超聲波輔助提取豬骨素的工藝研究

馮 嫣

(呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000)

我國骨資源豐厚，但綜合利用率低[1]。過剩的豬骨被加工成飼料或低附加值的產品，造成嚴重的浪費。過剩的豬骨發生腐敗變質還會對周圍環境造成一定的污染。因此，對豬骨資源的可持續利用的研究顯得尤為重要。骨素又稱鮮骨提取物，是以可食性動物的骨為生產原料，利用熱壓、抽提、酶解、熱壓抽取和分離等技術，得到易被人體吸收利用的蛋白質、脂肪、礦物質等營養成分，經過脫脂和一系列衍生化處理得到的骨源食品[2]。本文旨在處理肉品加工中動物骨骼無法高效利用、開發的產品附加值低的問題，以及解決資源短缺，促進環境保護的目的，從而進一步促進畜骨資源的綜合利用。

續 表

續 表

我國人民食用豬肉比較多，新鮮的骨骼資源非常豐富，但綜合利用率有待進一步提高。通常，將肉干燥后將新鮮的肉和骨頭除去，然后磨成粉末制成動物飼料，將新鮮的肉骨頭切成小塊，作為大骨頭湯的基礎材料，或制成方便面調味湯和提取豬肉蛋白質、多肽等。骨膠原多肽(以下簡稱骨肽)是從動物骨中提取的活性多肽物質[3]。骨骼再利用屬于肉類深加工。

超聲波有機械產生和磁、電振動等。超聲波是頻率大于16 kHz[4]的機械彈性波，不會引起聽覺失常。超聲波輔助提取法作為一種優良的提取方法，具有操作簡單快捷、提取率高和不破壞提取物結構等優點[5]，具有廣闊的應用前景。超聲波處理豬骨不僅可以提高處理后可溶性蛋白質的提取率、豬骨的溶解度和香氣[6]，還可以優化提取速度，提高調味料的提取質量。蠶蛹油的超聲輔助提取明顯優于純溶劑提取，大大縮減了提取時間，提取質量也良好[7]。同時，在制備骨素的過程中，使用蛋白酶進行水解使提取物中的游離氨基酸增多[8]，而且可以改善骨的味道。

骨中不僅含有大量蛋白質、脂肪、灰分等人體所必需的常量元素，還富含鈣、磷等微量元素，可作為食品創新研發的一個營養源。肉類香精作為輔料，穩定性更強，香味更濃郁，品質更高。因此，國內外有許多人對這方面進行了研究，俞苓等進行了豬骨素萃取，通過檢測3項數值，確定了最佳提取條件；張志宇等進行了酶解蛋白的試驗，得出了酶解豬骨的最佳流程；王朝旭等比較了不同蛋白酶對豬骨水解效果的差異[9]；冷雪嬌等研究了超聲波在各種肉制品中的應用，如肉類嫩化、肉制品腌制、肉品殺菌、肉的無損檢測、肉類調味湯料等，充分肯定了超聲波的作用。超聲波除了能夠加快木瓜蛋白酶的水解速度，還可以提質和優化反應條件[10-11]，同時增強了提取作用。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮豬骨：購于呂梁星瑪客超市；木瓜蛋白酶、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、氫氧化鈉：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設備

ALB-224電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；3ST759-3恒溫水浴鍋 宏華儀器設備工貿有限公司；101-2AS電子恒溫鼓風干燥箱 北京市永光明醫療儀器廠；LB-90T手持式折光儀 廣州市速為電子科技有限公司；QFN-650Y超聲波細胞破碎儀 上海喬楓實業公司；2500c高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.3 工藝流程

原料選擇及處理→豬骨解凍→切塊或粉碎→稱量→加酶→超聲波提取→過濾并離心→測定。

1.4 單因素試驗設計

以豬骨素提取液中的可溶性固形物和蛋白質含量為測定指標，分別考察超聲溫度、超聲功率、超聲時間、加酶量、料液比對酶解超聲波提取效果的影響，初步確定因素與水平。

1.5 響應面優化試驗設計

選取對試驗影響較大的單因素水平為響應變量，根據以下試驗設計，確定超聲波提取豬骨素的最佳工藝流程[12]。通過進行一系列試驗，檢測兩項指標，確定最佳提取方法。

1.6 考察指標與測定方法

1.6.1 可溶性固形物含量的測定

采用阿貝折光儀通過蒸餾水進行校準，待刻度為0時，將蒸餾水擦干。取1～2滴樣液置于棱鏡上，迅速合上蓋板，使溶液均勻涂布在棱鏡表面，將光窗對準光源并同時調節目鏡視度圈，直至視場視野清晰，視場中明暗分界線對應讀數即該溶液的可溶性固形物含量。記錄測定時的溫度，若測定溫度不是20 ℃，可得出對應的修正值[13]。

1.6.2 蛋白質含量的測定

根據凱氏定氮法[14]進行測定。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 超聲溫度對豬骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質含量的影響

由圖1可知，在其他條件一致時，溫度對豬骨素提取效果的影響較大。隨著超聲溫度的不斷升高，豬骨提取液中可溶性固形物和蛋白質的含量總體呈現先上升后下降的趨勢，并且溫度對二者的影響趨于一致。當溫度低于50 ℃時增長緩慢，而當溫度高于50 ℃時，浸出物含量大大增加。隨著溫度的升高，水解度增加。當溫度達到60 ℃時，溫度達到最高值并出現了轉折，隨后出現了緩慢降低的趨勢。結果表明，豬骨中可溶性固形物和蛋白質的浸出主要在60 ℃以下進行，適當的溫度升高對豬骨素的提取有利，但高于此溫度后則會影響酶的活力甚至導致酶變性失活，從而影響豬骨素的提取率，確定最佳溫度為60 ℃。

圖1 不同超聲溫度對提取效果的影響Fig.1 Effect of different ultrasonic temperatures on the extraction effect

2.1.2 超聲功率對豬骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質含量的影響

由圖2可知，在其他條件相同時，功率對豬骨素提取率的影響不大，總體變化趨勢相對來說比較平緩。當超聲波功率在150～280 W范圍內，提取率呈緩慢上升的趨勢。當超聲波功率在280 W時，檢測數值達到最大值。此時，隨著功率的增加，超聲波的機械振動和磁振動作用也逐漸增強，酶的活性也逐漸增強并對提取有協同增效的作用，從而促進了豬骨中蛋白質和固形物的浸出。但是當功率超過280 W，提取效率又降低。試驗結果表明，當超聲波溫度在280 W時，兩項指標均達到最大值，提取效果更好，為最合適的超聲功率。

圖2 不同超聲功率對提取效果的影響Fig.2 Effect of different ultrasonic power on the extraction effect

2.1.3 超聲時間對豬骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質含量的影響

由圖3可知，以其他條件相同為前提，不同的時間設置對提取物提取的影響較大。在1～3 h范圍內，豬骨中浸出物隨著超聲處理時間的不斷延長而逐漸地增加，并在3 h達到最大值。這是因為超聲波的機械振動和磁振動作用會隨著超聲時間的增加而逐步增加。但提取時間超過3 h，蛋白的水解程度大于含氮浸出物和可溶性固形物的浸出速度。因此，增加趨勢相對緩慢，隨著時間的延長出現下降的趨勢。從試驗數據可以得出，在超聲波提取豬骨過程中，對于超聲時間的把握也很重要，適宜增加提取時間有利于提高豬骨素的提取率，但超過一定時間反而不利于提取。超聲時間為3 h時提取效果最佳。

圖3 不同超聲時間對提取效果的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

2.1.4 加酶量對豬骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質含量的影響

在料液比為100∶120(g/mL)、超聲功率為240 W、超聲溫度為60 ℃、超聲時間為3 h的條件下，研究酶對提取率的影響，見圖4。

圖4 不同加酶量對提取效果的影響Fig.4 Effect of different enzyme additive amount on the extraction effect

由圖4可知，在一定范圍內添加的酶越多，酶的水解速率越高。當木瓜蛋白酶的添加量在0%～1.3%范圍內時，隨著酶添加量的增加，豬骨中可溶性固形物和蛋白質的含量也隨之增加。在1.3%時達到最大值，超過此范圍后，豬骨中可溶性固形物和蛋白質的含量隨酶添加量的增加而降低。酶的添加量不能過高也不能過低，這可能是因為酶添加量過低，少量的酶無法與全部的底物結合進行反應，導致水解不完全，從而降低提取率。加大酶添加量，使酶與全部的底物進行結合，可加快水解的進行，提高浸出物的得率。但酶的添加并非越多越好，過量的酶會殘留在提取液中，影響提取率。

2.1.5 料液比對豬骨素提取液中可溶性固形物和蛋白質含量的影響

在木瓜蛋白酶添加量為1%、超聲功率為240 W、超聲溫度為60 ℃、超聲時間為3 h時研究料液比對提取結果的影響，結果見圖5。

圖5 不同料液比對提取效果的影響Fig.5 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

料液比是指豬骨質量和水的比值,對提取結果有影響[15]。此外，料液比對提取率的影響很大。由圖5可知，隨著料液比的增加,提取率整體呈現先上升后下降的趨勢。物料與液體的比例在100∶80～100∶120(g/mL)之間時提取率呈緩慢增長的趨勢。料液比為100∶120(g/mL)時，水解程度最大，提取率最高。料液比在100∶120～100∶160(g/mL)之間，提取率降低。底物濃度過低或者過高都不利于進一步研究。酶的反應速度和水解度隨著底物濃度的增加而增加，酶與底物結合時反應速度和水解程度都達到最大值。因此，最佳料液比為100∶120(g/mL)。

2.2 響應面優化試驗結果與分析

2.2.1 方差分析

表1 優化響應面試驗的因素水平表Table 1 The factors and levels of optimized response surface test

利用 Design-Expert(response surface regression)8.0.6 軟件對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到可溶性固形物含量(Y1)、蛋白質含量(Y2)對超聲溫度(A)、超聲功率(B)、超聲時間(C)、加酶量(D)的回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

Y1=+25.20+1.00A+0.69B+1.01C+0.57D+0.183AB-0.13AC+0.55AD-0.47BC-0.32BD+0.23CD-3.27A2-2.18B2-2.61C2-2.65D2。

Y2=+22.91+0.84A+1.37B+0.31C+0.42D+0.30AB-0.085AC-0.22AD-0.44BC-0.21BD+0.37CD-3.71A2-2.37B2-3.68C2-3.31D2。

以可溶性固形物和蛋白質含量為響應值的響應面方差分析結果見表3和表4。

表3 響應面方差分析結果(可溶性固形物含量)Table 3 The variance analysis results of response surface (soluble solid content)

表4 響應面方差分析結果(蛋白質含量)Table 4 The variance analysis results of response surface (protein content)

由表3可知，響應面模型的P<0.001，表明響應面的回歸方程達到了非常顯著的水平，其中失擬項的P值是0.2788>0.05，即模型的失擬項不顯著，說明回歸模型具有良好的模擬程度。相關系數R2為0.9726，模型的校正決定系數RAdj2為0.9453，說明該模型能解釋94.53%響應值的變化，誤差小，可用來預測試驗結果。響應面的顯著性分析結果表明，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對豬骨中可溶性固形物含量的影響極顯著(P<0.01)。在所取的各個因素水平范圍內，對豬骨中可溶性固形物提取率的影響排序為：超聲時間>超聲溫度>超聲功率>加酶量(C>A>B>D)。

由表4可知，響應面模型的P<0.001，表明響應面的回歸方程達到了非常顯著的水平，其中失擬項的P值是0.0926>0.05，即模型的失擬項不顯著，說明回歸模型具有良好的模擬程度。R2為0.9865，模型的校正決定系數RAdj2=0.9729，說明該模型能解釋97.29%響應值的變化，測量值與真實值之間的差距小，可用來預測試驗結果。響應面的顯著性分析結果表明，A、B、D、A2、B2、C2、D2對豬骨中蛋白質含量的影響極顯著(P<0.01)；C對豬骨中蛋白質含量的影響顯著(P<0.05)。對所取的各個因素水平范圍內，對豬骨中蛋白質提取率的影響排序為：超聲功率>超聲溫度>加酶量>超聲時間(B>A>D>C)。

2.2.2 響應面分析與優化2.2.2.1 可溶性固形物

為研究相關變量之間的交互作用及最優點，通過Design-Expert軟件繪制可溶性固形物含量的響應面曲線圖與等高線圖進行分析，見圖6～圖12。

由圖6可知，等高線沿超聲溫度軸線條變化較超聲功率密集且等高線圖接近圓形，說明超聲溫度對提取的影響比超聲功率稍大。這代表超聲溫度和超聲功率的交互作用較弱，對豬骨素中可溶性固形物含量的提取沒有顯著影響。由三維圖可知，超聲溫度接近60 ℃、超聲功率280 W時提取效果好。

圖6 不同超聲溫度和超聲功率交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic power

由圖7可知，等高線接近圓形，說明超聲時間和超聲溫度的交互作用對豬骨素中可溶性固形物提取率的影響不大。由響應面圖可知，溫度恒定時，隨著超聲時間的延長，提取效果總體為先上升后降低的趨勢。當溫度接近60 ℃、時間為3 h時，提取效果極佳。

圖7 不同超聲溫度和超聲時間交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic time

由圖8可知，等高線接近橢圓形，代表超聲溫度和加酶量的相互作用對豬骨素中可溶性固形物的提取有顯著的影響。由響應面圖可知，隨著超聲溫度(A)的增加，提取效果總體為先上升后降低的趨勢，且A的P值<0.01，即溫度對提取效率的影響極顯著。超聲溫度在60 ℃、酶添加量為1.3%時，提取效率最佳。

圖8 不同超聲溫度和加酶量交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and enzyme additive amount

由圖9可知，隨著超聲時間的增加，可溶性固形物的得率呈現出先升高后降低的趨勢。等高線接近橢圓形，代表超聲功率和超聲時間的相互作用對豬骨素中可溶性固形物的提取沒有顯著的影響。同時，超聲時間的等高線軸的線條分布更為緊密，說明超聲時間對提取效果的影響比超聲功率更大。超聲功率接近240 W、超聲時間為3 h時，提取效果最高。

圖9 不同的超聲功率和超聲時間交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and ultrasonic time

由圖10可知，等高線接近橢圓形，代表超聲功率和加酶量的相互作用對豬骨素中可溶性固形物的提取沒有顯著的影響。由響應面圖可知，超聲功率接近240 W、酶的添加量為1.3%時提取率高。

圖10 不同超聲功率和加酶量交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.10 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and enzyme additive amount

由圖11可知，等高線接近橢圓形，表明超聲時間與酶添加量的交互作用影響不顯著，由響應面圖可知，酶的添加量為1.3%、超聲時間達到3 h時豬骨素的提取效果最佳。

圖11 不同超聲時間和加酶量交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.11 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic time and enzyme additive amount

2.2.2.2 蛋白質含量

蛋白質含量的等高線圖與響應面圖分析見圖12～圖17。

由圖12可知，等高線接近圓形，說明超聲溫度和超聲功率的交互作用對豬骨素中蛋白質含量的影響不明顯。由響應面圖可知，隨著溫度(A)的增加，提取率呈先上升后降低的趨勢，且A的P<0.01，即溫度對提取效率的影響極顯著。超聲溫度接近60 ℃、功率為280 W時豬骨中蛋白質提取率最高。

圖12 不同的超聲溫度和超聲功率交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.12 Response surface and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic power

由圖13可知，等高線接近橢圓形，說明超聲時間和超聲溫度的交互作用對豬骨素中蛋白質提取率的影響很小。由響應面圖可知，隨著超聲溫度(A)的增加，提取效果總體為先上升后降低的趨勢，且A的P值<0.01，即溫度對提取效率的影響極顯著。超聲溫度接近60 ℃、超聲時間為3 h時提取效果最佳。

圖13 不同超聲溫度和超聲時間交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.13 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and ultrasonic time

由圖14可知，等高線接近橢圓形，說明超聲溫度和加酶量的相互作用對豬骨素中蛋白質提取的影響不顯著。由響應面圖可知，隨著超聲溫度(A)的增加，提取效果總體為先上升后降低的趨勢，且A的P值<0.01，即溫度對提取效率的影響極顯著。超聲溫度接近60 ℃、酶的添加量接近1.3%時豬骨中蛋白質的提取效果最好。

圖14 不同的超聲溫度和加酶量交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.14 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic temperatures and enzyme additive amount

由圖15可知，隨著超聲功率的升高，提取率逐漸升高到最大而后逐漸下降。等高線接近橢圓形，說明超聲功率與超聲時間的交互作用影響不顯著。由響應面圖可知，沿超聲功率軸等高線的線條分布比超聲時間緊密，說明超聲功率對結果的影響比超聲時間更為顯著。當超聲功率接近240 W、超聲時間達到3 h時豬骨中蛋白質的提取效果最佳。

圖15 不同超聲功率和超聲時間交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.15 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and ultrasonic time

由圖16可知，隨著超聲功率的提高，提取率逐漸升高到最大而后逐漸下降。等高線圖為橢圓形，表明超聲功率與加酶量的交互作用影響不顯著。由響應面圖可知，當超聲功率接近240 W、酶的添加量接近1.3%時豬骨中蛋白質的提取效果最佳。

圖16 不同超聲功率和加酶量交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.16 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic power and enzyme additive amount

由圖17可知，等高線接近橢圓形，表明超聲時間與加酶量的交互作用影響較小。由響應面圖可知，當超聲時間達到3 h且酶的添加量為1.3%左右時豬骨中蛋白質的提取效果最佳。

圖17 不同超聲時間和加酶量交互作用下的響應面圖和等高線圖Fig.17 Response surface diagram and contour plot under the interaction of different ultrasonic time and enzyme additive amount

2.3 最佳工藝配方的確定和驗證

采用Design Expert軟件對試驗數據進行進一步的優化處理，得出超聲溫度62 ℃、超聲功率290 W、超聲時間3.3 h、加酶量1.3%、料液比100∶138(g/mL)的最佳配方。對其進行驗證測試，并且進行3組平行試驗，數據結果顯示此方法提取率最高。測得豬骨中可溶性固形物含量為25.5 °Bx和蛋白質含量為23.12 g/mL，此測定結果與預測數值非常接近，說明此模型擬合程度較高，有利于豬骨素提取工藝的研究。

3 結論

畜禽肉類富含各種營養元素，是人們日常飲食生活中不可缺失的一部分，因此動物鮮骨的綜合利用也顯得尤為重要。本文通過響應面試驗得到了超聲波提取豬骨素的最佳條件，具體結論如下：

(1)根據單因素試驗確定了超聲波提取豬骨素的最佳工藝為：超聲溫度60 ℃、超聲時間3 h、超聲功率240 W、加酶量1.3%、料液比100∶130(g/mL)。同時試驗表明骨素酶解前超聲能使骨素結構疏松，增加骨素表面的酶作用位點。

(2)通過響應面驗證試驗分析得出關于可溶性固形物含量(Y1)對超聲溫度(A)、超聲功率(B)、超聲時間(C)、加酶量(D)的回歸方程為：

Y1=+25.20+1.00A+0.69B+1.01C+0.57D+0.183AB-0.13AC+0.55AD-0.47BC-0.32BD+0.23CD-3.27A2-2.18B2-2.61C2-2.65D2。

數據表明回歸方程與實際值擬合度高，可用其預測結果。

(3)通過響應面驗證試驗分析得出關于蛋白質含量(Y2)對超聲溫度(A)、超聲功率(B)、超聲時間(C)、加酶量(D)的回歸方程為：

Y2=+22.91+0.84A+1.37B+0.31C+0.42D+0.30AB-0.085AC-0.22AD-0.44BC-0.21BD+0.37CD-3.71A2-2.37B2-3.68C2-3.31D2。

數據表明回歸方程與實際值擬合良好，可用其預測結果。

(4)根據響應面圖和等高線圖可以反映超聲溫度(A)、超聲功率(B)、超聲時間(C)、加酶量(D)4個重要因素對可溶性固形物和蛋白質的影響，說明兩兩因素的交互作用是顯著的。

(5)運用該模型對試驗結果進行優化，結果為超聲溫度62 ℃、超聲功率290 W、超聲時間3.3 h、加酶量1.3%、料液比100∶138(g/mL)。