膽道閉鎖TGFβ1誘導(dǎo)EMT相關(guān)通路研究進(jìn)展

趙一霖 王皓潔 綜述 詹江華 審校

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）以肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥及肝纖維化為特征，黃疸進(jìn)行性加重為主要臨床表現(xiàn)。病因尚不明確，與病毒感染、免疫反應(yīng)關(guān)系密切［1，2］。BA診斷后應(yīng)先行Kasai手術(shù)，部分患者恢復(fù)膽流后，肝纖維化并沒有停止，自體肝生存率較低，最終需要通過肝移植來挽救生命［3］。延緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療BA的重要環(huán)節(jié)。有研究證實(shí)，BA肝纖維化與膽管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有關(guān)［4］。EMT是指分化成熟的極化上皮細(xì)胞在外界因素的刺激下，獲得某些間質(zhì)細(xì)胞的特征，使其具有更強(qiáng)的活性和遷移性，可促使實(shí)質(zhì)器官纖維化［5，6］。TGFβ1是多功能超家族一員，可影響細(xì)胞分化及細(xì)胞生長。TGFβ1在肝臟中表達(dá)較多，可引起肝臟中肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)肝纖維化［7-9］。研究表明，TGFβ1可通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)BA肝纖維化進(jìn)展［10-12］。肝纖維化的程度、肝內(nèi)膽管閉鎖程度是治療膽道閉鎖重要條件。Kasai術(shù)后，持續(xù)進(jìn)展性肝纖維化是影響自體肝生存率的重要因素，延緩肝纖維化的進(jìn)程在BA治療中起到非常關(guān)鍵的作用［3］。

一、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）

TGFβ是超因子家族中的一員，對細(xì)胞分化、細(xì)胞增生、胚胎發(fā)生、細(xì)胞凋亡等許多細(xì)胞反應(yīng)有重要作用［7］。TGFβ是一種分泌型同型二聚體蛋白，內(nèi)含兩個亞基，每個亞基含有112個氨基酸。保守的Cys殘基形成的分子間二硫鍵將兩個亞基連接成二聚體蛋白［7，13］。TGFβ共有六種亞型：TGFβ1～TGFβ6。TGFβ1在肝臟中活性最高，可被缺氧、細(xì)胞外脂蛋白等刺激激活，對肝纖維化、腫瘤進(jìn)展有重要作用［14］。在BA肝內(nèi)膽管纖維化中，可檢測到TGFβ1的異常升高［7］。實(shí)驗(yàn)證明，在BA肝纖維化中，膽管上皮細(xì)胞TGFβ1與EMT標(biāo)記因子增多［11］。由此可知，TGFβ1可誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)BA肝纖維化。TGFβ1的相關(guān)受體（transforming growth factor-β1 receptor，TβR）、TβRⅠ/TβRⅡ復(fù)合物與TGFβ1結(jié)合，刺激Smad 2/Smad 3復(fù)合物形成，促進(jìn)EMT進(jìn)程［7，9］。

二、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT是指在外界因素的刺激下，成熟的極化上皮細(xì)胞間連接逐漸松解向紡錘體形狀的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞特征，有更強(qiáng)的活性和遷移性，可參與器官纖維化、組織愈合、癌癥遷移等過程［5，6，10，15］。隨著間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化增多，上皮細(xì)胞標(biāo)志因子如E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)素等會逐漸下調(diào)，α-SMA、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1、波形蛋白等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子上調(diào)。其中E-鈣黏蛋白是上皮細(xì)胞間緊密結(jié)合的重要角色，E-鈣黏蛋白的減少促進(jìn)上皮組織松解，有利于向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化［6，16］。Zeisberg、Deng等［16，17］實(shí)驗(yàn)表明，肝星狀細(xì)胞、肝細(xì)胞可發(fā)生EMT。EMT可引起肝纖維化，在BA中也有相關(guān)報(bào)道［4，7，18］。在Deng等［19］的實(shí)驗(yàn)中通過免疫組化、雙標(biāo)記免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)因子S100A4及上皮細(xì)胞相關(guān)因子CK-7在BA纖維化膽管上皮細(xì)胞中共表達(dá)，且S100A4表達(dá)的升高與CK-7降低有關(guān)；S100A4與膠原標(biāo)記物HSP47在BA中也存在共表達(dá)細(xì)胞。Xiao等［20］發(fā)現(xiàn)TGFβ1誘導(dǎo)BA肝纖維化后，CK-7與α-SMA共表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞，隨著肝纖維化加重，共表達(dá)細(xì)胞逐漸減少，表達(dá)α-SMA細(xì)胞逐漸增多，提示間質(zhì)細(xì)胞比例升高。膽道結(jié)扎小鼠模型中同樣發(fā)現(xiàn)EMT過程，伴隨梗阻逐漸加重，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記因子α-SMA在14～21d呈現(xiàn)一個峰值［21］。EMT過程通過促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增多使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）不斷沉積，逐漸導(dǎo)致肝纖維化［5，7，22］。若能夠有效抑制或者逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程，將很好地緩解甚至逆轉(zhuǎn)BA肝纖維化，為提高患者自體肝生存率帶來希望。

三、TGFβ1誘導(dǎo)EMT相關(guān)通路與肝纖維化關(guān)系

（一）TGFβ1/Smad通路

TGFβ1/Smad通路可誘導(dǎo)EMT產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化生長因子-β1受體Ⅰ（transforming growth factor-β1 receptorⅠ，TβRⅠ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1受體Ⅱ（transforming growth factor-β1 receptorⅡ，TβRⅡ）在人類基因組中由5～7個基因編碼，由相似的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶構(gòu)成。TβRⅠ前二聚體與TβRⅡ二聚體形成的異四聚體具有活化功能。在各種因素刺激下，TGFβ1與TβRⅠ/TβRⅡ復(fù)合物相連接，在富含甘氨酸、絲氨酸殘基的近膜域中，TβRⅡ激酶將胞漿內(nèi)Ⅰ型受體中的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化。磷酸化后的殘基區(qū)域募集Smad 2/Smad 3復(fù)合物。TβRⅠ將募集的Smad 2/Smad 3復(fù)合物磷酸化，形成磷酸化-Smad 2/3（p-Smad 2/3）［10，13，22］。p-Smad 2/3逐漸向Smad 4蛋白處移動形成Smad 2/3/4復(fù)合物且不斷堆積。Smad 4蛋白MH1結(jié)構(gòu)域（N-末端結(jié)構(gòu)域，MH1）上的氮端核定位信號進(jìn)入細(xì)胞核，Smad 2/3/4復(fù)合物與特定的DNA具有高度的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子增多，例如Snail、Twist等相關(guān)轉(zhuǎn)化因子，從而促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞生成［7，8，10，13］。間質(zhì)細(xì)胞增多促進(jìn)纖維組織表達(dá)，使ECM不斷沉積，促進(jìn)肝纖維化。丁美云等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在BA肝纖維化早期，TGFβ1、Smad2mRNA表達(dá)較膽管擴(kuò)張組明顯增高，提示TGFβ1/Smad信號通路參與BA肝纖維化過程。

EMT轉(zhuǎn)錄過程可被微小RNA（microRNA，miRNA）影響［25］。在肝臟腫瘤中，miR-542-3-p可以影響TGF-β1/Smad信號通路［26］。BA肝纖維化中同樣存在miRNA促進(jìn)或抑制EMT的情況［22］；miR-29c可以有效抑制小鼠膽管細(xì)胞中TGFβ1誘導(dǎo)EMT［12］；miR-200b可以通過抑制E-鈣黏蛋白阻遏物鋅指蛋白1促進(jìn)E-鈣黏蛋白的生成，進(jìn)而阻抑EMT，減緩肝纖維化［20］。

（二）TGFβ1/ERK通路

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2（extracellular regulated protein kinase 2，ERK2）屬絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，還包括p38和c-Jun氨基末端激酶2（c-Jun N-terminal kinase 2，JNK2）等，是參與生長、分化和凋亡等多種細(xì)胞過程的信號通路。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ERK2與JNK2在BA組織匯管區(qū)及膽管上皮細(xì)胞中均呈陽性表達(dá)［27］。在TGFβ1誘導(dǎo)EMT的過程中，不僅可激活依賴Smad信號通路，還可激活非依賴Smad信號通路。ERK可以通過阻斷Smad2/3復(fù)合物磷酸化及Smad4核易位過程，進(jìn)而影響TGFβ1/Smad通路發(fā)生EMT［28］。

誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT的TGFβ1/ERK獨(dú)立信號通路，可直接通過ERK不依賴Smad引起EMT。有關(guān)研究顯示抑制ERK信號通路可抑制EMT進(jìn)程［29］。ERK參與肝臟腫瘤細(xì)胞EMT的過程中，HepG2細(xì)胞預(yù)先被MEK1/2抑制劑處理，TGFβ1誘導(dǎo)之后EMT標(biāo)志物波形蛋白的分泌明顯減少，說明MEK1/2對肝腫瘤細(xì)胞EMT有重要影響，推測TGFβ1在肝臟細(xì)胞誘導(dǎo)EMT過程存在MEK-ERK通路的參與［27］。有研究表明在BA中輪狀病毒（rhesus rotavirus，RRV）可激活MAPK通路，ERK1/2、JNK1/2磷酸化成倍數(shù)增加，會促進(jìn)病毒的復(fù)制，加劇膽管的損傷［30］。其引起膽管損傷的過程可能與BA纖維化中膽管上皮的纖維化過程有關(guān)。Lobeck等［31］的實(shí)驗(yàn)表明，ERK通路參與RRV在膽管細(xì)胞中的復(fù)制。感染RRV之后的BALB/C小鼠用ERK激活抑制肽Ⅰ處理，結(jié)果有66.7%的小鼠出現(xiàn)膽道梗阻癥狀，而對照組（生理鹽水組）出現(xiàn)梗阻癥狀的比例為100%，21 d死亡率也隨著ERK被抑制而降低，提示ERK參與BA肝纖維化過程。ERK在TGFβ1的誘導(dǎo)下可使肝臟腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，在BA中對纖維化同樣有重要作用，其在BA中的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

（三）TGFβ1/STAT3信號通路

信號轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）與惡性腫瘤、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、EMT有關(guān)。在肺癌和卵巢腫瘤中STAT3可在JAK激酶（janus kinase，JAK）誘導(dǎo)下參與EMT過程，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［32］。

在Lin等［33］的實(shí)驗(yàn)中，利用Western及免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TGFβ1刺激后肝臟細(xì)胞中的波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，而E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)p-JAK、p-STAT3、Twist表達(dá)增多；而STAT3抑制劑AG490作用于TGFβ1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞后，其間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子表達(dá)減少。其實(shí)驗(yàn)表明STAT3、JAK、Twist在TGFβ1的刺激下參與肝臟腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程。Wang等［34］的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TGFβ1誘導(dǎo)肝臟腫瘤細(xì)胞之后，STAT3、p-STAT3及波形蛋白的表達(dá)上調(diào)。在EMT過程中，TGFβ1激活JAK，激活的JAK收集STAT3單體產(chǎn)生同源或異源二聚體；隨后，細(xì)胞核和特定DNA序列調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，其過程與Twist有關(guān)［29，33］。在Luo等［35］的實(shí)驗(yàn)中，通過建立基因數(shù)據(jù)庫及進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BA、原發(fā)性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎中存在包括STAT3在內(nèi)的共同基因。Xiao等［36］的實(shí)驗(yàn)顯示在BA肝組織免疫組化后可見p-STAT3核染色，提示STAT3參與BA肝纖維化過程。BA EMT進(jìn)程還可由非TGFβ1誘導(dǎo)產(chǎn)生，如Notch通路、Hh信號通路、Wnt通路等［37，38］。

四、展望

Kasai手術(shù)的廣泛開展使BA患者獲得更多的生存機(jī)會，但肝纖維化仍可持續(xù)進(jìn)展，故自體肝生存率較低，肝移植率較高。有效緩解甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是改善BA自體肝生存率的重要條件。TGFβ1可通過Smad以及不依賴Smad信號通路誘導(dǎo)EMT發(fā)生，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。抑制EMT過程可緩解BA肝纖維化，然而抑制TGFβ1的做法并不可取，TGFβ1除誘導(dǎo)EMT外，在炎癥抑制、免疫調(diào)節(jié)等多個方面發(fā)揮重要作用，抑制TGFβ1會同時(shí)抑制體內(nèi)其他反應(yīng)。抑制通路中的相關(guān)因子也可以抑制EMT進(jìn)程。miR-200b等相關(guān)miRNA可抑制甚至逆轉(zhuǎn)EMT，其在肝臟腫瘤細(xì)胞中研究較多，可為進(jìn)一步拓展研究提供思路。間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記因子在纖維化過程中存在一個峰值，說明在肝纖維化過程中，可能存在EMT過程較活躍的特殊時(shí)期，此時(shí)抑制通路相關(guān)因子延緩肝纖維化更加容易。目前BA肝纖維化相關(guān)通路研究遠(yuǎn)不及其他肝臟疾病，其誘導(dǎo)EMT相關(guān)信號通路尚不明確。延緩纖維化過程除作用于轉(zhuǎn)錄因子外，是否可以通過作用其細(xì)胞膜中TGFβ1相關(guān)受體而不影響TGFβ1在體內(nèi)的其他重要功能，或特異性截?cái)嘈盘栕园麧{向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程來實(shí)現(xiàn)減緩肝纖維化的作用，還有待發(fā)現(xiàn)更多特異性的相關(guān)因子來實(shí)現(xiàn)。