真武湯對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞ERK5及線粒體自噬關鍵蛋白的影響

別明珂 曾昭文 陳新宇

〔摘要〕 目的 探討真武湯對慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）大鼠心肌細胞細胞外信號調節激酶5（extracellular signal regulated kinase 5， ERK5）蛋白及線粒體自噬關鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）的影響。方法 SPF級SD大鼠52只，隨機抽取13只為正常對照組，剩余39只注射阿霉素（1.5 mg/mL溶液，2.0 mL/kg體質量）6周造模。在首次注射阿霉素20 天后，對造模大鼠進行心臟彩超檢查，以評估造模的均衡性。按左室射血分數將造模大鼠進行分層，并按隨機區組設計分為模型組、依那普利組和真武湯組，每組13只。藥物干預4周后，采用Western blot法檢測各組大鼠心肌細胞ERK5、p-ERK5蛋白及線粒體自噬關鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表達水平。結果 造模6周后，模型組ERK5蛋白表達水平明顯低于正常對照組，線粒體自噬關鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表達水平明顯高于正常對照組（P<0.05）;各治療組經藥物干預4周后，線粒體自噬關鍵蛋白（PINK1、Parkin、Prohibitin2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表達水平較模型組均有下降趨勢，ERK5蛋白表達水平較模型組均有上升趨勢（P<0.05），其中真武湯組與依那普利組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 真武湯可能通過上調心肌細胞p-ERK5表達水平，同時下調線粒體自噬關鍵蛋白的表達水平，從而發揮治療CHF作用。

〔關鍵詞〕 慢性心力衰竭;真武湯;細胞外信號調節激酶5;線粒體自噬;心肌細胞

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.005

Effects of Zhenwu Decoction on ERK5 and Key Proteins of Mitochondrial

Autophagy in Rats with Chronic Heart Failure

BIE Mingke1， ZENG Zhaowen2， CHEN Xinyu3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410300， China;

3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Zhenwu Decoction on extracellular signal regulated kinase 5 （ERK5） and key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） in myocardial cells of rats with chronic heart failure （CHF）. Methods A total of 52 SPF degree SD rats were enrolled into the study， 13 rats were randomly selected as normal control group， and the remaining 39 rats were injected with doxorubicin （1.5 mg/mL solution， 2.0 mL/kg body mass） for 6 weeks for modeling. The model rats were subjected to a cardiac ultrasound examination in order to assess the equilibrium established in the animal model on the 20th day after the first doxorubicin injection. Model rats were underwent CHF model stratification according to left ventricular ejection fraction， and then were divided into 3 groups （model group， enalapril group and Zhenwu Decoction group） using a random block design， with 13 rats in each group. After treated with drugs for 4 weeks， the expression levels of ERK5， p-ERK5 and key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） in cardiac myocytes of rats in each group were detected by Western blot. Results After 6 weeks of modeling， the expression of ERK5 in the myocardial cells of the model group was significantly lower than that of the normal control group， while the expression levels of key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） were significantly higher than that of the normal control group （P<0.05）; after 4 weeks of drug intervention in each treatment group， the expression of key proteins of mitochondrial autophagy （PINK1， Parkin， Prohibitin2， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ） had a downward trend compared with the model group， and the expression of ERK5 protein had an upward trend compared with the model group （P<0.05）. There was no significant difference between the naplepril group and Zhenwu Decoction group （P>0.05）. Conclusion Zhenwu Decoction may exert therapeutic effects on CHF by upregulating the expression level of p-ERK5 and downregulating the expression levels of key proteins of mitochondrial autophagy in cardiomyocytes.

〔Keywords〕 chronic heart failure; Zhenwu Decoction; extracellular signal regulated kinase 5; mitochondrial autophagy; cardiomyocytes

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）是各種心血管疾病的終末期表現和最主要的死亡原因[1]。隨著老齡化進程的加速，CHF患病率顯著升高[2]。研究[3]發現，心肌細胞線粒體自噬失衡而引起的心肌細胞死亡是CHF過程中的重要機制。正常范圍的線粒體自噬能夠及時清除受損的線粒體，對心肌細胞具有保護作用;病理狀態下，心肌細胞線粒體自噬失衡，自噬小體過度激活，可直接誘導心肌細胞死亡，加重CHF病情[4]。

中醫藥在CHF的干預上具有獨特優勢，中醫藥不僅能夠緩解臨床癥狀、降低藥物不良反應，同時能夠降低CHF患者各項生化指標、減輕心肌細胞壞死程度、改善心肌重構，整體提高生存質量[5]。真武湯出自東漢張仲景《傷寒論》，具有溫陽利水之功效。2014年中醫診療專家共識[6]針對CHF的中醫治療將真武湯作為推薦方之一。

課題組前期研究[7]顯示，MAPK/ERK5通路在CHF的進展過程中起到心肌保護作用。真武湯可通過拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS）而降低CHF大鼠血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）水平，而AngⅡ可下調p-ERK5的表達。心肌細胞線粒體自噬與CHF密切相關，ERK5與線粒體自噬均可被氧化應激、細胞毒性、缺血缺氧等外界刺激同時激活[8-9]。目前，關于真武湯治療CHF的研究，多為臨床研究或網絡藥理學方面，實驗研究機制較為單一，真武湯對心肌細胞線粒體自噬蛋白的調控有待進一步研究。據此，本實驗通過構建CHF大鼠模型，探討真武湯對CHF大鼠ERK5及線粒體自噬關鍵蛋白的影響。

1 材料

1.1 ?實驗動物

SPF級健康6周齡雄性SD大鼠52只（由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證批號：SCXK（湘）2016-0002），體質量（200±20） g。在自由飲食、光/暗周期為12 h/12 h（光照時間為6：00～18：00）、背景噪聲為（40±10） db、溫度（20±3） ℃條件下飼養1周以適應環境。本研究倫理審查由湖南中醫藥大學動物實驗中心批準，飼養及實驗地點為湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗室。

1.2 ?主要藥物與試劑

真武湯（湖南中醫藥大學第一附屬醫院新綠藥）按照謝鳴主編的《方劑學》[10]教材的推薦劑量：炮附子9 g，白術6 g，白芍9 g，茯苓9 g，生姜9 g，用蒸餾水溶化而成。鹽酸阿霉素（深圳萬樂藥業有限公司，批號：1703E1）;馬來酸依那普利片（揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司，批號：H32026567）;PINK1抗體（批號：23274-1-AP）、Prohibitin2抗體（批號：12295-1-AP）、LC3抗體（批號：14600-1-AP）均購自美國Proteintech公司;Parkin抗體（批號：ab179812）、ERK5抗體（批號：ab40809）、p-ERK5抗體（批號：ab5686）均購自英國Abcam公司。

1.3 ?主要儀器

臺式冷凍離心機（深圳黑馬醫學儀器有限公司，型號：TGL-18R）;電泳儀（美國Bio-rad公司，型號：164-5050）;轉膜儀（型號：DYCZ-40A）、電泳槽（型號：DYCZ-24EN）均購自北京六一生物科技有限公司;電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司，型號：FA-N）;精密pH計（中國雷磁分析儀器廠，型號：E-201-C）;普通冰箱（中國榮事達電子電器集團，型號：BCD-245F）;彩色多普勒超聲診斷儀（美國西門子公司，型號：ACUSONSequoia 512）;電磁爐（美的集團，型號：MC-EP186）;切片機（金華市益迪醫療設備有限公司，型號：YD-202III）;包埋機（常州市中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-Ⅲ）;旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-901）;電動玻璃勻漿器（日本新芝公司，型號：DY89-1）。

2 方法

2.1 造模及分組

SPF級SD大鼠52只先飼養1周以適應環境，隨機抽取13只作為正常組。1周后對除正常組以外的所有大鼠用阿霉素進行造模[11]。首先用生理鹽水將阿霉素配制成1.5 mg/mL溶液，以2.0 mL/kg體質量進行腹腔注射，每周1次，連續注射6周，累積每只大鼠注射阿霉素總量18 mg/kg，每次造模前重新稱重，作為該次用藥劑量的計算標準。

為評估動物模型建立的均衡性[11]，將余下39只大鼠在首次注射阿霉素后第20天（第3次注射阿霉素后第6天），進行心臟彩超檢查。根據大鼠左室射血分數（left ventricular ejection fraction， LVEF）先進行分層，然后通過隨機區組設計平均分為3組，每組13只，分別為模型組、依那普利組和真武湯組。

2.2 ?給藥

自實驗開始造模的第21天開始，除正常組外，所有大鼠繼續用配置好的阿霉素溶液進行腹腔注射，每周1次，連續3周;同時真武湯組予以真武湯4.4 g/（kg·d），用水配成混懸液灌胃，給藥劑量參考《藥理實驗方法學》[12]，根據成人與大鼠體表面積進行換算（D成人=K·D大鼠），換算系數K為6.25。依那普利組予以馬來酸依那普利片1.8 mg/（kg·d），用水配成混懸液灌胃，正常組和模型組均予以等量蒸餾水灌胃，每天2次，各組連續灌胃4周。

2.3 ?指標記錄及檢測

2.3.1 ?一般情況 ?給藥后，每周測定大鼠體溫、體質量，詳細記錄進食數量和飲水情況。

2.3.2 ?心臟彩超檢查 ?所有實驗大鼠在稱重后依次分批麻醉，備皮，然后取平臥位固定于手術臺上，將彩超探頭置于胸骨左側心尖部，并指向右上方心底部，找到左室長軸切面，然后用M型超聲計算出LVEF及左室縮短分數（left ventricular fractional shortening， LVFS），連續測量5次，然后取平均值，所有測量由同一個操作者完成。

2.3.3 ?血清學指標檢測 ?血清NT-proBNP表達的檢測采用酶聯免疫吸附測定法。取各組大鼠腹主動脈血，將采集的血靜置10 min后以用離心機按轉速3000 r/min離心15 min，離心半徑6.75 cm，接著用移液槍吸取上層血清，置于EP管中，并進行標記、編號，放置于-20 ℃冰箱待檢。檢測具體操作按試劑盒標準說明進行。

2.3.4 ?蛋白表達水平檢測 ?采用Western blot法檢測，首先將100 μg樣品總蛋白加入5×Loading buffer混勻，接著置于沸水中煮5 min，再置于冰盒中速冷，經蛋白變性后開始電泳。在電泳結束后設定轉膜電流為300 mA。轉膜完畢后，將膜取出放入1×TBST沖洗5 min。然后將膜浸入1×TBST配制5%脫脂奶粉中，室溫封閉1.5 h。取出膜，置于一雜交袋中，分別加入ERK5抗體（稀釋比例1∶10 000）、p-ERK5抗體（稀釋比例1∶1000）、PINK1抗體（稀釋比例1∶700）、Parkin抗體（稀釋比例1∶2000）、Prohibitin2抗體（稀釋比例1∶800）、LC3抗體（稀釋比例1∶2000），GAPDH抗體（稀釋比例1∶3000），4 ℃過夜。孵育結束，1×TBST洗3次，每次15 min。用1×TBST稀釋HRP標記的二抗（稀釋比例1∶6000），將稀釋后的二抗與膜共同孵育90 min。孵育結束，1×TBST再次沖洗3次，每次15 min。ECL顯色曝光、掃描、保存。運用Quantity one專業灰度分析軟件，將各個目的蛋白與GAPDH的灰度值的比值進行統計分析。

2.3.5 ?組織形態學觀察 ?取心臟左室面組織在光鏡下觀察其細胞形態，將固定后的心肌組織進行脫水、透明、包埋、切片、染色等程序，封片后于400倍光鏡下觀察染色效果并拍照。

2.4 ?統計學方法

所有數據結果采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料用“x±s”表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析檢驗，先用Levene檢驗方法對實驗數據進行方差齊性檢驗，方差齊時，采用LSD法進行兩兩比較;方差不齊時，采用Tamhane’ T2法。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?各組一般情況觀察

正常組：大鼠精神狀態正常，對各種刺激反應靈敏，皮膚黏膜紅潤有光澤，全身毛發潤澤，進食、二便正常，飼養過程中體質量逐漸增加。大鼠未出現死亡。

模型組：大鼠精神怠倦，對外界反應遲鈍，皮膚黏膜蒼白，毛發不榮，進食量明顯減少，體質量前期較正常組增長緩慢，中期停止增長，后期有一定下降，有不同程度腹腔積液，少數嚴重腹腔積液，偶有大便不成形。大鼠實驗過程中死亡3只，考慮阿霉素細胞毒性原因。

依那普利組和真武湯組：大鼠精神狀態、刺激反應以及皮毛光澤度較正常組大鼠差，較模型組稍好，皮毛欠光澤，體質量增加減慢，多數大鼠有輕度腹腔積液。兩組大鼠各死亡2只，對死亡大鼠進行解剖，未發現肺部液體殘留，考慮阿霉素細胞毒性原因。

3.2 ?各組大鼠心臟彩超測量結果

與正常組相比，其余各組LVEF、LVFS均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，各治療組LVEF、LVFS均顯著升高（P<0.05）;依那普利組與真武湯組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3.3 ?各組大鼠血清NT-proBNP水平比較

與正常組相比，其余各組血清NT-proBNP水平均有不同程度增高（P<0.05）;與模型組比較，各治療組血清NT-proBNP的水平均上升（P<0.05）;依那普利組與真武湯組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

3.4 ?各組大鼠心肌細胞ERK5、p-ERK5及線粒體自噬關鍵蛋白表達水平比較

各造模組心肌細胞ERK5、p-ERK5表達水平明顯低于正常組，而線粒體自噬關鍵蛋白表達水平明顯高于正常組（P<0.05）;各治療組p-ERK5表達較模型組明顯上升，而線粒體自噬關鍵蛋白表達水平較模型組顯著下降，且差異具有統計學意義（P<0.05）;真武湯組與依那普利組心肌細胞ERK5、p-ERK5及線粒體自噬關鍵蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3-4、圖1。

3.5 ?各組大鼠心肌細胞形態學變化

正常組大鼠心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，間質無充血、無炎細胞浸潤;模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞水腫明顯，橫紋不清晰;依那普利組大鼠心肌纖維稍紊亂，細胞稍水腫，橫紋欠清晰;真武湯組大鼠心肌纖維排列尚整齊，橫紋欠清晰，細胞間隙增寬。見圖 2。

4 討論

CHF患者5年的病死率可達50%，10年病死率超過90%，作為一種復雜的臨床癥狀群，嚴重危害全世界人民的生命健康[13-14]。線粒體自噬與CHF的發生發展息息相關，正常水平的線粒體自噬對心肌細胞具有保護作用，過度的線粒體自噬，可使線粒體消耗增加，導致心肌細胞脫落以及CHF的發生[15]。ERK5能維持正常心血管系統的內皮完整性，拮抗內皮細胞的凋亡，促進血管再生[16]。CHF病理狀態下p-ERK5表達顯著下調，同時伴隨心肌細胞線粒體自噬明顯增強，整體表現為心肌細胞過度丟失而使得CHF加重。臨床觀察[17]和基礎實驗[18]均已證明，在CHF發病過程中，過量活性氧的釋放可激活炎性因子網絡，進而影響p-ERK5表達，加重心肌損傷。ERK5與心肌細胞線粒體自噬均可被相同的外界刺激激活（主要為氧化應激和缺血缺氧）。

CHF在中醫理論中可歸屬于“心悸”“喘證”“心水”范疇，以心悸、氣喘、肢體水腫為主要表現。其根本病機為心氣不足、心陽虧虛，以心氣虛衰為本，水飲內停為標，患者多見素體陽虛，因外邪、情志、過勞而復傷心體，心氣不足，無以行血，血不利而為水，水津循環不暢，停留周身[19]。真武湯出自《傷寒論》，是治療陽虛水泛證的經典方。其組成為：制附子、白術、茯苓、生姜、白芍，共5味中藥，秉承扶陽之要旨。其中，附子具有回陽救逆、補火助陽之功;茯苓淡滲利濕、健脾寧心;白術溫補中焦以絕水之源;生姜走而不守，與附子相伍加強溫陽散寒之力，又助茯苓、白術以溫散水氣;芍藥味酸收斂，制約諸藥之剛燥。全方共奏溫陽利水之功，使陽復陰化，切中病機。

在中醫藥臨床實踐中，真武湯被廣泛用于治療CHF[20-21]。然而CHF發病機制復雜，目前已發現其受到氧化應激、心血管炎癥、血管內皮損傷、RAAS激活、心室重塑、遺傳因素等多種機制的共同作用，中藥具有多靶點、多途徑的特點，真武湯治療CHF的作用機制有待進一步研究。前期研究[22]中，課題組發現溫陽振衰顆粒可通過調控線粒體自噬對CHF具有治療作用。基于此，對同樣具有溫陽化氣作用的真武湯治療CHF的作用機制進行探討。

實驗后，各模型組大鼠 LVEF、LVFS 值明顯降低，血清NT-proBNP水平明顯升高，提示心衰模型復制成功。CHF模型大鼠經真武湯干預后，LVEF、

LVFS顯著升高，血清NT-proBNP水平明顯下降，驗證了真武湯對CHF具有治療作用。與正常組比較，經阿霉素誘導的CHF模型大鼠心肌細胞p-ERK5表達水平顯著下降，而線粒體自噬關鍵蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，經過連續4周的藥物干預，p-ERK5表達水平有了顯著上升，而線粒體自噬關鍵蛋白表達水平明顯下降（P<0.05）。

綜上所述，真武湯能夠提高p-ERK5表達水平，調控心肌細胞線粒體自噬的程度。通過上調ERK5表達，進而抑制線粒體自噬水平，可能是真武湯治療CHF的重要機制之一。

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〔收稿日期〕2021-03-05

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（81173213）;湖南省重點領域研發計劃項目（2019SK2321）;湖南省高等學校“雙一流”建設項目;湖南中醫藥大學校級科研基金項目（ZYYDX201725）。

〔作者簡介〕別明珂，男，在讀博士研究生，研究方向：中醫藥防治心腦血管疾病研究。

〔通信作者〕*陳新宇，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，E-mail：chenxinyuchen@163.com。