Duchenne型肌營養不良癥的治療

羅 宏，岑海媚，羅 彬，張玉生，b，張 譽

(暨南大學附屬第一醫院 a.神經內科；b.腦血管病中心，廣東 廣州 510632)

Duchenne型肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是因編碼抗肌萎縮蛋白的Dystrophin基因突變，導致進行性肌無力、肌肉萎縮的一種遺傳性肌病，男性占多數，全球發病率為(10.7～27.8)/10萬活產嬰兒[1]?；純撼Ｔ?～3歲時出現臨床癥狀，多數患者于12歲逐漸喪失行走能力，隨病程進展逐漸累及膈肌及心肌，最終在20～30歲時死于呼吸衰竭或心力衰竭[2]。Dystrophin基因位于染色體X p21上，總長度約2.20×106bp，是目前為止發現的人類最大基因之一[3]。Dystrophin基因轉錄全長約427 k的dystrophin蛋白，后者是維系肌膜穩定性的關鍵蛋白，該蛋白缺失后導致肌膜穩定性破壞，肌肉收縮產生的機械應力無法被相關蛋白吸收導致肌肉炎癥，進而激活肌細胞再生。最終, 反復修復再生的肌肉會被脂肪和纖維結締組織取代，導致纖維化[4]。

迄今，DMD尚無切確的根治方法，但隨著對該病發病機制和病理變化過程的認識不斷深入，以及分子生物學和基因工程的快速發展，DMD治療不斷取得新進展。這些治療方案主要圍繞恢復dystrophin蛋白表達或彌補dystrophin蛋白缺失而進行。本文對DMD治療的研究現狀進行綜述，并分析這些治療方案的利弊，為臨床醫師治療DMD提供參考。

1 恢復dystrophin蛋白表達治療

DMD致病機制主要是功能性dystrophin蛋白缺乏，故最有效、最根本的治療方法就是恢復dystrophin蛋白功能和表達。目前治療方法主要有：通讀療法、外顯子跳躍療法、病毒載體介導的基因療法、干細胞療法，以及CRISPR/Cas9基因編輯療法等。

1.1通讀療法 通讀療法是一種適用于大約10%無義突變患者的方法，運用藥物誘導與核糖體結合，跳過識別提前出現的終止密碼子，從而恢復全長、功能性肌營養不良蛋白的表達[5]。目前用于無義突變通讀療法的治療藥物主要有氨基糖苷類抗生素、Ataluren、RTCl3、RTCl4等，其中只有氨基糖苷類抗生素及Ataluren 進入臨床試驗階段。(1)氨基糖苷類抗生素：慶大霉素為治療DMD患者無義突變傳統類藥物，其與核糖體特定位點結合，誘導過早出現的終止密碼子的通讀，促進全長抗肌營養不良蛋白的轉錄表達。研究表明，用慶大霉素治療的mdx小鼠(DMD模型鼠)肌膜中檢測到肌營養不良蛋白的高表達，并且提高了肌肉收縮所誘導的損失抵抗力。然而在人體試驗卻得到了矛盾的結果。Malik等[6]采用3種不同的治療方案驗證了靜脈注射慶大霉素治療DMD患兒無義突變的療效，觀察周期為6個月。結果顯示，接受慶大霉素6個月治療的患兒抗肌營養不良蛋白的表達增加，血清肌酸激酶(CK)水平降低，但反應肌肉功能質量改善的指標卻沒有改變，需要更高的劑量才能改善患者的結果。此外，慶大霉素的耳毒性及腎毒性也限制了其在治療DMD方面的長期應用。為此，目前有研究開發出了氨基糖苷類衍生物NB74和NB84，已經在體外測試證明了其在細胞毒性和通讀效率方面優于慶大霉素。另外一種氨基糖苷類抗生素硫酸阿貝卡星(NPC-14)Ⅱ期臨床試驗(試驗編號：NCT01918384))目前已完成，但尚未公布結果。(2)Ataluren：Ataluren(PTC124)是目前研究最多、最有希望的抑制無義突變的通讀治療藥物。在一項為期28天的Ⅱa期研究中，DMD患者在治療后顯示Ataluren 能增加11%抗肌萎縮蛋白的表達[7]。隨后的一項為期48周雙盲安慰劑對照的Ⅱb期研究中，Bushby等[8]采用兩種不同的治療方案治療174名無義突變的DMD患者，其中方案一：每天口服Ataluren 3次(10、10、20 mg/kg，分別是早上，中午和晚上劑量，n=57)；方案二：每天口服Ataluren 3次(20、20、40 mg/kg，分別是早上，中午和晚上劑量，n=60)，對照組(n=57)予安慰劑治療。結果顯示，與安慰劑相比，每天服用40 mg/kg Ataluren的治療組在平均6 min步行測試(6MWT)距離上比安慰劑組增加了30 m，然而在每天服用80 mg/kg的治療組卻看不到癥狀的改善，這種結果可能歸因于Ataluren的鐘形劑量效應曲線?；谶@些結果及相關研究，Ataluren于2014年獲得歐洲藥品管理局(EMA)條件性批準，但卻沒有獲得美國食品與藥品管理局(FDA)批準。原因是Ataluren Ⅱb期研究及Ⅲ期研究(試驗編號：NCT01826487)未能達到主要終點事件。由于2017年Ataluren的Ⅲ期研究顯示阿塔魯侖治療組和安慰劑對照組之間的6MWT差異無統計學意義[9]，PTC Therapeutics公司被要求在2021年之前進行一項新的驗證性研究來確認臨床療效。Ataluren主要用于治療≥5歲的無意義突變的DMD患者[10]。2018年，EMA在審查了該藥對治療2～5歲患者安全性數據后，批準將Ataluren治療的適應證擴大到≥2歲患有無義突變的DMD患者[9]，近期一項評估Ataluren治療6個月～2歲的無意義突變的DMD患兒安全性的試驗(試驗編號：NCT04336826)正在進行，期待獲得預期的療效和安全性。雖然Ataluren有很好的治療前景，經Ataluren治療的DMD患者活動階段可能延長5年，但Ataluren治療只適用于約13%攜帶無義突變的DMD患者，而且這種藥物價格昂貴，未來在臨床上普及需一段時間。

1.2外顯子跳躍療法 缺失突變是肌營養不良常見的突變類型，約占所有DMD突變的68%[11]，缺失突變包括移碼突變和整碼突變。Becker肌營養不良癥(becker muscular dystrophy, BMD)是肌營養不良的一種癥狀相對較輕的臨床表型，其特征是框內整碼突變但不破壞閱讀框(ORF)，因此可以產生部分截短的功能性蛋白。而DMD是由于框內移碼突變破壞閱讀框，導致dystrophin蛋白的缺失?；谶@種閱讀框架假說，科學家提出了外顯子跳躍這一概念。外顯子跳躍療法是通過合成的反義寡核苷酸(ASO)序列在DMD基因的前信使RNA剪接過程中誘導預先指定的外顯子跳過，將嚴重DMD表型改善為臨床癥狀較輕、預后較好Becker肌營養不良癥。大約90%的DMD患者的dystrophin基因缺失可以通過跳過多個外顯子治療而癥狀改善[12]。目前進入臨床試驗的反義寡核苷酸藥物有Drispersen、Eteplirsen、Golodirsen等，幾種不同的化合物在不同的DMD動物模型中進行了測試，并且在Ⅱ期臨床試驗中顯示了令人滿意的結果。

Drispersen(2′O-methyl-ribo-oligonucleoside-phosphorothioate，2′OMePS)是基于2′-O-甲基硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸，是第一個在DMD患者身上測試的寡核苷酸，旨在跳過51號外顯子。在Drispersen的一項Ⅲ期研究中，涉及186例DMD患兒，其中治療組125例接受每周6 mg/kg的Drispersen皮下劑量，對照組61例接受安慰劑治療，遺憾的是雖然治療組的療效優于安慰劑組，但未能證明6MWT差異有統計學意義或臨床顯著改善，同時治療組還觀察到注射部位炎癥反應、蛋白尿、血小板減少[13]，因此FDA拒絕了Drispersen的上市批準申請，關于Drispersen的開發研究也于2016年終止。

Eteplirsen(phosphorodiami-date morpholinooligomers, PMOs)是一種嗎啉反義寡聚物，通過特異性跳過外顯子51來恢復DMD基因的翻譯閱讀框架，從而促進缺陷遺傳變異體中營養不良蛋白的產生。2016年，基于Eteplirsen Ⅱ/Ⅲ期臨床研究的結果，FDA有條件的批準對DMD患者進行這種治療[14]，但由于參與臨床試驗的患者數量較少，Eteplirsen的臨床療效需要更多的研究來進一步驗證。

最近，在Ⅰ/Ⅱ期試驗和正在進行的Ⅲ期試驗取得積極結果后，FDA批準了另一種藥物Golodirsen, 適用于治療8%外顯子53順應性突變的DMD患者[15]。Golodirsen是設計用來跳過外顯子53的寡核苷酸，在前期研究中已經發現患者抗肌萎縮蛋白表達增加，目前Ⅲ期臨床試驗(試驗編號：NCT0250038l，NCT03532542)正在進行中。

盡管反義寡核苷酸介導的外顯子跳躍療法有著良好的治療前景，但這種治療策略也存在明顯的局限性：(1)療效有限，細胞攝取率低，不能有效的輸送到靶組織，無法恢復心肌中dystrophin蛋白的表達。(2)由于反義寡核苷酸藥物分子較小，會通過腎臟快速排泄。(3)外顯子跳躍療法旨在將DMD表型轉為臨床癥狀輕微的BMD表型，不能完全治愈DMD患者。(4)由于反義寡核苷酸藥物在血液中的半衰期短，需要重復給藥才能維持治療效果[16]。(5)治療個體化，只針對特定類型的外顯子跳躍突變，例如Drispersen和Eteplirsen只能治療約13%的51號外顯子突變的患者[17]。

為了解決外顯子跳躍的局限性問題，科學家們研究了一系列新的治療策略。在這些策略中，為了解決反義寡核苷酸藥物循環系統清除快的問題，相關研究采用硫代磷酸酯(PS)修飾的反義寡核苷酸與血漿/血清蛋白結合，降低其腎臟清除率，并增加其在組織中的蓄積，特別是腎臟和肝臟，從而大大降低反義寡核苷酸藥物在循環系統的清除率[18]。此外，在克服外顯子跳躍療法心肌療效低問題上，有研究已經開發出一種肽綴合的多肽偶聯嗎啉代寡聚物(PPMO)，這種寡聚物富含精氨酸，具有良好的藥代動力學特征，能夠增強細胞的攝取，已經在細胞和動物實驗上證實了在細胞穩定性及細胞轉導效率方面優于PMO[5]，但該藥在非人類靈長類動物的安全性評估中，結果揭示低劑量導致了嚴重的腎臟毒性[19]，因此在進入人體臨床試驗階段之前還需要更多研究來進一步驗證其安全性。

1.3病毒載體介導的基因替代療法 基因替代療法是一種能治愈DMD的療法，通過病毒載體將外源性修飾過的功能基因導入宿主體內，置換突變基因并恢復抗肌萎縮蛋白表達。腺相關病毒(adeno-associatedvirus, AAV)是DMD治療最常用、最有希望的載體，具有致病性低、免疫原性低、外源基因可在宿主內長期表達等優點[20]。DMD基因是人類最大的基因之一，總長度約2.3 Mb，dystrophin cDNA 約14 kb，兩者長度都遠超過了腺相關病毒5 kb的最大承載能力[21]。于是，有研究通過創建微型或小型抗肌營養不良蛋白解決這個問題。在一項研究中，將攜帶mini/micro dystrophin的AAV載體注射到DMD模型犬中，結果顯示了肌肉組織學的改善[22]，然而，在一項對6名注射了AAV相關的微型抗肌營養不良蛋白基因的DMD男孩的研究中，由于對微型抗肌營養不良蛋白產生了T細胞介導的免疫反應，轉基因表達沒有成功[23]。目前，著眼于開發一種重組腺相關病毒載體(NCT 03368742)和更有效的載體傳遞系統的研究正在進行中。

1.4CRISPR/Cas9系統介導的基因編輯治療 CRISPR/Cas9系統介導的基因編輯技術是近幾年研究的熱點，同時也是一種充滿希望的治療方法，因為它從根本上永久糾正DMD患者的基因缺陷，達到治愈DMD的效果，同時也將DMD患者長期治療成本降至最低。Ousterout等[24]的研究中用SpCas9將針對DMD內含子44和55的gRNA電穿孔于1例外顯子48-50缺失的DMD患者的永生化肌肉細胞中，證實了gRNAs可以有效地刪除DMD基因中的單個或多個外顯子。另外一項研究中，Young等[25]采用CRISPR/Cas9系統介導的外顯子跳躍療法在HiPSC中實現了45-55號外顯子的跳躍。值得注意的是，DMD基因中缺少該外顯子45-55區域的患者通常是無癥狀的或者表現為輕微的表型[26]，因此治療45-55號外顯子的DMD患者具有重要的臨床意義。

基因組編輯是一種特定于突變的方法，這意味著必須針對不同的突變專門設計和優化引導RNA。另外，基因組編輯方法也可能會出現脫靶效應，這會導致DNA的永久性改變。未來需要進一步深入了解基因組編輯的非靶點效應的機制和頻率，以充分闡明相關的安全問題。

1.5干細胞療法 干細胞療法基于干細胞的異體或自體移植，目的是重建肌肉衛星細胞庫，恢復肌營養不良蛋白的表達。治療的干細胞的來源可以是健康的、組織相容的捐贈者，也可以是經過基因校正的自體細胞。目前已經有許多類型的干細胞應用于DMD動物模型并取得了預期的結果，這里我們主要介紹幾種近幾年興起的、充滿希望的干細胞療法。

利用HiPSCs基因工程恢復dystrophin蛋白的功能性表達治療肌營養不良是充滿希望的治療方法。iPSCs細胞構建是通過將攜帶有4種轉錄因子(OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC)的相關病毒轉導入人類體細胞(如皮膚或血液細胞)中使之發生重編程，從而獲取與胚胎干細胞相似潛能的誘導多潛能性干細胞[27]。為了產生表達dystrophin的肌纖維，可以對來自DMD患者的hiPSCs進行基因編輯，使其表達功能性dystrophin蛋白，以用于自體細胞替代治療。理論上，基因編輯聯合干細胞療法可以糾正大多數DMD突變，永久修復DMD基因，Young等[25]在免疫低下的mdx小鼠中移植來自基因校正的DMD-hiPSCs，結果成功恢復了dystrophin蛋白的表達證實了這一理論的可行性，然而目前還沒有基因編輯的iPSCs用于細胞移植治療的臨床試驗。在進入臨床試驗前還需要克服幾個關鍵限制因素：(1)需要找到DMD患者產生HiPSCs的最佳體細胞類型，優化培養條件，以避免在生產過程中細胞在體外分化。(2)需要優化干細胞的輸送途徑，提高干細胞的移植效率，動脈移植可以可以繞過肺屏障，但安全性需要更多研究驗證[28]。(3)Cas9的非靶點效應以及在接受治療的患者中潛在的腫瘤或畸胎瘤形成的風險。

鑒于干細胞療法的局限性，有研究者開發了一種嵌合細胞(DEC)療法，通過將供體肌母細胞和受體肌原細胞在體外融合獲得嵌合細胞，然后在免疫抑制下移植到mdx小鼠中, 結果顯示，mdx小鼠的肌營養不良蛋白的表達顯著提高(超過37.27%)，以及肌肉功能的改善[29]。嵌合細胞治療因為攜帶自體細胞，可以減少免疫反應的發生，能延長移植物的存活時間并且不針對特定的基因突變，因此嵌合細胞療法將是未來治療DMD非常有吸引力的潛在治療方法。

2 彌補dystrophin蛋白缺失的治療

盡管DMD是一種單基因疾病，但dystrophin蛋白的缺失會觸發多種病理表現，包括炎癥、鈣穩態喪失、功能性缺血和肌肉再生受損等。因此針對DMD繼發性病理表現，采用彌補dystrophin蛋白缺失的治療可以延緩DMD疾病進程，提高患者的生活質量，這對DMD患者具有重要的臨床意義。

2.1抗氧化劑與抗炎藥 皮質類固醇(如強的松、強的松龍和地夫可特)是DMD的標準治療方法[1]。雖然皮質類固醇延緩了DMD的進展，但長期使用會引起包括體重增加、發育遲緩、胰島素抵抗、骨質疏松癥和行為改變等不良反應[30]。Vamorolone(VBP15)是一種糖皮質激素類似物，與糖皮質激素作用機制相似，但不良反應較少。Vamorolone的Ⅱb期研究表明了其具有抗炎作用，并且不會引起與皮質類固醇不良效應相關的生物標記物的改變[31]。最近對48名患有DMD的男孩(4～7歲，初次使用類固醇治療患者)進行的最新研究結果顯示，在24周的治療期內，每天服用不同劑量(2 mg/kg和6 mg/kg)的顯示炎癥反應減少，且沒有觀察到嚴重的不良反應[32]。雖然Vamorolone的安全性優于糖皮質激素，但在使用高劑量組的患者中也出現了體重增加的不良反應，因為目前沒有這種藥物長期治療效果的數據，導致相關的不良反應可能未觀察到。值得注意的是，Vamorolone作為一種鹽皮質激素受體拮抗劑和糖皮質激素受體激動劑，它也可能起到心臟保護作用[33]。

2.2Utrophin調節 抗肌萎縮蛋白相關蛋白(Utroin)是dystrophin結構上(同源性80%)和功能上類似的結構蛋白，通過上調這些蛋白質的表達可以緩解DMD[34]。Ezutromid(SMT C1100)是一種口服生物分子，通過靶向utrophin-A啟動子以增加utrophin表達。Ezutromid(SMT C1100)及其相關化合物SMT022357都在臨床前實驗中被證明可以增加utrophin的產生，緩解肌營養不良癥進程。然而該化合物的Ⅱ期試驗因未顯示出療效而終止研發[35]。

2.3組蛋白去乙?；敢种苿?組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑是一類能改變組蛋白表觀遺傳標記，從而影響多個基因表達的化合物。HDAC抑制劑的作用機制主要是通過促進一些肌肉再生因子(如卵泡抑制素)的轉錄，在體外刺激肌肉生成，對抗mdx小鼠的肌肉退化。Givinostat是一種HDAC抑制劑，具有抗炎、抗纖維化和促再生基因表達的作用[36]。Givinostat的Ⅲ期試驗(NCT03373968，NCT02851797)目前正在進行中，希望能得到預期的療效和結果。

2.4他汀類藥物 2015年，Whitehead等[37]描述了他汀類藥物對治療mdx小鼠的積極作用，吸引了眾多研究者的眼球。與長期服用他汀類藥物引起骨骼肌病和橫紋肌溶解的結果不同，每天服用適量(5～10 mg/kg)辛伐他汀可明顯減輕炎癥、纖維化、氧化應激和改善肌力。此外，辛伐他汀治療還可以減輕DMD進展過程中的骨骼肌自噬[38]。然而，在一項評估他汀類藥物治療相關肌病風險的薈萃分析顯示與服用安慰劑的患者療效相比沒有差別[39]，出現這種差異的原因可能是服用他汀類藥物的人群大多為老年患者，運動以及女性患者因素[40-41]也可能增加藥物不良反應的風險，未來還需要更多研究證實他汀類藥物治療DMD的安全性。

綜上所述，恢復肌營養不良蛋白的表達是治療該病主要治療目標，為了達到對DMD患者的理想治療，我們需要聯合不同的治療策略，針對不同的疾病過程采取多種干預措施?；蚓庉嫾夹g聯合干細胞療法是目前前景最好和充滿希望的治療方法，但要轉化到臨床試驗階段還需要克服很多的困難，如何解決CRISPR-CAS9系統脫靶效應的問題以及構建理想的移植細胞是我們值得思考的問題。目前已經有一系列的動物實驗甚至臨床試驗取得了令人鼓舞的結果，相信不久的將來DMD能夠得到有效的治療。