食管微生態與食管疾病

李東航 耿慶

既往研究認為，食管沒有常駐菌的定植，僅為經口咽或胃來源的瞬時微生物，傳統的培養法對大多數微生物菌群未能準確分離、純化和鑒別，隨著高通量測序和宏基因組學的發展，結合生物信息學分析，對微生態的研究已達到基因型分類水平[1]。盡管目前對腸道微生態已有了比較深入的研究，但對于食管微生態的認知仍然有限。作為一個新興研究領域，本文對目前關于正常食管、胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)和Barrett食管(barrett's esophagus,BE)、食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)、食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)、嗜酸性粒細胞性食管炎(eosinophilic esophagitis,EoE)、食管動力障礙等食管微生態的組成及膳食和藥物對其影響加以概述，為進一步理解食管微生態與食管疾病的關系及潛在診療策略提供新思路。

一、正常食管微生態

目前，對無癥狀的正常成人食管微生物菌群進行表征的研究尚未有統一的定論，但從這些研究中可以梳理出較為一致的結果，即正常食管存在以鏈球菌為主的復雜微生物菌群。Pei等[2]在2004年首次對正常食管遠端黏膜行16S rDNA序列分析，發現其菌群主要包含6大門類，分別為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門和TM7，其中鏈球菌屬檢出率最高，為39%，且菌群組成與口咽類似，但未檢出到口咽包含的螺旋體門和桿菌門。Liu等[3]對正常食管遠端微生物菌群組成的研究與Pei等結果一致。通過對7名健康成人的食管行分段高通量測序，我們發現鏈球菌屬占據主導地位，食管上、中、下段常見微生物菌群沒有顯著性差異[4]。與Dong等[5]的研究結果一致，表明正常食管的微生物菌群組成相對保守，上、中、下段沒有明顯的微生態特異性。通過應用16S rRNA技術，Yang等[6]在一項大規模測序中首次將食管微生物組分為2種類型，I型主要分布于正常食管，以革蘭陽性(G+)需氧菌為主，多由厚壁菌門、鏈球菌屬構成；Ⅱ型主要分布于食管炎和BE，以革蘭陰性(G-)厭氧菌為主，多由擬桿菌門、韋榮球菌屬、普氏菌屬、嗜血桿菌屬等構成。這些研究表明，食管存在自身的微生態，其中鏈球菌屬為優勢菌群。

二、食管微生態與食管疾病

1.食管微生態與GERD和BE：GERD相關性食管炎和Barrett化生主要與從胃內慢性反流到食管下部的酸性物質(胃酸、少量膽汁)有關。在長期酸性環境的刺激下，導致食管黏膜損傷，從而產生炎性環境，其微生物的組成隨之發生變化。Loris等[7]應用16S擴增序列分析了10例BE病人的化生黏膜和鄰近正常黏膜，結果發現,前者α多樣性降低，鏈球菌減少，擬桿菌、放線桿菌、普氏菌、韋榮氏菌增多，這種以革蘭陰性菌為主的Ⅱ型菌群在BE中占比增多的現象，印證了Yang等[6]提出的食管菌群分類。除此之外，另外幾項研究報道了在GERD和BE病人的食管菌群中，與正常對照組相比，彎曲桿菌屬豐度均顯著增加，并進一步表明彎曲桿菌屬會引起前炎癥因子白細胞(IL)-18升高，并介導TGF-β1下調，引起NF-κB、STAT3/SHH-BMP4軸/NOD2等細胞因子通路激活。其中，部分彎曲桿菌具有硝酸鹽還原作用，并參與到EAC的啟動和進展中[8-11]。然而，Yu等[12]在一項關于我國GERD病人食管菌群的調查中，僅發現菌群總體豐度和多樣性的降低，但差異并無統計學意義。受地理環境、飲食習慣、個體差異、取樣方式、樣本量限制、測序技術等眾多因素的影響，可能導致這一結果不盡相同。從技術層面更具信服力的是，Gall等[13]率先采用宏基因組測序揭示了厚壁菌門鏈球菌屬和擬桿菌門普氏菌屬在BE病人中為優勢菌群，且二者比例與腰臀比呈正相關。厚壁菌門可以更有效地代謝短鏈脂肪酸、增加機體供能，促進宿主肥胖，而肥胖已被證實與人體GERD、BE和EAC的發生有關，尤其是中心性肥胖[14-17]。多項隨機試驗也表明，減輕肥胖可改善GERD癥狀，減少食管酸性環境的暴露[18-20]。這表明GERD、BE的發生伴隨著微生物菌群的改變，尤其是肥胖病人，厚壁菌門的顯著增加可能是其GERD、BE發生的危險因素之一。

盡管上述結果有所差異，但總體而言，與正常食管相比，GERD、BE病人的食管優勢菌群具有從Ⅰ型向Ⅱ型菌群轉變且菌群多樣性減少的趨勢[6,21]。反流造成酸性環境，使得更易耐酸的革蘭陰性菌增多，而革蘭陰性菌的外膜脂多糖(LPS)通過激活TLR4，誘導IL-1β 和 TNF-α產生，進而以直接和間接兩種方式激活NF-κB炎性通路，并上調IL-8的表達，促使BE的發生；同時促進誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環氧合酶2(COX-2)的高表達，導致食管下端括約肌的松弛并延緩胃內容物的排空，促進了GERD的發生[14,21-22]。此外，在BE基礎上，LPS也可通過TLR4通路激活炎性小體NLRP3，促進細胞凋亡和炎性細胞因子釋放，塑造局部炎性環境，在長期慢性刺激下，細胞出現異性增生甚至惡變，進而進展為腫瘤[23]。

此外，一個有趣的現象是，盡管Hp被公認為是胃癌的I類致癌因子，但對于GERD病人來說，感染了Cag A陽性的Hp 卻是一個保護因素，其不僅可降低GERD的嚴重程度，還可阻止食管黏膜的癌變[20,24]。一方面，Hp具有很強的耐酸性，在反流酸性的環境中占據優勢地位，影響著其他微生物菌群的生長和組成，在Hp免疫應答的同時對其他致病菌具有交叉免疫效應；另一方面，Hp引起IL-8、IL-1β、TNF-α的產生，進而破壞胃泌酸細胞，降低胃酸的產生，對BE、GERD起到保護作用，減少了細胞惡變的發生率[25]。

2.食管微生態與食管癌：食管癌的發生是一個慢性漸進過程，盡管與吸煙飲酒等因素有關，但這些因素并不能用來解釋全部食管癌的流行病學，如同理解結直腸癌多步驟模型一般，食管癌多從癌前病變的進展來揭示微生物菌群變化。具體而言，探究ESCC的微生態組成，揭示食管鱗狀細胞不典型增生(ESD)就尤為重要。同樣，探究從正常食管轉變為EAC過程中微生態的變化就需要從GERD和BE的微生物菌群組成入手。

Yu等[26]的研究發現，食管微生物的多樣性和ESCC、ESD之間存在負相關，Nasrollahzade等[27]進一步的研究表明，與對照組相比，ESD病人胃體微生物群中梭菌屬和丹毒桿菌屬更為富集，這與最近劉曉波等[28]和我們關于ESCC的研究結論相一致[4]。McColl等[29]對慢性萎縮性胃炎病人的研究中發現，其胃黏膜的微生態環境更利于產亞硝基細菌的生長，而硝酸鹽的增加又反過來促進厭氧菌的富集，亞硝酸基的不斷積累促進了ESD向ESCC的轉變[29-30]。此外，有研究發現，與口腔疾病特別是牙周炎相關的福賽斯坦納菌(T.forsythia)和牙齦卟啉單胞菌(P.gingivali)兩種革蘭陰性菌，可選擇性地感染食管鱗癌黏膜和鄰近組織，而不易感染正常對照組的食管黏膜[31-32]。尤其是P.gingivali，不僅與口腔鱗癌密切相關，也與ESCC的局部復發、淋巴結轉移和總體生存率較低顯著相關[33-34]。其具體機制為牙齦卟啉單胞菌通過促進Smads/YAP/TAZ/TEA域轉錄因子1(TEAD1)復合體的形成，啟動下游靶基因表達、誘導上皮-間質轉化(EMT)和維持腫瘤干細胞特性，增強ESCC細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移能力[34]。此外，P.gingivali的感染可激活自噬，誘導IL-6等促炎因子的表達，通過STAT3通路，促進腫瘤進展[35-37]。

有研究發現，不論是與正常食管，還是食管胃交界處腺癌相比，梭桿菌屬在ESCC中顯示出更高比例的富集，這種富集程度還與腫瘤的分化呈負相關[4，28]。其中，已被證實與結直腸癌的發生發展有著密切聯系的具核梭桿菌，在ESCC瘤內的高豐度也與其不良預后、對新輔助化療的不良反應密切相關，有研究表明，具核梭桿菌可作為食管癌潛在的預后標志物[38-40]。具核梭桿菌可通過激活CCL20等特定趨化因子，從而增強腫瘤侵襲，通過調節ESCC的自噬導致化療耐藥[41-42]。在未來，對于具核梭桿菌在ESCC中的具體分子機制研究、作為不良預后的微生物標志物及針對性抗生素干預策略的研究仍需要可靠的數據支持和臨床驗證。

對于EAC微生態的理解，除了上文提到的從GERD和BE層面的探究，在這兩者轉變為腺癌的過程中伴隨著微生態變化的揭示也十分重要。與正常食管相比，BE的微生物菌群在組成上表現為鏈球菌的減少，普氏桿菌相應增加，而在EAC的微生物菌群組成上，這一改變更為顯著，這也與EAC的發生通常是GER-GERD-BE-EAC這一漸進癌癥模型不謀而合[7，13]。在GER相關炎癥環境下，微生物的失調可誘導化生反應的增強，從而進展為BE和EAC。相比GERD和BE，EAC更加富集了耐酸菌，如發酵乳桿菌，乳酸的產生進一步改變了食管內環境，產生過氧化氫等有害物質，從而抑制其他細菌的生長，使得乳酸桿菌在食管下部成為優勢菌群[43-44]。此外，核酸桿菌在EAC中也發揮著重要作用，其不僅可以黏附食管上皮，誘導炎性因子激活TLR4、NF-κB 炎性通路，還可抑制T細胞的免疫殺傷，產生免疫逃逸[7,45]。總體來說，EAC發生過程中，革蘭陰性菌的增多和共聚集的產生，通過LPS激活天然免疫反應，刺激NF-κB的表達和炎性細胞因子的釋放，同時擬桿菌通過代謝短鏈脂肪酸與提供CO2等因子協助其他厭氧菌的生存，維持BE向EAC轉化的炎性環境和促瘤條件[21,46]。這與總體上食管癌微生物菌群的多樣性降低，革蘭陰性厭氧菌逐漸成為優勢菌群的論斷也相一致。然而，從BE到EAC的過程中，食管微生物菌群組成的改變并不顯著，能夠區分二者的特定菌群尚未可知，與這二者相關的菌群是BE或EAC的病因還是結果，如何在高危人群中尋找可作為早期診斷的生物標志物或作為亞型分類依據的菌屬，及實施相應的微生物干預策略，仍需大樣本的、質量可控的、更具信服力的研究。

3.食管微生態與EoE：EoE是一種以慢性免疫介導的食管功能障礙和食管黏膜產生嗜酸性粒細胞為主的炎性疾病[47-48]。有幾項證據表明，先天免疫系統及微生物模式識別受體在EoE中發揮著潛在作用[49-50]。2015年Benitez等[51]對33例患EoE和35例不患EoE的兒童食管黏膜進行了16S rRNA測序表征，結果顯示，兩組食管菌群均以鏈球菌為主，進一步評估活動期和非活動期EoE病人的微生物組成，結果表明活動期EoE顯著富集變形桿菌，而非活動期EoE和不患EoE的食管微生物組成沒有顯著差異。當然，這一研究存在著局限：取樣時68例病人中66例正接受質子泵抑制劑的治療，因此無法排除非EoE介導的食管炎的影響。另外一項內窺鏡下調查EoE病人食管微生物群的前瞻性研究顯示，與正常對照相比，EoE病人的總細菌負荷增加，嗜血桿菌豐度顯著提升[52]。Benitez等[53]采用16SrRNA基因測序分別對活動期和非活動期EoE病人及非EoE對照組的食管微生物進行比較分析發現，鏈球菌屬、普雷沃菌屬和擬普雷沃菌屬在三組食管活檢組織中豐度較高，這種以鏈球菌屬為主革蘭陽性菌的高豐度，與之前在沒有食管炎的成人和兒童的研究中結論一致[51,54-55]。與非EoE對照組相比，嗜血桿菌屬的豐度從EoE的非活動期到活動期，呈現逐步增加的趨勢，差異具有統計學意義[51,53]。此外，一項薈萃分析評估了11項的大樣本觀察性研究結果顯示，與未暴露組相比，在Hp暴露下EoE的發生率降低了37%，食道嗜酸性粒細胞增多癥的幾率降低了38%，這可能與Hp誘導的免疫調節有關[56]。然而，前瞻性研究中很少得到Hp與EoE具有顯著相關的結論，因此，Hp的作用仍需更多的證據。

總之，這些研究表明，EoE病人的食管微生物組成不同于正常食管黏膜微生態。而細菌負荷的增加可能并不是EoE直接影響的結果，因為隨著防御素的釋放，嗜酸性粒細胞具有細胞外DNA陷阱和抗微生物特性，局部環境的變化和菌群之間協作互存可能導致了細菌負荷的增加[57-58]。與GERD類似，EoE的微生物菌群顯示出從革蘭陽性菌向革蘭陰性菌轉變的趨勢，考慮到革蘭陰性菌在GERD中作用，我們推測嗜血桿菌和變形桿菌在EoE的嗜酸性粒細胞增多中發揮著潛在作用[6]。

4.食管微生態與食管動力障礙：目前還沒有關于食管微生物群在食管動力障礙(如賁門失弛緩癥)的詳細報道，僅有少數研究提及了Chagas病和ESCC中伴有食管動力障礙時的微生物群組成[59-61]。一項關于繼發于Chagas病的巨食管癥病人的前瞻性研究，將食管抽吸物進行培養發現，與對照組病人相比，巨食管癥病人具有更高濃度的細菌，尤其是硝酸鹽還原相關的細菌更為顯著[62]。此外的幾項研究發現，賁門失弛緩癥病人的ESCC發病率增加[43,61]。這種潛在的原因可能是食管腔內長期慢性炎癥所致，食管下端括約肌功能失調改變了微生物菌群的生存環境。食管微生態與食管運動障礙之間相互作用的探究，對于揭示微生物群如何影響食管運動功能仍具有較高探索價值。

三、膳食與食管微生態

關于膳食對食管微生態直接影響的報道有限。一項對47例BE病人經內鏡下活檢行高通量測序的回顧性研究發現，膳食纖維攝入增加與厚壁菌門豐度升高和變形菌門比例減少有關，而脂肪膳食對食管菌群的組成沒有顯著影響[63]。然而，一項動物模型顯示，高脂肪乳制品飲食較低脂肪組的動物有更高的BE和Barrette發育不良的發生率，并指出脂肪消耗過程中，膽汁內牛磺酸結合物濃度的增加可促進BE的發展[64]，高脂飲食可加速異型增生，并與食管組織中中性粒細胞和自然殺傷細胞比率增加有關[65]。另外，一項基于攝入食物頻率問卷的研究顯示，飲食中高攝入β-胡羅卜素與Barrette發育不良的風險呈負相關，高抗氧化指數得分與EAC風險呈負相關[66]。攝入大量精制糖等食物也會導致食管微生物群的改變，增加短鏈脂肪酸和膽汁酸的產生[67]。鑒于類似于腸道的能量代謝及食管腸上皮化生過程，影響這些代謝產物的食管微生物群可能也參與其中。

四、藥物與食管微生態

抗生素、PPI、非甾體抗炎藥和益生菌等藥物也可影響食管微生物群組成，進而使機會致病菌或病原菌參與到食管疾病的發生發展中[3,68-69]。Sawada等[70]采用末端限制性片段長度多態性分析法，探究了EAC根治術后抗生素(青霉素、鏈霉素)對大鼠食管微生物組的影響，結果顯示與對照組比較，抗生素組大鼠食管乳酸桿菌相對豐度降低，而梭狀桿菌豐度顯著升高。由于PPI的廣泛使用，在早期食管微生態的研究中，多數并未排除PPI這一變量的影響。在Amir等[71]的研究中，調查了暴露于PPI前后的食管微生物菌群變化，在經過8周的蘭索拉唑每天2次治療后行食管活檢，結果表明，在PPI暴露后，叢毛單胞菌科減少，而多種梭狀芽孢桿菌增加。Deshpande等[72]采用兩種測序方法對食管微生物組行代謝組學分析，發現PPI可使抗生素合成和產乙酸鹽途徑增加，進而影響食管菌群的生存環境。此外，有研究指出，在包括鏈球菌等細菌或真菌中，PPI可直接與三磷酸腺甙酶(ATP-ases)家族結合，改善機體能量代謝[72]。PPI對食管微生態的影響是多種機制的作用結果，盡管這些機制尚不清楚，但鑒于PPI的長期廣泛使用，這種影響機制仍值得深入探索。毫無疑問，最近興起火熱的微生態制劑，也會不同程度地影響到食管微生態的組成，這種綜合效應仍需進一步地評估。

五、展望

目前正常食管微生物菌群的組成已基本清晰，即由鏈球菌屬為主導的復雜菌群組成，但涉及到地理環境、種族差異、飲食習慣等因素仍不能忽視。食管微生物菌群與食管疾病之間存在密切關聯，但這種具體的因果關系、特定致病菌、潛在機制等仍需要大樣本的宏基因組學分析及實驗驗證，進而尋求疾病的微生態靶點，更為精準地實施微生態靶向治療。