紅曲發酵藜麥種子液培養及固態發酵條件優化

賀圣凌，林雨蝶，鄧茹月，周羅娜，趙興麗，羅林麗，周玉鋒*

(1.貴州省農業科學院生物技術研究所，貴陽 550006；2.貴州省農業生物技術重點實驗室，貴陽 550006；3.大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；4.貴州省農業科學院水稻研究所，貴陽 550006)

藜麥(Chenopodiumquinoa)為莧科的藜亞科藜屬(ChenopodiumL.)植物，是一種具有較高營養價值的安第斯原始假性谷物，與傳統谷物相比具有更高的營養價值，在安第斯山地區已有超過7000年的種植歷史，是古印加民族的主要糧食作物之一，藜麥蛋白質含量較高，優于中國食物成分表公布的其他谷物，藜麥中不僅含有豐富的蛋白質、脂肪、淀粉、維生素等常規營養成分，而且含有多酚、黃酮、皂苷等生理活性物質[1-6]，2020年，陳志婧等[7]對藜麥的營養成分進行對比分析，證實藜麥含有豐富的礦質元素，其K、Ca、Cu、Mg的含量都高于小麥、水稻和小米。2019年，翁正杭等[8]對金針菇在藜麥固態培養基上的發酵條件進行了探討，表明藜麥可以為金針菇提供充足的碳源及氮源。目前，藜麥的食用方式主要以粥類為主，2020年，梁霞等[9]研究了藜麥八寶粥的制備工藝，樂梨慶等[10]研發了藜麥奇亞籽沖調粉，和麗媛[11]研發了紅薯藜麥餅干，閆志鵬[12]研制了藜麥姜汁酸奶。除了在食用方面，藜麥也開始應用于化妝品，2020年，丁瑞瑞等[13]研究了藜麥淀粉微球的制備。紅曲菌作為藥食兩用絲狀真菌，在中國已有1000多年的歷史。使用紅曲菌能產生多種次級代謝產物，例如紅曲色素、莫納可林K (Monacolin K,MK)、γ-氨基丁酸(GABA)等，其中部分代謝產物具有降血壓、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等重要的生理活性[14-15]。紅曲菌不僅作為米制品發酵，也常用于釀酒工藝中，2020年，李富強等[16]證實了紅曲菌應用于釀酒可以明顯提升原酒質量。2016年，馬帥等[17]利用紅曲發酵豆漿成功生產Monacolin K。紅曲還常用于中藥研究，2016年，楊靜云[18]利用山楂、澤瀉、決明子與紅曲霉混合發酵制備了降脂中藥。目前，藜麥發酵食品極少，而紅曲菌的功效廣泛，若能選擇紅曲菌發酵藜麥，將益生菌與高營養食物相結合，通過生物轉化，為藜麥開發功能性發酵食品提供了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：紅藜麥：產自山西忻州，由繁峙縣玥晨貿易有限公司提供。

菌種：紫紅曲霉3.4629(Monascuspurpureus)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

試劑：蛋白胨(BS)、蔗糖(AR)、硫酸鎂(AR)、PDA培養基(BR)、營養瓊脂(BR)、無水乙醇(AR)。

1.2 儀器與設備

Epoch2酶標儀 美國BioTek公司；GI100DP型立式壓力蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司；BSD-YX3400搖床、BSP-250生化培養箱 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；SJ-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲菌孢子懸浮液的制備

取活化好的紅曲菌斜面試管，在無菌操作臺加上入無菌水，用接種環輕輕刮取瓊脂表面，使其孢子被順利刮下，將孢子懸浮液置于帶玻璃珠的無菌三角瓶中，充分振蕩，用無菌濾紙過濾，再以血球計數板計數，確保孢子濃度達106個/mL。

1.3.2 紅曲發酵藜麥種子液培養條件的優化

以藜麥添加量為100 g/L、蔗糖(碳源)添加量為30 g/L、蛋白胨(氮源)添加量為30 g/L、硫酸鎂(無機鹽)添加量為1 g/L配制藜麥種子液，分別以接種量、初始pH值、裝液量為因素進行單因素試驗。

1.3.2.1 接種量對種子液培養的影響

將配制好的種子液50 mL置于250 mL三角瓶中，種子液的初始pH值為自然值，分別按5%、10%、15%、20%、25%的接種量接入紅曲菌孢子懸浮液，溫度為30 ℃，于轉速為180 r/min的搖床中培養5 d，測定種子液的菌體干重。

1.3.2.2 初始pH值對種子液培養的影響

將配制好的藜麥種子液50 mL置于250 mL三角瓶中，按10%的接種量接入紅曲菌孢子懸浮液，分別調節初始pH值為3，4，5，6，7，溫度為30 ℃，于轉速為180 r/min的搖床中培養5 d，測定種子液的菌體干重。

1.3.2.3 裝液量對種子液培養的影響

分別量取配制好的藜麥種子液30，40，50，60，70，80 mL于250 mL三角瓶中，按10%的接種量接入紅曲菌孢子懸浮液，種子液初始pH值為自然值，溫度為30 ℃，于轉速為180 r/min的搖床中培養5 d，測定種子液的菌體干重。

正交試驗設計：根據單因素試驗結果，設計以接種量、初始pH值和裝液量為因素，以菌體干重為評定指標的正交試驗，綜合分析單因素試驗，設計三因素四水平正交試驗(見表1)，對正交試驗進行極差分析及方差分析，篩選出最優種子液培養條件。

表1 種子液正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment of seed liquid

1.3.3 藜麥-紅曲固態發酵條件的優化

根據1.3.2試驗結論培養最優藜麥-紅曲種子液，分別以蒸料時間、接種量、料液比、發酵時間、發酵溫度為因素進行單因素試驗。

1.3.3.1 蒸料時間對藜麥-紅曲固態發酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，分別于105 ℃蒸煮20，30，40，50，60 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無菌玻璃棒攪拌均勻，于31 ℃培養箱中培養7 d，利用酶標儀測定其色價。

1.3.3.2 接種量對藜麥-紅曲固態發酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，分別按5%、10%、15%、20%、25%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無菌玻璃棒攪拌均勻，于31 ℃培養箱中培養7 d，利用酶標儀測定其色價。

1.3.3.3 料液比對藜麥-紅曲固態發酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，分別以料液比為1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，無菌玻璃棒攪拌均勻，于31 ℃培養箱中培養7 d，利用酶標儀測定其色價。

1.3.3.4 發酵時間對藜麥-紅曲固態發酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無菌玻璃棒攪拌均勻，分別于31 ℃培養箱中培養6，7，8，9，10 d，利用酶標儀測定其色價。

1.3.3.5 發酵溫度對藜麥-紅曲固態發酵的影響

精確稱取20 g藜麥于250 mL三角瓶中，以料液比為1∶1加入蒸餾水，于105 ℃蒸煮30 min，按10%的接種量接入藜麥-紅曲種子液，用無菌玻璃棒攪拌均勻，分別于25，28，31，34，37 ℃培養箱中培養7 d，利用酶標儀測定其色價。

正交試驗設計：根據單因素試驗結果，設計以蒸料時間、接種量、料液比、發酵時間、發酵溫度為因素，以色價為評定指標的正交試驗，綜合分析單因素試驗，設計五因素五水平正交試驗(見表2)，對正交試驗進行極差分析及方差分析，篩選出最優藜麥-紅曲固態發酵培養條件。

盡管自我表露大部分是建立在親密關系的基礎上[23]，但有關研究表明，網絡交互以及其他以互聯網為基礎的溝通都可以促使用戶進行較高程度的自我表露。例如，Rheingold (2001) 的研究表明，許多人會通過網絡空間的溝通建立新的有意義的聯系，相對于傳統的面對面聊天而言，借助“媒介”進行溝通會使得人們很自然地向他人呈現出自己更為私密的信息。

表2 固態發酵正交試驗因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment of solid-state fermentation

1.3.4 數據處理

采用SPSS 22.0數據分析軟件對正交試驗結果進行顯著性分析，使用Excel 2010軟件對數據進行統計分析并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 紅曲發酵藜麥種子液培養條件優化

2.1.1 單因素試驗結果與分析

由圖1可知，不同紅曲菌孢子懸浮液的接種量對種子液培養中菌體干重的影響顯著，當接種量為5%時，菌體干重為0.023 g/mL，當接種量為10%時，菌體干重提升至0.049 g/mL，但當菌體接種量提升至15%時，菌體干重反而降低至0.042 g/mL，隨著菌體接種量繼續提升，菌體干重繼續略微降低，但當接種量繼續提升至25%時，菌體干重大幅度降低至0.034 g/mL。這可能是由于菌體接種量過大，培養體系內養分有限，經過較短時間的生長繁殖后，菌群迅速進入衰亡期，因而導致接種量過高、菌體干重過低的情況發生。

圖1 接種量對種子液培養的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on seed liquid culture

續 表

由圖2可知，不同的初始pH值對種子液培養情況的影響也較為顯著，當初始pH值為3時，菌體干重為0.043 g/mL，當初始pH值為4時，菌體干重略微上升至0.045 g/mL，當初始pH值為5時，菌體干重顯著上升至0.050 g/mL，而當初始pH值為6和7時，菌體干重則顯著下降，因為紅曲菌是嗜酸喜醇的好氧菌，通常最適pH值在4～5之間，而在最適范圍內，細胞酶活性較高，菌體生長速率也較高，故當pH值酸性降低時，紅曲菌的繁殖能力降低。

圖2 初始pH值對種子液培養的影響Fig.2 Effect of initial pH value on seed liquid culture

由圖3可知，裝液量對種子液培養的影響也較顯著，裝液量由30 mL增加至40 mL時，菌體干重由0.045 g/mL降至0.040 g/mL，但當裝液量為50 mL時，菌體干重最高，達0.048 g/mL，之后隨著裝液量的增加，菌體干重降低，因為當裝液量較低時，為菌體提供的培養體系養分有限，但當裝液量過高時，溶氧量降低，對于好氧紅曲菌而言，會影響菌體代謝，導致菌體的繁殖能力降低。

圖3 裝液量對種子液培養的影響Fig.3 Effect of liquid amount on seed liquid culture

在接種量、初始pH值及裝液量等單因素試驗的基礎上，設定了以菌體干重為評定指標的三因素四水平正交試驗，正交試驗結果及極差分析見表3。

表3 種子液正交試驗表Table 3 The orthogonal test of seed liquid

由表3可知，主次順序為B>A>C，說明初始pH值對種子液菌體生長的影響最大，其次是接種量，再次是裝液量，試驗因素的最優組合為A3B3C1，即種子液的最佳培養條件為接種量20%，初始pH值5，裝液量30 mL/250 mL。用最優組合方案進行驗證試驗，測得菌體干重為57.13 g/L，優于各正交試驗。

根據表3中正交試驗結果，采用SPSS 22.0軟件進行方差分析，結果見表4。

表4 種子液正交試驗方差分析表 Table 4 ANOVA of orthogonal test of seed liquid

由表4方差分析可知，初始pH值對種子液擴大培養的影響極顯著(P<0.01)，接種量和裝液量的影響不顯著(P>0.05)，但3個因素影響程度的大小排序與表3中極差分析結果一致，均是B>A>C。

2.2 藜麥-紅曲固態發酵條件優化結果與分析

2.2.1 單因素試驗結果與分析

由圖4可知，接種量對固態發酵后色價的影響顯著，接種量分別為5%和20%時，其色價較高，且在5%～25%之間，色價波動較大，故選擇5%、10%、15%、20%、25%為因素水平。

圖4 接種量對固態發酵的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on solid-state fermentation

由圖5可知，料液比對固態發酵色價的影響也較為顯著，當料液比為1∶1.2時，色價最低(1.112 U/g)，當料液比為1∶0.8時，色價最高，為16.617 U/g，二者之間的差距極大，隨著料液比的降低，發酵物的色價波動較大，故選擇1∶0.6～1∶1.4為因素水平。

圖5 料液比對固態發酵的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on solid-state fermentation

由圖6可知，隨著發酵時間的延長，色價出現不同程度的上升，直到第10天，色價略微降低。

圖6 發酵時間對固態發酵的影響Fig.6 Effect of fermentation time on solid-state fermentation

由圖7可知，發酵溫度在31 ℃時，色價極顯著高于其他溫度。

圖7 發酵溫度對固態發酵的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on solid-state fermentation

由圖8可知，蒸料時間在40 min時色價最高，蒸料時間在50 min時色價最低，當蒸料時間繼續增加至60 min時，色價又出現顯著提升的趨勢。通過單因素試驗，為后續的正交試驗方案設計提供了因素及水平。

圖8 蒸料時間對固態發酵的影響Fig.8 Effect of steaming time on solid-state fermentation

續 表

2.2.2 正交試驗結果及分析

在蒸料時間、接種量、料液比、發酵時間、發酵溫度等單因素試驗的基礎上，設定了以色價為評定指標的五因素五水平正交試驗(見表2)，其正交試驗結果及極差分析見表5。

表5 固態發酵正交試驗表Table 5 The orthogonal test of solid-state fermentation

由表5中的正交試驗結果及極差分析可知，主次順序為E>D>A>B>C，說明發酵溫度對固體發酵中菌體生長的影響最大，隨后依次是發酵時間、蒸料時間、接種量和料液比，根據k值和R值可確定試驗因素的最優組合為A4B3C3D5E3，即藜麥-紅曲固態發酵最佳培養條件為蒸料時間為50 min，接種量為15%，料液比為1∶1，發酵時間為10 d，發酵溫度為31 ℃。

根據表5的正交試驗結果，采用SPSS 20軟件進行方差分析，結果見表6。

表6 固態發酵正交試驗方差分析表Table 6 ANOVA of orthogonal test of solid-state fermentation

由表6方差分析可知，發酵溫度對固態發酵的影響表現為顯著(P<0.05)，其余4個因素對固態發酵影響不顯著(P>0.05)。5個因素對藜麥-紅曲固態發酵影響程度的大小排序為E>A>D>B>C，該排列順序與極差分析大致一致，但存在不同，在極差分析中發酵時間的影響程度大于蒸料時間，但在方差分析中蒸料時間的影響程度大于發酵時間，但一般認為方差分析結果比極差分析更精準，極差分析主觀性較強，極差只指明了測定值的最大離散范圍，而未能利用全部測量值的信息，故此試驗以方差分析結果為準。

3 結論

藜麥被FAO認定為唯一一種單作物即可滿足人類所需的全部營養的糧食[19-20]，毋庸置疑，其營養價值極高，但目前藜麥的食用方法極少。紅曲菌具有一定的抗“三高”功效，且其次級代謝產物也具有抗氧化活性。本文首次提出將益生菌紅曲菌與藜麥相結合，通過生物轉化進一步提高藜麥的食用價值及營養價值，探究紅曲發酵藜麥種子液的培養條件及固態發酵條件，當接種量為30%，初始pH值為5、裝液量為30 mL/250 mL時種子液菌體生長情況最優，菌體重量達57.13 g/L，當蒸料時間為50 min，接種量為15%，料液比為1∶1，發酵時間10 d，發酵溫度為31 ℃時，紅曲-藜麥固態發酵菌體色價最優，達11.12 U/g。通過該試驗方案，可為后期開發藜麥發酵食品提供基礎，進一步提高藜麥的可食用性。