不同提取方法對(duì)紫蘇籽粕蛋白功能性質(zhì)的影響

范三紅，賈槐旺，張錦華，李蘭，白寶清*

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(山西大學(xué))，太原 030006)

紫蘇是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物[1]，在我國(guó)有近2000年的栽培史，主要分布于四川、陜西、寧夏等省[2]。紫蘇籽是紫蘇的種子，其蛋白質(zhì)含量為20%～23%，紫蘇籽粕蛋白含量可達(dá)到28%～45%。紫蘇籽粕蛋白氣味優(yōu)良、適口性好，不存在對(duì)人體有害的成分；氨基酸的組成豐富，共含有18種氨基酸，其中包含8種人體必需氨基酸，是氨基酸種類(lèi)齊全的完全蛋白質(zhì)。目前我國(guó)紫蘇籽粕最大的流向依然是作為畜禽飼料使用，開(kāi)發(fā)、利用和深加工仍不完善，這對(duì)紫蘇蛋白資源造成了巨大的浪費(fèi)。因此，綜合開(kāi)發(fā)利用紫蘇蛋白資源、減少資源浪費(fèi)以及提升經(jīng)濟(jì)效益成為當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。

蛋白的常用提取方法有等電點(diǎn)法(堿溶酸沉法)、鹽析法、氯醋酸-丙酮沉淀法等。堿溶酸沉法具有操作簡(jiǎn)便、損耗低、純度高和方便快捷等優(yōu)點(diǎn)[3]。石瑋婷等[4]研究了紫蘇籽蛋白的提取工藝，并對(duì)分離蛋白進(jìn)行了超濾純化，最終獲得純度和提取率分別為91.74%和46.90%的分離蛋白。閃提是利用機(jī)械剪切力、快速攪拌和超動(dòng)分子滲透技術(shù)來(lái)達(dá)到快速提取物料活性成分的目的，用時(shí)短、效率高是其最突出的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)[5]。李雅松等[6]通過(guò)閃式提取法對(duì)栗葉蛋白的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果耗時(shí)3.6 min得到純度為64.89%、得率為11.89%的栗葉蛋白。超聲提取是利用聲波產(chǎn)生高速?gòu)?qiáng)烈的空化效應(yīng)，通過(guò)破壞物料的細(xì)胞，使溶劑滲透到物料細(xì)胞中，縮短提取時(shí)間，提高提取率。姜文鑫[7]研究了紫蘇蛋白的提取工藝和性狀表征，最終得到得率和純度分別為36.5%、86.9%的紫蘇蛋白。目前關(guān)于閃式提取和超聲提取對(duì)紫蘇籽粕分離蛋白功能性質(zhì)影響的研究鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)比閃式提取和超聲提取紫蘇籽粕分離蛋白的功能性質(zhì)，以期為紫蘇籽粕蛋白資源的回收、開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽粕(產(chǎn)地：山西省晉城市陵川西河底鎮(zhèn)，品種：?jiǎn)蚊婕t)，其他均為常規(guī)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-20V實(shí)驗(yàn)型閃式提取器 河南智晶生物科技股份有限公司；SK-1030超聲波清洗儀 東莞市彭宇電子設(shè)備有限公司；868 pH測(cè)試儀 美國(guó)奧立龍公司；SP-2000UV紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分離蛋白提取率計(jì)算

采用考馬斯亮藍(lán)法，根據(jù)公式(1)計(jì)算。

公式(1)

式中：X為分離蛋白提取率(%)，c為分離蛋白濃度(mg/mL)，N為稀釋倍數(shù)，V為分離蛋白溶液體積(mL)，m為樣品質(zhì)量(mg)，w為蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

1.3.2 紫蘇籽粕蛋白的提取流程

紫蘇籽粕→去雜、粉碎、過(guò)篩、脫脂→配制成一定料液比→調(diào)節(jié)pH→超聲提取/閃式提取→離心機(jī)去渣→取上清液調(diào)節(jié)pH為等電點(diǎn)→離心→蛋白質(zhì)沉淀→真空冷凍干燥→密封低溫保存。

1.3.3 閃式提取和超聲提取分離蛋白單因素試驗(yàn)

閃式提取確定料液比1∶20(g/mL)、閃提轉(zhuǎn)速3000 r/min、閃提時(shí)間30 s、閃提pH 10為基礎(chǔ)提取條件，以分離蛋白提取率為考察指標(biāo)分別考察了閃提pH(8，9，10，11，12)、閃提時(shí)間(10，20，30，40，50 s)、閃提速率(1000，2000，3000，4000，5000 r/min)及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響。超聲提取確定料液比1∶20、堿提溫度40 ℃、堿提時(shí)間30 min、堿提pH 10為基礎(chǔ)提取條件，以分離蛋白提取率為考察指標(biāo)分別考察了堿提 pH(8，9，10，11，12)、堿提時(shí)間(15，20，25，30，35 min)、堿提溫度(30，40，50，60，70 ℃)及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響。

1.3.4 閃式提取和超聲提取分離蛋白響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，閃式提取選取A閃提時(shí)間(20，30，40 s)、B料液比(1∶15、1∶20、1∶25，g/mL)、C閃提pH(9，10，11)3個(gè)主要影響因素為獨(dú)立變量；超聲提取選取A料液比(1∶15、1∶20、1∶25，g/mL)、B堿提pH(9，10，11)、C堿提時(shí)間(15，20，25 min)3個(gè)主要影響因素為獨(dú)立變量，以蛋白提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)方案[8-10]。

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

取3 mL蛋白溶液，加入1 mL DPPH·乙醇溶液(40 μg/mL)，避光放置30 min，測(cè)定吸光度A1(517 nm)；3 mL蛋白溶液和1 mL乙醇溶液(40 μg/mL)混合，測(cè)定吸光值A(chǔ)2；3 mL乙醇和1 mL DPPH·乙醇溶液(40 μg/mL)混合測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；以Vc為陽(yáng)性對(duì)照并按公式(2)進(jìn)行計(jì)算[11]。

公式 (2)

1.3.5.2 超氧陰離子清除能力的測(cè)定

依次加入pH 8.2的Tris-HCl緩沖液6 mL和3 mL蛋白溶液，37 ℃恒溫10 min，加入1 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L)，反應(yīng)4 min，用0.5 mL的鹽酸(0.5 mol/L)結(jié)束反應(yīng)，測(cè)吸光度值(320 nm)A1，以蒸餾水代替蛋白溶液和鄰苯三酚分別測(cè)吸光度A0和A2；以Vc為陽(yáng)性對(duì)照并按公式2進(jìn)行計(jì)算[12]。

1.3.5.3 羥自由基清除能力的測(cè)定

加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)溶液、1 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)、1 mL蛋白溶液，最后加入1 mL H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴30 min，在510 nm處測(cè)定吸光度A1；用蒸餾水分別代替H2O2和蛋白溶液測(cè)定吸光度A2和A0；以Vc為陽(yáng)性對(duì)照并按公式(2)進(jìn)行計(jì)算[13]。

1.3.5.4 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

加入0.1 mL蛋白溶液、3.9 mL ABTS工作液，混勻精確反應(yīng)6 min，在734 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；以無(wú)水乙醇和蒸餾水分別代替工作液和蛋白溶液測(cè)定吸光度值A(chǔ)2和 A0；以Vc為陽(yáng)性對(duì)照并按公式(2)進(jìn)行計(jì)算[14]。

1.3.5.5 還原力的測(cè)定

將1 mL的蛋白溶液、1 mL磷酸緩沖液(pH 6.6)和1 mL鐵氰化鉀(1%)混勻，50 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，加入1 mL三氯乙酸(10%)，3000 r/min離心10 min，將2 mL上清液、2 mL蒸餾水和1 mL三氯化鐵(0.1%)混勻，反應(yīng)10 min，在700 nm處測(cè)定吸光度[15]。

1.3.6 SDS-PAGE

分離膠和壓縮膠分別采用12%和5%，1 mg蛋白粉溶解于1 mL緩沖液中，100 ℃水浴5 min，冷卻至室溫，2500 r/min離心2 min，取上清液15 μL加樣。采用分子量范圍為14.4～97.4 kDa的低分子量蛋白質(zhì)Marker。恒壓(25 V)下跑膠完成后，染色，脫色[16]。

1.3.7 分離蛋白功能性質(zhì)分析

1.3.7.1 溶解度

配制10 mg/mL的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH，室溫下渦旋10 min，離心15 min，上清液蛋白質(zhì)含量通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，樣品中蛋白質(zhì)含量用微量凱氏定氮法測(cè)定[17]。溶解度按公式(3)計(jì)算。

公式 (3)

1.3.7.2 持水性

稱(chēng)取1 g凍干蛋白粉表示為m1，裝入預(yù)先稱(chēng)重的離心管(m0)中，加入10 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，渦旋1 min，靜置30 min，4500 r/min 離心15 min。倒出上清液，再次稱(chēng)重離心管質(zhì)量m2，按公式(4)計(jì)算每克樣品水或油的保持量[18]

持水性(g/g)=m2-m1-m0。

公式(4)

式中：m0表示離心管質(zhì)量；m1表示樣品質(zhì)量；m2表示持水后的總質(zhì)量。

1.3.7.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性

將8 mL的大豆油加入到24 mL的蛋白質(zhì)溶液(0.1%)中，調(diào)節(jié)pH，2000 r/min均質(zhì)1 min，形成均勻的乳液。均質(zhì)結(jié)束0 min和結(jié)束10 min后分別取50 μL的乳液，加入到一個(gè)含有5 mL SDS溶液(0.1%)的試管中，在500 nm處測(cè)定吸光值[19]，乳化性及乳化穩(wěn)定性分別按公式(5)和公式(6)計(jì)算。

公式(5)

公式(6)

式中：T=2.303；C為蛋白質(zhì)溶液的濃度；φ為油相的體積比；A0為0 min時(shí)在500 nm處的吸光值；A10為10 min時(shí)在500 nm處的吸光值。

1.3.7.4 起泡性和起泡穩(wěn)定性

將30 mL蛋白液(10 mg/mL)裝入100 mL刻度管中，調(diào)節(jié)pH，2000 r/min分散1 min，記錄分散前后的體積，按公式(7)計(jì)算。泡沫穩(wěn)定性為儲(chǔ)存30 min后的穩(wěn)定性[20]，按公式(8)計(jì)算。

公式(7)

公式(8)

式中：V1為攪打前溶液的體積；V2為攪打后的總體積；V3為攪打30 min后的體積。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用Origin 8.5軟件繪制圖表，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)及分析，結(jié)果以x±s表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料成分分析

經(jīng)測(cè)定，PSM的蛋白、脂肪、水分、灰分含量分別為57.31%、8.94%、5.21%、7.64%；等電點(diǎn)為pH 4.2。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗(yàn)

pH在8～10時(shí)，分離蛋白提取率隨著pH的增加而升高(見(jiàn)圖1中A)，可能是因?yàn)榉蛛x蛋白的主要組成成分為堿性蛋白，堿性提取環(huán)境有利于分離蛋白的溶解，進(jìn)而提高提取率。當(dāng)pH為10時(shí)，提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增大pH，分離蛋白提取率逐漸降低，推測(cè)其原因是強(qiáng)堿導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的變性，從而降低了蛋白提取率。提取時(shí)間在15～20 min時(shí)間段(見(jiàn)圖1中B)，提取率不斷升高，這是因?yàn)樵黾訅A提時(shí)間可使物料中的蛋白充分溶解出來(lái)；時(shí)間為20 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值42.9%。繼續(xù)增加堿提時(shí)間，提取率降低，其原因是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而降低了蛋白的提取率。由圖1中C可知，當(dāng)堿提溫度在30～50 ℃時(shí)，蛋白提取率不斷升高，50 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大，這是因?yàn)樯邷囟葧?huì)加速物料中分子的運(yùn)動(dòng)，加快物料分子的擴(kuò)散，從而有利于蛋白質(zhì)的溶出。繼續(xù)升高溫度，提取率逐漸下降，因?yàn)楦邷厥沟玫鞍椎慕Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而引起了提取率的降低。當(dāng)料液比小于1∶20時(shí)，提取率與料液比成正相關(guān)(見(jiàn)圖1中D)，料液比為1∶20時(shí)，提取率達(dá)到最大值30.7%；這是因?yàn)檫m量增加溶劑會(huì)增大蛋白與溶劑之間的接觸面積，從而提高了蛋白的溶出率；繼續(xù)增大料液比，提取率降低，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶出已經(jīng)比較充分；繼續(xù)增大料液比，非蛋白組分不斷溶出，提取體系擴(kuò)大，產(chǎn)生了對(duì)蛋白酸沉淀不利的影響，導(dǎo)致提取率下降且增加了水資源的損耗。由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，選取pH 10、堿提時(shí)間20 min、溫度50 ℃和料液比1∶20為最佳超聲提取單因素。

圖1 超聲提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗(yàn)Fig.1 Single factor experiment of ultrasonic extraction of perilla seed meal protein注：A，B，C，D分別為堿提pH、堿提時(shí)間、堿提溫度、料液比對(duì)紫蘇籽粕蛋白提取率的影響。

2.2.2 閃式提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗(yàn)

在測(cè)試pH范圍內(nèi)，當(dāng)pH為8～10時(shí)，提取率隨著pH的增大而升高(見(jiàn)圖2中A)；當(dāng)pH為10時(shí)提取率為46.2%，達(dá)到最大值。pH為10～12時(shí)，提取率快速下降，可能是強(qiáng)堿導(dǎo)致蛋白開(kāi)始變性，閃提加快了蛋白分子與強(qiáng)堿的接觸，使蛋白質(zhì)的變性速率增快，導(dǎo)致提取率下降。閃提時(shí)間在10～30 s時(shí)間段，提取率隨著這時(shí)間的增加不斷升高(見(jiàn)圖2中B)；閃提時(shí)間為30 s時(shí)提取率達(dá)到最大值45.8%。繼續(xù)延長(zhǎng)閃提時(shí)間，分離蛋白的提取率開(kāi)始緩慢下降，可能是由于原料蛋白達(dá)到限定條件下的最大溶解且與提取液充分接觸，提取率已無(wú)上升空間，而隨著閃提時(shí)間延長(zhǎng)，高速運(yùn)轉(zhuǎn)的閃提器轉(zhuǎn)子與提取物摩擦產(chǎn)生的高溫使得料液溫度升高進(jìn)而導(dǎo)致部分蛋白因高溫產(chǎn)生變性。在閃提速率1000～3000 r/min范圍內(nèi)，提取率隨著閃提速率的增加而升高(見(jiàn)圖2中C)，這是因?yàn)椴粩嘣鏊俚拈W提進(jìn)一步加速了蛋白的溶解；當(dāng)閃提速率達(dá)到3000 r/min時(shí)，提取率達(dá)到最大值44.9%。繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，高轉(zhuǎn)速加快了轉(zhuǎn)子與提取物的摩擦，導(dǎo)致料液溫度升高，高溫使部分蛋白質(zhì)開(kāi)始變性，從而使得提取率開(kāi)始逐漸降低。在測(cè)試料液比范圍內(nèi)，以1∶20為分界點(diǎn)(見(jiàn)圖2中D)，分離蛋白提取率先逐漸升高后逐漸降低，這是因?yàn)殡S著料液比的增大，蛋白與提取液的接觸面積增大，加速了蛋白的溶解，從而使得提取率不斷增加；繼續(xù)增大料液比，提取體系變大，短時(shí)間的閃提操作不能使得蛋白完全溶出，從而導(dǎo)致分離蛋白提取率不升反降。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取pH 10、堿提時(shí)間20 min、閃提速率3000 r/min和料液比1∶20為最佳閃式提取單因素。

圖2 閃式提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗(yàn)Fig.2 Single factor experiment of flash extraction of perilla seed meal protein注：A，B，C，D分別為閃提pH、閃提時(shí)間、閃提速率、料液比對(duì)紫蘇籽粕蛋白提取率的影響。

2.3 閃式提取和超聲提取紫蘇籽粕蛋白響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析紫蘇籽粕蛋白提取率，超聲提取各因素料液比、堿提pH和堿提時(shí)間分別為1∶20.79 (g/mL)、10.62和20.92 min時(shí)，預(yù)測(cè)紫蘇籽粕分離蛋白提取率為54.02%。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，修正提取條件料液比、堿提pH和堿提時(shí)間依次為1∶20(g/mL)、10和20 min，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，提取率穩(wěn)定在(53.85±0.21)%；閃式提取各因素料液比、閃提pH 和閃提時(shí)間分別為1∶19.08 (g/mL)、10.17和30.19 s，預(yù)測(cè)分離蛋白提取率為46.78%。考慮到操作的可行性，修正提取條件料液比、閃提pH和閃提時(shí)間依次為 1∶20(g/mL)、10和30 s，在修正條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明紫蘇籽粕蛋白提取率穩(wěn)定在(46.54±0.17)%。

2.4 抗氧化能力測(cè)定

2.4.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定

由圖3可知，分離蛋白濃度在0.2～1.0 mg/mL的遞增過(guò)程中，UEOPI、FEOPI和Vc的DPPH自由基清除率均顯著升高后趨于平穩(wěn)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，UEOPI、FEOPI和Vc的DPPH自由基清除率依次達(dá)到80.00%、71.09%、91.31%，表明兩種被測(cè)蛋白都具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，UEOPI的DPPH自由基清除能力略?xún)?yōu)于FEOPI。

圖3 兩種分離蛋白和Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging ability of two separate proteins and Vc on DPPH free radicals

2.4.2 超氧陰離子清除能力測(cè)定

由圖4可知，被測(cè)質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，陽(yáng)性對(duì)照Vc的超氧陰離子清除率先增加后趨于平穩(wěn)，而UEOPI和FEOPI的超氧陰離子清除率變化較小。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，UEOPI、FEOPI和Vc的超氧陰離子自由基清除率分別為24.89%、20.01%、99.11%，表明兩種被測(cè)蛋白對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力均較弱，UEOPI的超氧陰離子自由基清除能力略高于FEOPI。

圖4 兩種分離蛋白和Vc對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.4 The scavenging ability of two separated proteins and Vc on superoxide anion free radicals

2.4.3 羥自由基清除能力測(cè)定

由圖5可知，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，陽(yáng)性對(duì)照Vc的羥自由基清除率不斷接近100%，而UEOPI和FEOPI的清除率緩慢上升。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)UEOPI、FEOPI和Vc的羥自由基清除率分別為31.22%、20.93%、99.31%。兩種被測(cè)蛋白對(duì)羥自由基的清除能力均較弱且UEOPI的羥自由基清除能力略?xún)?yōu)于FEOPI。

圖5 兩種分離蛋白和Vc對(duì)羥自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of two separate proteins and Vc on hydroxyl free radicals

2.4.4 ABTS自由基清除能力測(cè)定

由圖6可知，被測(cè)質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，3種被測(cè)樣品的ABTS自由基清除率均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)UEOPI、FEOPI和Vc的ABTS自由基清除率依次達(dá)到22.64%、18.14%、47.19%，表明兩種被測(cè)蛋白對(duì)ABTS自由基的清除能力相對(duì)較弱。在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，較FEOPI而言，UEOPI有更強(qiáng)的ABTS自由基清除能力。

圖6 兩種分離蛋白和Vc對(duì)ABTS自由基清除能力Fig.6 The scavenging ability of two separate proteins and Vc on ABTS free radicals

2.4.5 還原力的測(cè)定

由圖7 可知，在被測(cè)濃度范圍內(nèi)，兩種被測(cè)蛋白的還原力明顯低于Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，UEOPI、FEOPI和Vc的吸光度分別為0.389，0.271，1.417，表明兩種被測(cè)蛋白的還原力均較弱且UEOPI比FEOPI有更強(qiáng)的還原力。

圖7 兩種分離蛋白和Vc的還原力Fig.7 The reducing power of two isolated proteins and Vc

2.5 SDS-PAGE電泳分析

由圖8可知，UEOPI與FEOPI均有3條較明顯的條帶，而大豆分離蛋白的圖譜中有6條。兩種輔助方法提取的紫蘇籽粕蛋白亞基的分子量分布范圍大致相同。大豆分離蛋白亞基的分子量主要分布在14.4～80 kDa，而樣品蛋白主要分布在14.4～50 kDa，表明大豆分離蛋白的平均分子量要大于兩種輔助方法提取的蛋白。SDS-PAGE圖譜顯示，在20.0～31.0 kDa范圍內(nèi)，UEOPI比FEOPI多了兩條淺色條帶，表明兩種輔助方法提取的分離蛋白在組成成分上有了微小的差異，UEOPI的蛋白組成成分更豐富。

圖8 超聲提取和閃式提取分離蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.8 SDS-PAGE electrophoretogram of ultrasonic extraction and flash extraction of protein isolates注：M為小分子量蛋白Marker，B為大豆分離蛋白，1為超聲提取蛋白，2為閃式提取蛋白(標(biāo)準(zhǔn)蛋白從上至下的蛋白條帶分別是：兔磷酸化酶97.4 kDa、牛血清蛋白66.2 kDa、兔肌動(dòng)蛋白43 kDa、牛碳酸酐酶31 kDa、胰蛋白酶抑制劑20.0 kDa、雞蛋清溶菌酶14.4 kDa)。

2.6 蛋白質(zhì)功能性質(zhì)分析

2.6.1 溶解性

由圖9可知，兩種蛋白的NSI變化趨勢(shì)較一致，當(dāng)pH為4.2時(shí)，UEOPI和FEOPI的溶解度分別達(dá)到最低的13.52%、11.25%。pH在遠(yuǎn)等電點(diǎn)端的溶解性要大于近等電點(diǎn)端，因?yàn)楫?dāng)pH小于4.2時(shí)，蛋白質(zhì)分子主要以正離子狀態(tài)存在；當(dāng)pH大于4.2時(shí)，主要以負(fù)離子狀態(tài)存在，隨著電荷不斷增多，分子間相互排斥，靜電斥力不斷增強(qiáng)，從而導(dǎo)致溶解度不斷升高。UEOPI的溶解度整體高于FEOPI，可能是超聲的空化作用能夠破壞蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，與水的接觸面積增大，從而導(dǎo)致溶解度增加[21]。

圖9 pH對(duì)兩種蛋白溶解性的影響Fig.9 The effect of pH values on the solubility of two proteins

2.6.2 持水性

由圖10可知，以等電點(diǎn)4.2為分界點(diǎn)，當(dāng)pH在2～4.2變化時(shí)，兩種蛋白的WHC均下降，當(dāng)pH 在4.2～12時(shí)，WHC均開(kāi)始上升。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)之間的相互作用大于蛋白質(zhì)與水之間的作用力時(shí)持水性降低，反之則持水性升高。等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)最低的水合作用，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，靜電荷和排斥力的增加使蛋白質(zhì)的持水力增大。UEOPI的持水力要高于FEOPI，因?yàn)槌曁岣吡说鞍踪|(zhì)與水之間的作用力，進(jìn)而增大了其持水的能力。

圖10 pH對(duì)兩種蛋白持水性的影響Fig.10 The effect of pH values on the water holding capacity of two proteins

2.6.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性

由圖11可知，以等電點(diǎn)4.2為分界點(diǎn)，兩種蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性均先降低后升高。當(dāng)pH在等電點(diǎn)4.2時(shí)，UEOPI和FEOPI的乳化性分別達(dá)到最低的15%、16.25%，乳化穩(wěn)定性分別達(dá)到最低的38.02%、40.34%。當(dāng)pH為12時(shí)，UEOPI和FEOPI的乳化性達(dá)到最高的48.25%和43.56%，乳化穩(wěn)定性達(dá)到最高的93.41%和90.31%。因?yàn)楫?dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，分離蛋白氨基酸側(cè)鏈的解離受到影響，產(chǎn)生了有利于乳濁液中穩(wěn)定的靜電斥力，使乳化性和乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)[22]。UEOPI的乳化性高于FEOPI，UEOPI的乳化穩(wěn)定性略高于FEOPI，可能是超聲的空穴效應(yīng)會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)釋放出小分子亞基與肽，導(dǎo)致蛋白液的乳化活性升高[23]。超聲處理后的蛋白體系構(gòu)象更穩(wěn)定，蛋白粒子減小更易解折疊及快速在油-水界面上穩(wěn)定，因此乳化穩(wěn)定性升高[24]。

圖11 pH對(duì)2種蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.11 The effect of pH values on the emulsification and emulsification stability of two proteins

2.6.4 起泡性和起泡穩(wěn)定性

由圖12可知，在被測(cè)pH范圍內(nèi)，以等電點(diǎn)pH 4.2為分界點(diǎn)，兩種蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性變化趨勢(shì)均先下降后升高。當(dāng)pH在2～4.2時(shí)，起泡性和泡沫穩(wěn)定性隨著pH的升高而減小；當(dāng)pH為等電點(diǎn)4.2時(shí)，UEOPI和FEOPI的起泡性分別為10.36%和9.89%；泡沫穩(wěn)定性分別為64.52%和60.89%。當(dāng)pH在4.2～12時(shí)，起泡性隨著pH的升高而增加。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解性對(duì)它的起泡性有非常大的影響，pH值的變化改變了分離蛋白所帶電荷的狀態(tài)和數(shù)量，引起了其溶解度的變化，從而改變了蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。UEOPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于FEOPI，原因是超聲作用使蛋白質(zhì)內(nèi)疏水基團(tuán)暴露，降低了氣-水界面的表面張力，有效改善了蛋白的起泡性[25]；超聲波作用可使蛋白質(zhì)變形、展開(kāi)，暴露出更多疏水區(qū)域，提高了泡沫穩(wěn)定性。

圖12 pH對(duì)2種蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.12 The effect of pH values on the foamability and foaming stability of two proteins

3 結(jié)論

UEOPI和FEOPI的提取率分別為53.85%和46.54%，分離蛋白的純度依次為91.306%、93.923%，提取時(shí)間分別為20 min和30 s。UEOPI與FEOPI的SDS-PAGE電泳圖表明，兩種分離蛋白的分子量范圍均為14.4～50 kDa，但SDS-PAGE圖譜在20.0～31.0 kDa范圍內(nèi)UEOPI相對(duì)FEOPI多了兩條淺色條帶，表明UEOPI的蛋白組成更多樣。UEOPI比FEOPI有更好的DPPH、ABTS、O2-、OH自由基清除能力和還原力，有更高的NSI、WHC、EAI、ES、起泡性和起泡穩(wěn)定性。綜上所述，超聲輔助提取紫蘇籽粕蛋白在功能性質(zhì)方面相比閃提輔助更有優(yōu)勢(shì)。