考察指標，脫蛋白率為80.28%。在單因素優化的基礎上，通過Box-Behnken試驗設計和響應面分析，最終獲得最佳發酵脫蛋白參數為：轉速200 r/min、溫度39 ℃、裝液量20%。在此條件下得到的脫蛋白率為96.47%，較優化前提高了16.7%。