長(zhǎng)治地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變位點(diǎn)分析

宋凌燕，王亞飛，王敏，薄紅霞，郭旭霞

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院，山西 長(zhǎng)治 046000)

結(jié)核病目前仍是危害人類(lèi)健康的重大傳染病，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的出現(xiàn)和流行是目前全球結(jié)核病控制的重大挑戰(zhàn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年發(fā)布的數(shù)據(jù)[1]，中國(guó)結(jié)核病患病率占全球的9%，因此加強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究尤其重要。耐藥基因檢測(cè)可以快速、準(zhǔn)確獲得患者的分子藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有利于早期治療。目前，利福平和異煙肼作為抗結(jié)核的一線藥物，具有殺菌力強(qiáng)、不良反應(yīng)少、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，本研究通過(guò)熔解曲線法分析長(zhǎng)治地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼這兩種藥物的耐藥率及耐藥基因突變位點(diǎn)，以期給利福平和異煙肼抗結(jié)核病的臨床應(yīng)用研究提供客觀依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年2月—2019年8月住院患者結(jié)核分枝桿菌涂片陽(yáng)性的痰液及分離培養(yǎng)的純結(jié)核分枝桿菌株標(biāo)本363 例，其中男250 例，女113 例，年齡14～89 歲。

1.2 標(biāo)本收集及結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸提取

1.2.1 痰液樣本

留取患者痰液涂片抗酸染色陽(yáng)性(2+以上)的痰液標(biāo)本，以1∶1比例加入4%NaOH，混勻，液化20 min以上，3 000 r/min，離心20 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀，3 000r/min，離心10min，棄上清，1mL生理鹽水重懸沉淀，12000 r/min，離心5 min，棄上清，加入250 μL結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸(TBDNA)提取液，99℃加熱20min，12000r/min，離心5min，上清液為待測(cè)TB DNA樣本。

1.2.2 純結(jié)核分枝桿菌菌株

留取改良羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的典型結(jié)核分枝桿菌，刮取適量的菌落加入到250 μL TB DNA提取液中，99 ℃加熱20 min，12 000 r/min，離心5 min，上清液為待測(cè)TB DNA樣本。

1.3 熔解曲線法

嚴(yán)格按照廈門(mén)致善生物科技有限公司結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣本的檢測(cè)和結(jié)果的判讀。吸取5 μL上述提取完成的TB DNA，加入到含20 μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的反應(yīng)管中，放入SLAN-96S實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增和熔解曲線分析。

1.3.1 PCR反應(yīng)程序：

50 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s(每個(gè)循環(huán)下降1 ℃)，76 ℃ 25 s，13個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25s，42個(gè)循環(huán)。熔解分析：95℃ 2min，40℃ 2 min，45～85 ℃(設(shè)置在此階段每1 ℃采集1次熒光信號(hào))，1個(gè)循環(huán)。

1.3.2 結(jié)果判讀

當(dāng)樣本的熔解溫度(Tm)與陽(yáng)性對(duì)照的Tm一致(誤差不超過(guò)1 ℃)時(shí)判定為野生型，即試驗(yàn)菌株對(duì)利福平/異煙肼敏感；樣本的Tm與陽(yáng)性對(duì)照Tm相差2 ℃及以上時(shí)判定為突變型，即試驗(yàn)菌株對(duì)利福平/異煙肼耐藥。

1.4 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥率以及兩種藥物不同耐藥突變位點(diǎn)發(fā)生頻率。

2 結(jié) 果

結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼同時(shí)耐藥的樣本有63 例，耐藥率為17.4%。單利福平耐藥率為19.6%(71/363)，其中ropB(codon 507-512)，ropB(codon 521-528)，ropB(codon 513-520)，ropB(codon 529-533)突變頻率分別為4.4%(16/363)，4.7%(17/363)，3.0%(11/363)和10.5%(38/363)；主要突變基因片段為ropB 529-533片段，另有3 例產(chǎn)生ropB codon 533特殊突變；傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)顯示對(duì)利福平敏感。單異煙肼耐藥率28.1%(102/363)，其中AhpC啟動(dòng)子區(qū)(-44～-30位點(diǎn))、AhpC啟動(dòng)子區(qū)(-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))、KatG315密碼子的突變頻率分別是0(0/363)，3.3%(12/363)，0(0/363)，7.2%(26/363)和21.2%(77/363)，主要突變基因仍是inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))和KatG315密碼子。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌耐藥原因主要是基因、藥物激活基因的啟動(dòng)子突變或者是藥物靶點(diǎn)序列發(fā)生了突變。利福平耐藥主要發(fā)生在ropB基因中一個(gè)大小為81個(gè)堿基對(duì)的利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)，95%以上的利福平耐藥與此有關(guān)。利福平能抑制結(jié)核桿菌DNA依賴的RNA聚合酶活性，RNA聚合酶失活引起轉(zhuǎn)錄停止，結(jié)核分枝桿菌不能繼續(xù)生長(zhǎng)。大部分利福平耐藥菌都是由于編碼RNA聚合酶b亞基的基因某個(gè)特定區(qū)域發(fā)生突變[2]，從而不再與利福平結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。異煙肼耐藥主要與katG，inhA，ahpC等基因中的1個(gè)或多個(gè)突變有關(guān)[3]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平的耐藥基因位點(diǎn)在ropB的529-533片段，異煙肼的耐藥位點(diǎn)主要為inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))和KatG315密碼子，同時(shí)異煙肼的耐藥率明顯高于利福平，與國(guó)內(nèi)一些研究報(bào)道相似[4-7]。2018年WHO報(bào)告[1]，利福平敏感菌株的異煙肼耐藥率與2017年全球的耐多藥/利福平耐藥率相比，初治患者中前者明顯高于后者(7.1%和3.5%)；但復(fù)治患者中前者明顯低于后者(7.9%和18.0%)。Yuen等[8]通過(guò)對(duì)32個(gè)國(guó)家和地區(qū)的兒童結(jié)核病患者進(jìn)行系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)：兒童結(jié)核病患者中異煙肼耐藥率高達(dá)12.1%，且大部分集中在西太區(qū)和東南亞地區(qū)。異煙肼耐藥結(jié)核病在全球范圍內(nèi)處于一個(gè)比較嚴(yán)重的流行狀態(tài)。

本研究仍存在一定的局限和不足。本研究是臨床數(shù)據(jù)的總結(jié)，未對(duì)初治和復(fù)治進(jìn)行分組；采用的是商品化試劑，僅對(duì)試劑包含的突變位點(diǎn)進(jìn)行了分析總結(jié)，未能分析是否存在其他相關(guān)突變位點(diǎn)；研究對(duì)象數(shù)量有限，雖包含了各縣及市區(qū)送來(lái)的樣本，但總體送檢率偏低，所以數(shù)據(jù)結(jié)果可能有偏倚。

綜上所述，ropB 529-533，katG，inhA 3個(gè)耐藥基因位點(diǎn)為突變頻率較高的位點(diǎn)。耐藥基因不同位點(diǎn)突變率在人群中存在一定差異，對(duì)臨床診斷和選擇調(diào)整耐藥結(jié)核病患者治療方案有一定的指導(dǎo)意義。本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥率仍然較高，其中異煙肼耐藥是個(gè)不容忽視的問(wèn)題。