兒童卵黃囊瘤病因研究進展

許恬逸 綜述 董 瑞 審校

卵黃囊瘤（yolk sac tumor，YST），又稱內胚竇瘤（endodermal sinus tumor），是一種分化為尿囊、胚胎卵黃囊和胚胎外間葉的生殖細胞腫瘤，60%～70%于3歲以前發病［1］。YST作為兒童惡性生殖細胞腫瘤中最常見的一種類型，其惡性程度高、病情進展快，且極易血行轉移［2］。YST可廣泛發生在人體各個部位，以性腺最為常見，除性腺外，盆腔和骶尾部為多見，還可以發生于大腦、脊髓、縱隔、腹膜后、頭頸部等部位［1，3］。諸多學者對該病致病機理及治療進行了大量研究，但其確切病因至今尚不明確。本文就目前國內外兒童卵黃囊瘤的病因學研究進行綜述。

一、遺傳因素

（一）基因突變

1.SALL4基因突變：人類SALL4基因位于20q13.13-q13.2。其中SALL4A（編碼1053個氨基酸）具有全部4個外顯子，包含4個鋅指結構域（Zinc Finger，ZF1～ZF4）；SALL4B（編碼617個氨基酸）是通過另一個剪接供體位點產生的，該位點可導致大量外顯子2和只包含ZF1與ZF4的蛋白缺失；SALL4C（編碼277個氨基酸）沒有外顯子2，它編碼的版本只有ZF1［4］。

關于SALL4的具體突變形式，相關研究較少。已有報道中SALL4突變都是雜合的，且均位于外顯子2和外顯子3中，而在外顯子1或外顯子4中尚未發現突變。這些是無意義的突變、短重復或缺失。除此之外，還有2例在ZF4基因簇編碼區發生的SALL4錯義突變。尚無文獻報道人類SALL4基因內的純合突變，可能是因為這種突變會導致早期的胚胎致死。

Sal-like蛋白4（spalt like transcription factor 4，SALL4）是一種在胚胎干細胞中表達的鋅指轉錄因子，在早期胚胎發育過程中具有重要作用，能聯合其他多能性相關轉錄因子八聚體結合轉錄因子4（recombinant octamer binding transcription factor 4，OCT4）、Nanog同源框（nanog homeobox，NANOG）和Y染色體性別決定盒基因轉錄因子2（SRY-Box transcription factor 2，SOX2）等，構成復雜的轉錄調控網絡，從而維持胚胎干細胞的多能性和自我更新能力［5，6］。有學者發現SALL4在卵黃囊瘤中呈高表達［2］。且已有多次實驗證明，相比傳統標記物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、胎盤堿性磷酸酶（placental alkaline phosphatase，PLAP）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3）等，SALL4是一個非常敏感的新興標記物，不論YST是發生在性腺還是性腺外，其敏感度均接近100%［7，8］。

一方面，SALL4在癌細胞中充當細胞增殖和凋亡的關鍵調節劑。小鼠實驗證實，SALL4敲低會誘導人類多種癌細胞大量凋亡或顯著抑制其生長。此外，SALL4的下調導致癌細胞的細胞周期停滯和凋亡，而過表達SALL4的癌細胞會通過細胞周期蛋白D1和D2的上調，表現出細胞增殖能力增強和G1期細胞數量減少的特征。

比如，SALL4通過募集核小體改構復合體（nucleosome remodeling complex，NuRD）復合物，與NuRD元件組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase2，HDAC2）共同占據其靶基因PTEN啟動子區域，抑制PTEN基因轉錄和翻譯形成的mRNA以及蛋白的水平。而PTEN基因是一種抑癌基因，可在許多癌癥中抑制磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphoinositide 3-Kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）經典信號通路。有實驗證明，SALL4被阻斷時PTEN表達明顯上調，即PTEN與SALL4呈負相關。因此，當SALL4上調時，PTEN基因表達下降，則PTEN對PI3K/AKT信號的抑制作用減弱，從而減弱了在G1期阻滯細胞周期的D1循環水平，促進了腫瘤增殖［9］。

另一方面，SALL4對于維持癌癥干細胞的特性也至關重要。有研究表明，SALL4可以與β-連環蛋白（β-catenin）結合并上調WNT（Wingless Int1）/βcatenin途徑靶基因的表達，即SALL4可能通過與βcatenin的相互作用促進干細胞自我更新并抑制干細胞分化。此外，STAT3有激活介導胚胎干細胞的自我更新和多能性的功能，SALL4可與STAT3相互作用以調節干細胞的自我更新和分化；刺猬信號通路在器官發生和分化過程中起關鍵作用，SALL4可以調節音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號傳導，以防止干細胞分化［10］。

SALL4作為一種轉錄因子可以激活OCT4，并通過形成蛋白質-蛋白質復合物與NANOG相互作用。當OCT4與SALL4啟動子的-290至＋1之間的區域結合后，OCT4的表達會顯著上調SALL4啟動子的活性，即OCT4與SALL4形成了可以相互激活的正反饋回路［11］。而OCT又具有維持干細胞多能性并促進細胞增殖的作用，所以SALL4也可以通過這一途徑加速癌癥進程。因此，SALL4基因發生突變后，可能會通過多種途徑加速卵黃囊瘤細胞增殖，提高其發病率［12］。

2.SOX家族基因突變：在哺乳動物中，SOX基因從A到H分為八類［13］。SOX2基因位于3q26.33［14］。有研究表明，SOX2可以協同轉化正常細胞，使其變為腫瘤細胞。同時，它還是腫瘤中的擴增基因，其過表達可導致惡性過程的發生，從而誘發腫瘤形成。SOX2還參與了一些復雜的信號傳導途徑，Chen等［15］研究表明，SOX2可以與β-catenin協同上調腫瘤細胞中細胞周期蛋白D1（cyclin D1），從而促進細胞增殖和腫瘤發生。其他研究還表明，NANOG、轉化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）和OCT4也被作為SOX2的靶標，而這些物質又能夠促進癌癥干細胞的自我更新和癌癥細胞的增殖［16，17］。除此之外，SOX2還與微小RNA（microRNA，miRNA）有緊密聯系，它主要受miRNA-145、miRNA-126和miRNA-9基因家族的控制［18-20］。同時SOX2也可以調控miRNA，包括下調miR-143、miR-145、miR-253-5p和miR-452，從而形成一個雙重負反饋回路［21］。

SOX17基因位于8q11.23，在研究中被認定是WNT信號通路傳導的“拮抗劑”［14，22，23］。WNT/βcatenin途徑本身可促進細胞增殖，而SOX17則通過直接轉錄抑制CTNNB1（編碼β-catenin基因），在蛋白質水平上的直接競爭干擾β-catenin/轉錄蛋白（transcription factor，TCF）相互作用，誘導β-catenin蛋白酶體降解和轉錄抑制β-catenin/TCF復合物的共激活因子等可能方式，來實現對WNT/β-catenin途徑的抑制，從而發揮抑制腫瘤的作用［24］。

根據已有的研究報告，上述兩種基因的突變包括三種，分別是錯義突變、無義突變和移碼突變，而引起腫瘤的原因主要是錯義突變［25］。當錯義突變發生時，由于SOX2和SOX17相應蛋白質上調和下調，從而促進了腫瘤細胞的增殖并可能進一步誘導腫瘤的發生。

3.OCT4基因突變：OCT4也被稱為OCT3、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU轉錄因子家族中的一員［26］。OCT4基因是胚胎發育過程中的關鍵基因，人的OCT4基因位于6號染色體上（6p21.31），長度為16.40 kb，具有多個轉錄起始位點，轉錄成不同的mRNA亞型，進而翻譯為多種蛋白質［27］。

OCT4是與癌癥干細胞自我更新和分化相關的因子之一。實驗證明，OCT4蛋白在癌組織中的表達水平顯著高于非癌組織，而敲除OCT4不僅顯著降低了癌細胞的增殖活性，還會明顯抑制癌細胞的侵襲潛力［28］。OCT4可以與AKT1基因的啟動子結合并抑制其轉錄，而一旦OCT4被AKT在其T235位點磷酸化，磷酸化的OCT4將與AKT1啟動子解離，從而激活AKT1轉錄并促進細胞存活。由此可知，T235磷酸化的OCT4（OCT4-pT235）水平與AKT水平呈正相關［29］。而PI3K/AKT信號傳導對于癌癥干細胞的自我更新和腫瘤進展至關重要。因此，OCT4可能是通過AKT參與了癌癥的進程［30］。

此外，OCT4還可以直接結合T細胞白血病/淋巴瘤蛋白（T cell leukemia/lymphoma protein，TCL1）基因的啟動子區域并激活其轉錄。TCL1可以與AKT相互作用并完全激活AKT，從而維持癌癥干細胞的存活。同時有實驗證明，敲除OCT4會使癌細胞的耐藥性降低，而過表達OCT4會通過提高TCL1的表達并激活AKT途徑增加癌細胞的抗凋亡能力，這對腫瘤的治療以及預后都可能產生影響［31］。

4.LIN28基因過表達：LIN28蛋白具有兩種類型的RNA結合基序，分別是冷休克結構域（cold shock domain，CSD）和Cys-Cys-His-Cys（cysteine-cysteine-histidine-cysteine，CCHC）鋅指結構域，它們共同參與一般mRNA的結合［32］。哺乳動物產生兩個LIN28旁系同源物LIN28A和LIN28B，它們分別或共同參與各種生物學功能［33］。

LIN28是一種必需的RNA結合蛋白，在胚胎干細胞中普遍表達，它的生理功能與干細胞的分化發育以及腫瘤的發生有關。LIN28的致癌特性受到包括miRNA和轉錄因子在內的多個上游調控因子的影響，比如轉錄因子C-myc和N-myc都可以與LIN28B啟動子結合并調節LIN28B的表達，并且建立了直接的N-myc/LIN28B和C-myc/LIN28B調控的伙伴關系［34］。

Let-7基因是一種抑癌基因［35］。有研究發現，LIN28可以阻斷幾種miRNA的生物加工，其中包括Let-7家族的多個成員［36，37］。LIN28A/B可以使用CSD和CCHC結構域來阻斷prilet-7和prelet-7的生物發生［32，38，39］。在細胞質中，LIN28A/B可以通過核糖核酸內切酶與pre-let-7末端環的相互作用來阻斷Let-7的加工，而成熟的Let-7家族成員可以通過直接靶向LIN3的3'-UTR來抑制LIN28的表達，即LIN28/Let-7軸被認為是調節各種生物學功能的雙負反饋回路［36，40，41］。因此，LIN28基因過表達可以通過抑制Let-7miRNA來加速腫瘤的發生。

除此之外，過度激活的LIN28B可以通過調節胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）的水平來促進癌細胞進程［40］。其次，在癌癥干細胞中，LIN28B及其調節劑IκB激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKKβ）可以通過與WNT/TCF7信號通路相互作用來維持癌細胞的干性［42］。

有實驗證明，LIN28在小兒卵黃囊瘤中表達上調，是該腫瘤的敏感標志物，可用于將其與成熟畸胎瘤區分［43］。因此，LIN28基因的過表達可能是導致YST發生的驅動因素之一［44］。

5.其他相關基因：有研究表明，兒童睪丸卵黃囊瘤中通常有RUNX3啟動子的高甲基化，而成人生殖細胞腫瘤中少有發生。對兒童睪丸卵黃囊瘤患者，RUNX3 mRNA在正常的對照睪丸中有表達，而在病例的正常睪丸組織中卻檢測不到甲基化。以上證據表明RUNX3基因可能是兒童睪丸卵黃囊瘤的抑制基因。研究表明，PRDM14可與OCT4、SOX2和NANOG一起參與人類多能性核心網絡的組成，因此其相關基因的異常也可能引起卵黃囊瘤的發生［45］。除此之外，還有KITLG、SPRY4、BAKI、DMRTI等基因也可能與該腫瘤相關［46］。

（二）染色體變異

在關于兒童卵黃囊瘤的染色體報告中，最常見失衡是1q和20q染色體上的重復以及1p和6q染色體上的丟失。除此之外，還包括染色體3p的重復以及染色體4q、18q和20p的丟失［47，48］。但是這些通過實驗檢測出的特征性染色體變異具體如何通過基因表達影響腫瘤的發展還有待進一步研究。

二、表觀遺傳學因素

1.DNA甲基化：DNA甲基化異常是許多癌癥的重要特征，由于在生殖細胞正常發育過程中發生廣泛的表觀遺傳重編程［49］。同樣，DNA甲基化異常在兒童YST中也發揮著重要的作用。有研究表明，YST在大量與癌癥相關的基因中表現出啟動子甲基化，其中包含許多與生殖細胞生物學高度相關的基因，如TCF4、WNT10B、BDNF、FGF2、BMP3、FZD9、WNT2、APC、SOX2、NTRK2、NTRK3、TGFB3、TGFB2、WNT1、PDGFRB等，其中包括3個重要的抑癌基因（APC、RUNX3和HIC1）［50］。這些基因啟動子的甲基化會影響其轉錄翻譯的過程，從而導致相應的蛋白質無法正常表達［51］。同時，卵黃囊瘤中甲基化程度較高的CpG基因位點上，顯著富集了與胚胎干細胞多能性和發育信號通路相關的基因，例如PTEN、PDGF和NF-κB［50］。還有實驗研究發現，2個印跡基因和17個抑癌基因的甲基化水平存在差異，在YST中發生異常的表觀遺傳重編程［52］。因此，以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學也有可能引起YST的發生。

2.miRNA：miRNA是小的內源性非編碼RNA在特定的細胞類型和發育階段調節基因功能的方式。miRNA在轉錄后翻譯中發揮著重要的調節作用，因此它的差異性表達與人類癌癥有關［53］。已有多篇論文闡述miR-371-373和miR-302簇與生殖細胞腫瘤有一定相關性，其中miRNA-372和miRNA-373通過與p53途徑的相互作用，特別是通過調節LATS2，在GCT中作為癌基因發揮作用，而miR-302簇則可調節淋巴結抑制因子左右決定因子1（leftright determination factor 1，LEFTY1）和LEFTY2，從而在胚層規范中發揮重要作用［54］。此外，還發現miRNA-122、miR-200b、miR-200c、miR-375和miR-638等在卵黃囊瘤中過度表達，這些miRNA的上調/下調可能也在一定程度上導致了癌癥的發生［55，56］。

3.印記基因：已知在從原始生殖細胞正常發育成性腺細胞/卵母細胞的過程中會發生印跡清除，因此據推測，當其發生惡性轉化時，腫瘤細胞的印跡狀態可能反映了原始生殖細胞的發育階段。IGF2和H19（分別在母本和父本上印記）是迄今為止研究最廣泛的印記基因。有研究應用甲基化敏感性單核苷酸引物延伸技術研究了這兩個基因的啟動子甲基化狀態，發現所有惡性生殖細胞瘤在IGF2／H19的印跡控制區域均發生了甲基化。因此印跡基因的甲基化及其表達的改變極有可能與兒童YST的發生有關［57］。

三、綜合征伴發因素

有研究表明，患有克萊氏綜合征（47，XXY）的男性兒童更有可能發展成YST，尤其是縱隔腫瘤［58］。雖然確切的致癌原因還不清楚，但無疑提示了X染色體對YST的潛在作用。此外，患有特納綜合征（46，XY）的女性兒童也有更大概率發展成惡性生殖細胞瘤，這與其Y染色體序列有一定的相關性［59］。純性腺發育不全以及其他一些性染色體疾病也可能與兒童YST的發生有關［60］。

四、其他因素

一項研究表明，亞裔/太平洋島民和西班牙裔兒童的卵黃囊腫瘤發展風險最高，出生時年齡≤19歲的年輕母親其孩子患YST的風險也會有所增加［61］。同時，兒童YST也被認為與環境有關。有研究表明，若父母日常工作、生活的環境可能接觸有機溶劑，如苯、甲苯、二氯甲烷等，或者母親懷孕時暴露于類似環境中，這些溶劑會影響性腺相關激素的分泌，從而導致孩子患YST的概率增加［62］。

綜上所述，兒童YST的發生原因較為復雜，可能是遺傳、發育、環境等多重因素導致的結果。相對而言，相關基因的異常改變應是所有病因中的關鍵，但現在針對該方面的研究還較匱乏。因此，還需要更多樣本及更深入的研究來明確YST的致病因素并闡明其致病機制，為YST的診斷、治療以及預后提供最大程度的幫助。