非酒精性脂肪性肝病對腸道免疫細胞的影響

雷亞蘭，畢 儉，毛靖偉

大連醫科大學附屬第一醫院 消化內科，遼寧 大連 116011

隨著肥胖、糖尿病等代謝疾病發病率日漸上升，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全球公共衛生問題。全球NAFLD平均患病率為25%，NAFLD及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)在美國患病率分別為30%和5%[1]。在我國，NAFLD患病率從2001年23.8%急劇上升到目前32.9%，正取代乙型肝炎成為慢性肝病的主要原因[2]。NAFLD與腸道免疫密切相關[3-4]，腸道免疫失衡促進NAFLD肝臟炎癥、纖維化進展，而NAFLD能夠引起腸道免疫紊亂[5]。通過腸肝循環以及免疫細胞募集、再循環，NAFLD與腸道免疫相互作用。本文就NAFLD對腸道免疫細胞的影響進行系統性闡述，以期從腸道免疫角度為防治NAFLD尋找新的治療靶點，進而延緩、甚至阻斷疾病進展。

1 NAFLD對腸道免疫細胞的影響

1.1 NAFLD與腸道巨噬細胞 腸道巨噬細胞不僅在固有免疫中起作用，在適應性免疫中也充當抗原呈遞細胞角色。腸道處于炎癥狀態時，循環中大量單核細胞被招募至固有層，發育成巨噬細胞[6]，腸道巨噬細胞大都源于此。當腸道受病原體侵襲，腸道黏膜層巨噬細胞通過Toll樣受體(TLR)清除病原體[7]。除此之外，黏膜層巨噬細胞也具備清除凋亡組織及免疫調節功能。

NAFLD與巨噬細胞的研究多聚焦于Kupffer細胞以及骨髓來源肝臟單核巨噬細胞，關于NAFLD與腸道巨噬細胞的報道較少。Tsujimoto等[8]發現，在NASH大鼠回腸組織中，包括巨噬細胞在內的免疫細胞數量明顯增加，通過TLR4信號介導的固有免疫應答增強，TNFα表達上調，說明腸道免疫和肝臟相互作用參與了NASH發生。Imajo等[9]也發現，NASH小鼠肝臟CD14及TLR4陽性巨噬細胞數量明顯增加，該類細胞對低劑量腸源性脂多糖呈現過度反應。相關研究[10]說明，在NAFLD發病過程中，腸道固有免疫被激活，同時其下游肝臟固有免疫也呈現活化狀態，大量骨髓源性單核細胞被募集至肝臟，促進肝臟炎癥、纖維化，而腸源性巨噬細胞在該過程中發揮重要作用。在諸如NAFLD的膽汁淤積發生過程中，腸道巨噬細胞通過炎癥小體的激活，促進腸道通透性增加和腸道微生態改變，導致進入肝臟的內毒素增加，參與了膽汁淤積介導的肝細胞死亡和炎癥。

腸道菌群對于維持巨噬細胞依賴的腸道免疫穩態至關重要，這一過程主要由短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)調控[11]。在NAFLD發病過程中，腸道菌群失調所致的SCFA含量異常可能是導致腸道巨噬細胞數量及表型發生變化的機制之一。丁酸可以增加腸道巨噬細胞的氧自由基產生和抗菌物質分泌，使其抗菌能力增強[12]。SCFA可以明顯下調NASH中腸道巨噬細胞的肝臟募集及肝臟炎癥反應，SCFA改善NASH肝臟脂肪變性和炎癥，不僅與SCFA作用于肝臟巨噬細胞有關，也可能與調控腸道巨噬細胞有關[13]。

1.2 NAFLD與腸道樹突狀細胞(DC) DC是唯一能直接激活初始T淋巴細胞的專職抗原呈遞細胞。作為腸道專職抗原呈遞細胞的DC通過多種模式識別受體對腸道微生物群進行識別和應答[14]。DC在腸壁全層均有分布，除呈遞抗原外，還具備免疫調節功能，參與免疫耐受的誘導和維持[15]。

肝臟DC參與NAFLD的肝臟脂肪變性、炎癥及纖維化[16]。在慢性炎癥環境中，肝臟DC轉化為強效免疫反應誘導物，參與肝脂質沉積，是NAFLD進展機制之一[17]。此外，某些肝臟DC亞型，如CD103+cDC以及CD11c+MHCⅡ+DC對NAFLD肝臟炎癥環境具有免疫調節作用，保護肝臟免受代謝性損傷[18-19]。有關NAFLD對腸道DC的影響，現有研究結論尚未統一。Tsujimoto等[8]發現，NASH大鼠回腸組織DC數量明顯增加，腸道固有免疫呈過度活化狀態。國內學者[20]卻發現，小鼠腸道DC與NAFLD發生發展相關，即在NAFLD早期階段，小腸DC數量明顯升高，隨著疾病進一步發展，DC數量未再明顯變化。這一現象可能與以下原因有關：在NAFLD早期，腸道穩態被破壞導致炎性抗原增多，負責腸道適應性免疫應答始動階段的DC數目隨之增加，但隨著病情發展，腸道適應性免疫應答轉換為效應階段，腸道DC數量未再變化。筆者研究[21]發現，在單純性脂肪肝和NASH大鼠中，CD103+MHCⅡ+DC占腸系膜淋巴結(mesenteric lymph node, MLN)總細胞的比率較對照組明顯降低，并且該比率與疾病嚴重程度、門靜脈脂多糖水平呈相反的變化趨勢。該結論可能與MLN中大部分均為免疫細胞，DC變化的同時其他免疫細胞發生變化，并且變化幅度更大有關。

在NAFLD中，腸道屏障完整性受損以及腸道菌群紊亂與腸道DC失調密切相關。DC通過分泌IL-10，抑制輔助性T淋巴細胞(Th)17介導的炎癥反應，以此保護腸道屏障完整性[22]。另外，腸道菌群的代謝產物能夠調節腸道DC功能。有學者[23-24]發現，SCFA能夠調節單核細胞來源的DC表型分化、成熟過程和免疫功能，包括細胞因子分泌、抗原捕獲能力以及對T淋巴細胞的刺激作用。作為法尼酯受體激動劑的次級膽汁酸能夠通過抑制NF-κB轉錄通路調節腸道DC功能[25]。

1.3 NAFLD與腸道固有淋巴細胞(innate lymphoid cells, ILC) ILC主要分布在腸道固有層，具有維持腸道穩態和抵御病原體的功能。ILC表達多種細胞因子受體，但不表達抗原特異性受體，不會對病原體抗原直接做出反應。ILC分為自然殺傷細胞(NK細胞)、1型ILC(ILC1)、2型ILC(ILC2)、3型ILC(ILC3)和淋巴組織誘導細胞。

在肝臟組織中，NK細胞數量約占肝臟淋巴細胞30%～50%，分為組織固有NK細胞和循環NK細胞(circulated NK cells, cNK細胞)。肝臟CD49+NKp46+cNK細胞通過促進巨噬細胞極化來改善NASH纖維化[26]。Fan等[27]發現，肝臟cNK細胞增多可以改善肝臟CD45+CD11bhiF4/80int單核細胞源性巨噬細胞的炎癥浸潤。當腸道感染后，小腸NK細胞對病原體做出免疫應答，通過分泌IFNγ發揮作用[28]。ILC2表達轉錄因子GATA-3，分泌細胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13，在抗寄生蟲、組織修復和過敏反應中發揮作用。Forkel等[29]發現，肝纖維化的肝組織內ILC2數量增高，其表型與外周血ILC2不一致，其通過分泌IL-13激活肝星狀細胞促進肝纖維化。ILC3是肝臟ILCs中占比最多的一類，且大量定居在腸道中。ILC3表達轉錄因子RORγt并分泌淋巴毒素α1β2、IL-17A、IL-22、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和TNFα。肝纖維化過程中，肝臟IL-17A+及IL-22+ILC3亞型具有促纖維化作用[30]。有關NAFLD對腸道ILC的影響及調控尚未見系統報道。

1.4 NAFLD與腸道T淋巴細胞 腸道T淋巴細胞識別抗原后，活化并遷移至MLN，經淋巴或血液循環發育為效應T淋巴細胞，分布于腸道和其他器官介導細胞免疫應答，小部分T淋巴細胞發育為記憶性T淋巴細胞。CD4+T淋巴細胞發揮免疫輔助作用，調節適應性免疫應答；CD8+T淋巴細胞發揮細胞毒作用，且對CD4+T淋巴細胞產生免疫抑制的調節作用[31]。腸道T淋巴細胞主要定居于腸相關淋巴組織及MLN中，一部分CD8+T淋巴細胞分布于腸道上皮層。

在NAFLD發病過程中，侵入腸道的抗原能夠激活全身及腸道細胞免疫反應。研究[32]發現，NAFLD外周血單個核細胞(periphera blood mononuclear cells, PBMC)及派伊爾結(Peyer’s Patch, PP)的CD4+/CD8+T淋巴細胞比值呈現動態變化：在NAFLD早期階段，PBMC及PP中CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞比值均明顯增高，提示全身以及腸道細胞免疫應答均處于增強狀態；隨著NAFLD進展，比值呈下降趨勢，而門靜脈中脂多糖水平升高，提示機體免疫系統受損，炎癥范圍進一步蔓延；當進展到NASH階段，PBMC中的CD4+與CD8+T淋巴細胞比值和門靜脈中脂多糖的水平恢復正常，但是PP中該比值仍然是升高的，反映了腸道持續性的慢性炎癥狀態。研究者[33]還發現，NAFLD小鼠MLN內包括Th1和Th17的CD4+T淋巴細胞數量較正常對照組明顯增多，而Th2和調節性T淋巴細胞(Treg)數量卻顯著減少；進一步分析其比例發現，Th1/Th2和Th17/Treg均明顯升高。該研究提示，在NAFLD發病過程中，腸道促炎反應和抗炎反應之間的微妙平衡被打破，腸道免疫處于失衡狀態。Jiang等[34]卻發現，NAFLD患者的十二指腸組織固有層的CD4+和CD8+T淋巴細胞較正常患者明顯減少，而促炎因子TNF、IL-6和 IFNγ表達水平增高。該臨床研究結果與其他結果不一致，可能與血清脂多糖水平、物種、取材部位和疾病嚴重程度有關。

作為腸道菌群代謝產物，SCFA對T淋巴細胞的生理活動產生重大影響。丁酸刺激T淋巴細胞分化為Treg，乙酸和丙酸可以刺激常駐結腸組織Treg增殖[35]。在NAFLD中，腸源性內毒素血癥引起循環及肝臟內毒素水平升高，當內毒素被巨噬細胞或單核細胞呈遞給初始CD4+T淋巴細胞后，能夠上調IL-17表達，這可能是腸道及肝臟Th17數量增加的機制之一，而肝臟中增高的Th17促進NAFLD肝臟炎癥及纖維化，加速單純性脂肪肝向NASH轉變[36-37]。相比于骨髓、脾臟和胸腺源性的淋巴細胞，腸源性CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞更趨向于再循環至肝臟，通過分泌炎癥因子和刺激吞噬細胞分化等途徑介導肝臟炎癥反應，促進NAFLD病程發展，這可能與肝細胞趨化因子CCL5表達升高以及MLN內CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞及CD19+B細胞淋巴表面CCR3高表達有關[38]。

1.5 NAFLD與腸道B淋巴細胞 腸道B淋巴細胞骨髓源性B2細胞和由腹腔遷移而來的B1細胞。與B1細胞產生的非T淋巴細胞依賴性IgA相比，B2細胞產生的T淋巴細胞依賴性IgA在與抗體結合時具有更高特異性和親和能力[39]。在NAFLD中，肝臟B淋巴細胞常發生在T淋巴細胞活化之前，通過產生炎癥介質和抗體促進肝小葉的炎癥及纖維化，加快病程發展[40]。在腸道抗原刺激下，肝臟B淋巴細胞的IgA進入腸道，同時腸源性產IgA的B淋巴細胞至肝臟，參與肝臟體液免疫[41]。通過腸肝循環，肝臟及腸道B淋巴細胞交集。

關于NAFLD與腸道B淋巴細胞究非常少，更多研究是關于NAFLD和腸道IgA之間的關系。在NAFLD中，腸道IgA水平明顯降低，其變化可能與腸源性內毒素血癥、疾病的嚴重程度相關。Li等[42]發現，NASH大鼠腸道黏液中的SIgA水平明顯降低，門靜脈中內毒素水平升高，兩者呈負相關。NASH小鼠的糞便標本中IgA水平明顯降低，回結腸組織中IgA陽性細胞也明顯減少，但在單純性脂肪肝階段，小鼠糞便IgA水平和回結腸IgA陽性細胞數量相對于對照組并無顯著差異，這似乎表明NAFLD腸道IgA水平與疾病嚴重程度負相關，糞便IgA水平可以預測疾病嚴重程度[43]。然而血清IgA水平與NAFLD嚴重程度正相關，即隨著NAFLD病情加重，血清IgA水平也隨之升高[44]。

腸道IgA能夠影響腸道菌群變化，而腸道IgA也受腸道菌群調控[45]。在缺乏B淋巴細胞的糞便中，腸肝菌科數量明顯增加[46]。將低糞便IgA水平小鼠和高糞便IgA水平小鼠共同飼養或者通過糞便移植的方式使腸道菌群垂直轉移后，高糞便IgA小鼠的糞便IgA水平明顯降低[47]，提示腸道IgA水平受腸道菌群調節。益生菌通過提高腸道IgA水平以及腸黏膜內IgA陽性細胞數量來改善腸道免疫紊亂，緩解NAFLD病程[43]。NAFLD腸道IgA下降，腸道埃希氏桿菌屬(屬于腸桿菌科)豐度卻較對照組明顯增加[34]。與正常及肥胖兒童相比較，在綱水平上，NAFLD兒童腸道變形菌(腸桿包含菌科)明顯增多[48]。據此推測，NAFLD腸道IgA水平可能與腸桿菌科失衡相關。

腸道菌群代謝產物SCFA與腸道IgA水平也密切相關。人糞便中的丁酸濃度與IgA水平呈正相關，丁酸能夠增強IgA免疫效應[49]。SCFA能夠調節B淋巴細胞代謝，如增加氧化磷酸化、糖酵解及游離脂肪酸合成，使得線粒體產生更多能量參與B淋巴細胞、分化和抗體生成[50]。NAFLD的腸道B淋巴細胞IgA水平的變化可能受上述機制所影響。

2 以腸道免疫為靶點治療NAFLD

從腸道免疫的角度治療NAFLD已成為當下研究熱點。一些藥物可以通過口服給藥途徑靶向調節腸道免疫系統，進而改善NAFLD。現階段抗CD3單克隆抗體、PRX106(重組抗TNFα融合蛋白)已經進入臨床試驗階段。

抗CD3單克隆抗體(anti-CD3 monoclonal antibody, Anti-CD3 mAb)口服后不被腸道吸收，但能夠影響腸道免疫，將免疫信號傳遞至全身免疫系統。Anti-CD3 mAb口服后被固有層中的DC攝取，隨DC遷移至MLN誘導Treg的分化，從而調節全身免疫狀態。口服Anti-CD3 mAb誘導Treg和NKT淋巴細胞抑制炎癥反應，減少肝臟脂質蓄積、減輕炎癥改善、病情[51]。健康志愿者及NASH患者在口服Anti-CD3 mAb后有良好安全性、耐受性以及生物活性[52]。

PRX106是一種重組抗TNFα融合蛋白，口服后不被胃腸道吸收，能夠改善免疫相關的肝臟損傷和結腸炎，該過程與CD4+CD25+Foxp3+Treg分布有關[53]。口服PRX106可以降低NASH小鼠的血清甘油三酯、葡萄糖、胰島素和AST水平，改善肝損傷[54]。在此過程中，腸道免疫信號對肝臟免疫系統乃至全身免疫系統產生影響，具體機制尚不清楚。臨床試驗表明健康志愿者口服PRX106后有良好的安全性、耐受性以及生物活性[55]。

3 問題與展望

目前，有關NAFLD發病中腸道免疫系統變化的趨勢、機制尚未明確，大部分研究結論均建立在NAFLD模型基礎之上，其與真實世界的一致性仍面臨重大挑戰。在NAFLD中腸道免疫系統失衡是存在的，不同免疫細胞變化伴隨著疾病發展與全身免疫系統紊亂，其中腸道菌群紊亂可能是NAFLD中腸道免疫紊亂的機制之一。目前NAFLD尚無特效藥物，而腸道免疫細胞作為NAFLD的治療靶點，具有較好的前景，其中Anti-CD3 mAb和PRX106的口服給藥可以通過調節腸道局部的免疫環境，進而改善全身免疫環境及肝臟的免疫環境來治療NAFLD。

總之，腸道免疫失衡參與了NAFLD發生與發展，探究腸道免疫的角色有助于對NAFLD發病機制以及治療的研究，而口服免疫制劑的應用為治療NAFLD提供了新手段。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：雷亞蘭負責課題設計，撰寫論文；畢儉負責參與修改論文；毛靖偉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。