乳礦物鹽的安全性與功能性評價

◎ 曹 亮，黃 莉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028）

乳礦物鹽又稱乳鈣、乳清礦物質(zhì)濃縮物、乳清鈣，其以乳清為原料，經(jīng)過純化、超濾和干燥等工藝制成[1]。乳礦物鹽含有磷酸鈣、蛋白質(zhì)、乳糖及鋅、鈉、鉀、鎂等豐富的營養(yǎng)成分，較利于人體吸收利用，作為一種新鈣源被廣泛應(yīng)用[2]。

乳礦物鹽因其獨特的生理功能，其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用前景必然廣闊。因此，本文以大鼠和小鼠為研究對象，分別進行為期90 d和30 d的灌胃實驗，分析乳礦物鹽對大鼠食物利用率與大鼠胃、腸、脾、肝臟等組織病理學(xué)的影響。同時，分析乳礦物鹽對小鼠免疫功能的影響，為其全面利用和開發(fā)乳礦物鹽提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù)，為開發(fā)功能保健食品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳礦物鹽由阿爾拉食品原料貿(mào)易（北京）有限公司（原丹麥阿拉食品原料有限公司北京代表處）提供，0525BG乳鈣，乳白色粉狀；體重65～80 g清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（軍）2012-0003；體重16～20 g清潔級昆明種小鼠200只，雌雄各半，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-（軍）2002-0001；飼料由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心公司提供，許可證號：清潔級，SCXK-（軍）2002-018。

注射用墨汁、刀豆蛋白A（ConA）、噻唑藍（MTT）、2,4二硝基氟苯（DNFB）、丙酮、麻油、綿羊紅細胞（SRBC）、生理鹽水、雞紅細胞、、甲醇、Giemsa染色、YAC-1細 胞、Hanks液（pH=7.2～7.4）、RPM11640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰、碘硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、Tris-HCL緩沖液（pH=8.2）、1% NP40、臺酚蘭、1 mol·L-1鹽酸和酸性異丙醇等。

1.2 儀器與設(shè)備

SHANDON EXCELSIOR全自動密封脫水機；電熱鼓風(fēng)干燥箱；Olympus IX71倒置顯微鏡；8 mm直徑打孔器；微量血凝試驗板；2-16K通用離心機；RT-6100酶標儀；96孔培養(yǎng)板；Co-150 CO2培養(yǎng)箱；UV-1800紫外可見分光光度計；電子天平；顯微鏡。

1.3 受試樣品及配制

乳礦物鹽的成人日推薦量為2.4 g，即0.04 g·kg-1BW（成人體重以60 kg計）。安全性評價實驗組按日推薦量的25倍、50倍、100倍配制受試樣品濃度分別 為1.0 g·mL-1、2.0 g·mL-1和4.0 g·mL-1的 低、中、高劑量劑量組；功能性評價實驗組按照乳礦物鹽受試物成人日推薦量的5、10和30倍，設(shè)3個劑量組為0.2 g·mL-1、0.4 g·mL-1、1.2 g·mL-1；以去離子水作為對照組，臨用前稱取礦物質(zhì)鹽加去離子水至1.0 mL，混勻。

1.4 動物分組與給藥

1.4.1 安全性評價實驗組

參照《保健食品及其原料安全性毒理學(xué)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（2020年版）》，按性別隨機分成4組、每組10只。試驗設(shè)3個劑量組為1.0 g·kg-1BW、2.0 g·kg-1BW、4.0 g·kg-1BW，去離子水為空白對照。試驗期間單籠喂養(yǎng)，自由進食飲水，室溫為20～23 ℃，濕度為45%RH～52%RH，每天定點灌胃（上午8:00），連續(xù)灌胃90 d后，記錄飼料撒漏量，每周記錄一次體重和2次食物攝入量。喂養(yǎng)90 d后對肝、腎、脾、胃腸、睪丸和卵巢做病例學(xué)檢查。

1.4.2 功能性評價實驗組

200只小鼠隨機分成5大組，再分成4小組，每小組10只小鼠，設(shè)3個劑量組為0.2 g·kg-1BW、0.4 g·kg-1BW、1.2g·kg-1BW，分別高、中、低劑量組，單籠喂養(yǎng)，室溫為20～23 ℃，濕度為45%RH～52%RH，每天定點灌胃（上午8:00），連續(xù)灌胃90 d后，分別進行試驗。

1.5 安全性評價實驗組實驗方法

對選取的安全性實驗組的大鼠連續(xù)灌胃90 d，進行食物利用率、病理組織學(xué)檢查。食物利用率公式如下：

1.6 功能性評價實驗組實驗方法

1.6.1 小鼠體重的測定標記每只小鼠，對小鼠定點測定體重，記錄小鼠的初始體重和終期體重。

1.6.2 免疫器官系數(shù)

參照張勇[3]的實驗方法。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機分成對照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。按每日1mL·kg-1BW連續(xù)灌胃，連續(xù)30 d，末次給藥6 h后，脫頸椎處死小鼠，稱量小鼠體重，取腹腔液后，無菌分離肝臟和脾臟，稱重。免疫器官系數(shù)計算如下：

免疫器官系數(shù)（g/g）=免疫器官重量/體重

1.6.3 碳廓清實驗

末次給藥6 h后，注射印度墨水并記時2 min、10 min，分別取內(nèi)眥靜脈叢血20 μL，并立即加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液為空白對照，在600 nm處測定OD值，將小鼠處死后，取出肝臟、脾臟后稱重，計算吞噬指數(shù)a：

1.6.4 抗體生成細胞檢測

頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟，經(jīng)磨碎、過濾、離心，洗滌后懸浮于8 mL Hanks液中。取25 μL脾細胞懸液、50 μL 10% SRBC、0.5 mL 0.5%的瓊脂糖Hanks液混合培養(yǎng)基迅速混勻，傾倒于6 cm已刷瓊脂薄層的平皿上，于CO2培養(yǎng)箱中溫育1.5 h，然后加入用SA緩沖液稀釋的補體（1∶8），溫育3 h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)[4]。

1.6.5 血清溶血素的測定

將小鼠摘除眼球采血，2 000 r·min-1離心10 min進行血清的分離，用生理鹽水稀釋不同倍數(shù)并置于微量血凝板內(nèi)，每孔100 μL，加入同體積的0.5%（v/v）的SRBC懸液，混勻，37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度[5]。

1.6.6 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

參照史頂聰?shù)萚6]的方法，并做適當修改，將上述細胞懸液經(jīng)離心，調(diào)整濃度為3×106個/mL。分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA液，另一孔為對照，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)68 h時，每孔吸取0.7 mL上清液，并加入同體積不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液與50 μL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，分裝于96孔培養(yǎng)板，3個平行孔，于570 nm處測定OD值。

1.6.7 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）檢測

末次給藥6 h后，對小鼠腹部皮膚約3 cm×3 cm進行脫毛處理，用50 μL的DNFB溶液涂抹均勻致敏；5 d后，再以10 μL的上述溶液均勻涂抹小鼠右耳。24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳，用打孔器取下直徑8 mm的耳片稱重，按下列公式計算左右耳腫脹度差[7]：

左右耳腫脹度差=右耳重量-左耳重量

1.6.8 小鼠腹腔巨噬雞紅細胞實驗（半體內(nèi)法）

腹腔注射1 mL 20%雞紅細胞懸液。30 min后，頸椎脫臼處死動物，固定在鼠板上剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入2 mL生理鹽水，轉(zhuǎn)動鼠板1 min。吸出1 mL腹腔洗液，滴于2片載玻片上，移置37 ℃溫育30 min。生理鹽水漂洗、晾干、固定、染色、蒸餾水漂洗晾干。在油鏡下閱片計數(shù)，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.6.9 小鼠NK細胞活性測定（乳酸脫氫LDH測定法）

參照Cao等的方法[8]，試驗前24 h將靶細胞傳代培養(yǎng)，Hanks液洗3次，RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL。經(jīng)離心、稀釋、染色，調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL。取靶細胞和效應(yīng)細胞各100 μL（效靶比為50∶1），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將培養(yǎng)板離心（1 500 r·min-1）5 min，每孔吸取上清液100 μL置于96孔培養(yǎng)板中，并加入同體積的LDH基質(zhì)液，反應(yīng)3 min，每孔加入30 μL 1 moL·L-1的HCL，于490 nm處測定OD值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗的平行試驗次數(shù)至少3次。實驗數(shù)據(jù)以SPSS軟件進行單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊的實驗數(shù)據(jù)采用LSD法進行統(tǒng)計分析，方差不齊的實驗數(shù)據(jù)采用Tamnane法進行統(tǒng)計分析。當概率值≤0.05時，判定為統(tǒng)計學(xué)顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳礦物鹽的安全性分析

2.1.1 對大鼠食物利用率的影響

表1 為乳礦物鹽對大鼠食物利用率的影響，由表1可知，隨著灌胃時間的增加，各劑量組的食物利用率整體呈降低趨勢，雄性大鼠的食物利用率普遍高于雌性大鼠的食物利用率。雄性大鼠的食物總利用率在34%左右，而雌性大鼠的食物總利用率在24%左右，與同性別同時期的對照組比較，大鼠的食物利用率無顯著差異，說明乳礦物鹽對大鼠的食物利用率無影響。

表1 乳礦物鹽對大鼠食物利用率的影響表（單位：%）

2.1.2 乳礦物鹽對大鼠病理組織學(xué)的影響

經(jīng)觀察各劑量組大鼠未發(fā)現(xiàn)明顯病變，且生化指標未見異常，因此僅針對對照組及高劑量進行組織病理學(xué)檢查。表2為大鼠胃、腸、脾、卵巢和睪丸病理檢測結(jié)果，表3為大鼠肝臟與腎臟病理檢測結(jié)果，由表2、表3可知，正常肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細胞無明顯腫脹及顆粒變性，個別肝細胞漿內(nèi)出現(xiàn)少許細小的脂肪空泡，呈輕度脂肪變，脂肪變干細胞呈散在小灶分布，范圍小。干細胞無壞死改變，少數(shù)肝小葉、肝匯管區(qū)見淋巴細胞等炎細胞浸潤，無纖維組織增生，膽管未見異常；胃和十二指腸黏膜完整，無明顯出血、壞死、糜爛、潰瘍及炎細胞浸潤，無明顯腺體增生萎縮改變；腎皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，腎小管無明顯腫脹及空泡變性，個別腎間質(zhì)中有灶性炎細胞浸潤，個別腎髓質(zhì)部可見小囊腫；脾白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清楚，白髓、紅髓無明顯擴張或萎縮現(xiàn)象；睪丸曲細精管正常，可見各級生精細胞及成熟精子；卵巢發(fā)育正常，可見各級卵泡和成熟黃體。綜合可知，以上病理學(xué)改變僅個別動物中發(fā)生，各組標本病理變化無明顯差異，因此，乳礦物鹽對各臟器未引起病理學(xué)改變。

表2 大鼠胃、腸、脾、卵巢和睪丸病理檢測的結(jié)果表

表3 大鼠肝臟與腎臟病理檢測結(jié)果表（單位：例）

2.2 乳礦物鹽的功能性分析

2.2.1 對小鼠體重的影響

圖1 為乳礦物鹽對小鼠體重的影響，由圖1可知，與對照組比較，高、中、低劑量組小鼠的體重均無顯著差異（P＞0.05），說明了乳礦物鹽對小鼠體重?zé)o影響。

圖1 乳礦物鹽對小鼠體重的影響圖

2.2.2 對小鼠免疫器官系數(shù)的影響

正常情況下，健康小鼠的各臟器與體重的比值相對恒定。當動物染毒后，會引起受損臟器重量發(fā)生改變，從而引起臟體比的變化。表4為各劑量組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定結(jié)果，由表4可知，與對照組比較，高、中、低各劑量組均無顯著差異（P＞0.05）。從統(tǒng)計學(xué)方法分析說明了乳礦物鹽對小鼠的免疫器官指數(shù)無影響，未能促進免疫器官的增長。

表4 胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定表

2.2.3 細胞免疫功能測定

表5 為ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果，由表5可知，與對照組比較，低劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD值差異不顯著（P＞0.05），而中劑量組和高劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化OD差值明顯高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。中劑量組與高劑量組小鼠左右耳腫脹度明顯高于對照組，差異顯著（P＜0.05），而低劑量組與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。說明乳礦物鹽具有增強細胞免疫的功能。

表5 細胞免疫功能測定表

2.2.4 體液免疫功能測定

表6 為血清溶血素與抗體生成細胞檢測實驗結(jié)果，由表6可知，各劑量組小鼠抗體積數(shù)與對照組比較，差異均不顯著（P＞0.05）。與對照組比較，高劑量組的溶血空斑數(shù)具有顯著的差異（P＜0.05），中、低劑量組與對照組比較，差異不顯著（P＞0.05）。

表6 體液免疫功能測定表

2.2.5 單核-巨噬細胞功能測定

表7 為小鼠的碳廓清試驗與巨噬細胞吞噬試驗結(jié)果，由表7可知，高、中、低各劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)a與對照組比較，差異均不顯著（P＞0.05）。高、中、低各劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率、轉(zhuǎn)換值及吞噬指數(shù)與對照組比較，差異不顯著（P＞0.05）。

表7 單核-巨噬細胞功能測定表

2.2.6 NK細胞活性測定

表8 為NK細胞活性測定結(jié)果，由表8可知，低劑量組、中劑量組與高劑量組小鼠NK細胞活性明顯高于對照組，差異顯著（P＜0.05）。NK細胞活性測定結(jié)果為陽性，提示乳礦物鹽可以增強機體免疫功能。

表8 NK細胞活性測定表

3 結(jié)論

乳礦物鹽營養(yǎng)成分豐富，是公認的優(yōu)質(zhì)有機鈣源，易于人體吸收，有利于身體健康。本研究經(jīng)90 d實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，各劑量組對大鼠的食物利用率均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。同時，乳礦物鹽高劑量組對大鼠的胃、腸、脾、卵巢、睪丸、肝臟以及腎臟等器官均未引起病理學(xué)反應(yīng)，說明乳礦物鹽對大鼠身體無不良影響，食用安全性較高；經(jīng)功能性實驗發(fā)現(xiàn)，乳礦物鹽對小鼠的體重、免疫器官系數(shù)與體液免疫功能均無顯著影響，但對小鼠的細胞免疫功能和NK細胞活性等指標影響顯著。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）的規(guī)定，說明乳礦物鹽具有提高人體免疫功能的作用，為其在食品、保健食品中的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。