基于熱誘導的綠咖啡油氧化過程解析及活性成分變化規律研究

洪啟迪 董文江 梅麗寶 龍宇宙 胡榮鎖 初眾 王海茹

摘 ?要：綠咖啡油是一種富含生物活性成分的功能性油脂，貯藏過程中極易氧化酸敗影響產品品質。本文以海南地區興隆咖啡為原料提取綠咖啡油，系統研究在60 ℃加速貯藏36 d內氧化指標、生物活性成分及表征氧化的光譜特征峰變化。結果表明：過氧化值、茴香胺值、硫代巴比妥酸、總氧化值初始值分別為0.97±0.04 meq/kg、4.19±0.14、55.08± 1.98 nmol/mL、8.05±0.06，經過36 d的氧化分別顯著升高到28.56±0.15 meq/kg、19.19±0.13、102.38±2.18 nmol/mL、133.43± 0.45。本研究中共鑒定出11種脂肪酸，在綠咖啡油氧化過程中，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比值由1.14上升至1.49。利用高效液相色譜測定綠咖啡油中的二萜類物質和生育酚，咖啡豆醇、咖啡醇的初始含量分別為21.01±0.31 mg/g、23.44±0.52 mg/g，在氧化24 d后升高至8.21±0.10 mg/g、8.99±0.02 mg/g，隨后含量趨于穩定。共定性出α、δ和γ-生育酚，總生育酚含量由初始的49.75±0.88 mg/100 g在氧化18 d達到最大值53.70±1.72 mg/100 g，在氧化結束時降至34.58± 0.05 mg/100 g。利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）從特征官能團的角度分析綠咖啡油的氧化過程，油脂在3008、2927、2854、1745、1461、1375、1238、1164、721 cm–1處有特征吸收峰。采用拉曼光譜技術表征綠咖啡油加速貯藏中的氧化變質，在1000～1800 cm–1波段的峰強度有明顯減弱趨勢。本研究表明綠咖啡油在熱誘導下的貯藏過程中發生了明顯的氧化反應，可為提升綠咖啡油貯藏穩定性提供理論參考。

關鍵詞：綠咖啡油;油脂氧化;傅里葉變換紅外光譜;拉曼光譜

中圖分類號：TS221 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Green coffee oil is a kind of functional oil rich in biologically active ingredients， which is easily oxidized and rancid during storage and affects product quality. In this paper， green coffee oil was extracted from Xinglong coffee in Hainan area， and the changes in the oxidation index， biologically active components and spectral characteristic peaks

that characterize oxidation were systematically studied within 36 days of accelerated storage at 60 ℃. The results

showed that the initial values of peroxide value， anisidine value， thiobarbituric acid and total oxidation value was 0.97±0.04 meq/kg， 4.19±0.14， 55.08±1.98 nmol/mL， 8.05±0.06， respectively. After 36 days of oxidation， it significantly increased to 28.56±0.15 meq/kg， 19.19±0.13， 102.38±2.18 nmol/mL， and 133.43±0.45. A total of 11 fatty acids were identified in this study. During the oxidation of green coffee oil， the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids rose from 1.14 to 1.49. High performance liquid chromatography was used to determine diterpenoids and toco-pherol in green coffee oil. The initial content of cafestol and kahweol was 21.01±0.31 mg/g and 23.44±0.52 mg/g， re-spectively， which increased to 8.21±0.10 mg/g and 8.99±0.02 mg/g after 24 days of oxidation， and then the content tended to be stable. This experiment qualified α， δ and γ-tocopherols. The content of total tocopherols increased from the initial 49.75±0.88 mg/100 g to a maximum value of 53.70±1.72 mg/100 g after 18 days of oxidation， and dropped to 34.58±0.05 mg/100 g at the end of oxidation. Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） was used to analyze the oxidation process of green coffee oil from the perspective of characteristic functional groups. The oil had characteristic absorption peaks at 3008， 2927， 2854， 1745， 1461， 1375， 1238， 1164 and 721 cm–1. Raman spectroscopy was used to characterize the oxidative deterioration of green coffee oil during accelerated storage， and the peak intensity in the 1000–1800 cm–1 band had a significant weakening trend. This study showed that the green coffee oil undergone a significant oxidation reaction during the thermally induced storage process， which can provide a theoretical reference for improving the storage stability of green coffee oil.

Keywords： green coffee oil; lipid oxidation; Fourier transform infrared spectroscopy; Raman spectroscopy

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.035

咖啡為世界三大飲料之一，主要生長在熱帶和亞熱帶地區[1]。目前世界范圍內有兩種被商業開發的品種：阿拉比卡咖啡和羅布斯塔咖啡[2]。2020年度世界咖啡產量比前一年增加700萬袋（60 kg），達到1.755億袋。我國咖啡種植主要集中在云南、海南和四川等地，種植面積達12萬 hm2以上，2020年度產量已達到200萬袋。咖啡中含有許多活性物質，咖啡醇和咖啡豆醇是兩種二萜，主要以脂肪酸酯的形式存在于綠咖啡油中，具有抗氧化、消炎和保護肝臟的作用[3]。生育酚是綠咖啡油中的抗氧化活性成分，可作為抗氧化劑抑制多不飽和脂肪酸的氧化，也有消炎作用[4]。

含有脂質的食物在受熱、受光、受氧、受潮或受酶的作用下，可能會酸敗或變形，這可能會導致品質下降，甚至可能產生毒物。咖啡中含有10%～15%的脂質，咖啡油主要由三酰甘油（75%）和脂肪酸（18%）組成，脂肪酸的組成與食用植物油相似[5]。目前關于咖啡油的研究較少，Cong等[6]研究了羅布斯塔咖啡在加速貯藏20 d過程中的脂質氧化過程，評價了常規氧化指標和脂肪酸組成，并預測綠咖啡豆的貨架期。Williamson等[7]利用核磁共振分析（NMR）結合核磁共振成像（MRI）研究烘焙對咖啡油的影響，其中二萜、氧化水解產物和不飽和脂肪酸是最明顯的標志。除咖啡脂質以外，有許多關于其他油脂氧化方面的研究。Tavakoli等[8]研究了杏仁油在加熱過程中的氧化穩定性和化學組成，Wang等[9]研究了芫荽精油調味葵花油在加速貯藏24 d下的氧化穩定性。綠咖啡油是一種具有潛在保健價值的新型油脂資源，具有包括抗氧化和癌癥預防活性在內的生物學特性。由于綠咖啡油中多不飽和脂肪酸的含量較高，容易發生氧化變質，不僅會產生惡臭，而且會因其降解產物而降低營養質量和安全性，對人體健康產生有害影響。因此，了解綠咖啡油氧化過程中的氧化穩定性和活性物質至關重要。目前尚未有關于綠咖啡油氧化過程中質量特性的文獻報道。

在油脂工業中，在常溫下進行油脂儲藏實驗能夠真實反映油脂的氧化穩定性，但是這種方法需要耗費很長時間，實際操作性差。Schaal烘箱法通過將油脂儲存于60 ℃的烘箱進行加速氧化，間隔相同的時間測定過氧化值以實時監測油脂氧化程度[10]。檢測油脂品質除常規分析方法如高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質譜聯用法之外，光譜技術可快速測定油脂品質，其特點是對樣品的前處理少且操作簡單[11]。史潤鴿[12]對不同熱氧化時期的牡丹籽油進行紅外光譜分析，觀察到脂肪酸成分在加熱前后有明顯變化。張勝來[13]分析了藻油、棕櫚仁油和橄欖油氧化過程中的拉曼峰變化情況。

本文采用Schaal烘箱法，將綠咖啡油于60 ℃條件下進行氧化，測定其測定過氧化值（PV）、酸值（AV）、碘值（IV）、茴香胺值（P-AV）、總氧化值（TOTOX）、硫代巴比妥酸（TBARS）、游離脂肪酸（FFA）、共軛二烯（K232）和共軛三烯（K268）和脂肪酸組成。此外，通過高效液相色譜法測定二萜類物質（咖啡醇、咖啡豆醇）和生育酚的含量，利用傅里葉紅外光譜和拉曼光譜對綠咖啡油氧化過程中的分子基團信息進行表征。采用主成分分析和相關性分析方法，以融合后的數據集為輸入變量，對綠咖啡油在氧化過程中的動態分布、差異分析和相關性進行了研究，解析綠咖啡油加速貯藏氧化過程及活性成分動態變化規律，以期為綠咖啡油貯藏穩定性提升及制定阻控氧化策略提供理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?采用海南萬寧地區的中粒種羅布斯塔‘熱研1號’品種的咖啡鮮果，采摘于中國熱帶農業科學院香料飲料研究所咖啡試驗基地，全紅果經低溫熱泵干燥（40 ℃）干燥后，脫殼、篩分得生咖啡豆。石油醚、二氯甲烷、無水乙醇、氫氧化鉀、正己烷、三氟化硼甲醇均為分析純;甲基叔丁基醚、甲醇、正庚烷為色譜純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;丙二醛（MDA）試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 ?儀器與設備 ?R-215旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI有限公司;7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司;1290超高效液相色譜儀，美國Agilent公司;E2695/W2475高效液相色譜儀，美國Waters公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司;顯微共聚焦拉曼光譜儀，英國Renishaw公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?綠咖啡油提取 ?將生咖啡豆用粉碎機粉碎，過40目篩后準確稱量100 g咖啡粉加入500 mL錐形瓶中，加入300 mL石油醚（沸程60～90 ℃），于55 ℃恒溫水浴振蕩器中提取1 h，濾布過濾，收集濾液。重復提取3次，合并濾液，濾紙過濾后使用真空旋轉蒸發儀蒸發溶劑，收集綠咖啡油，并將其轉移至30 mL棕色玻璃瓶中，放置于–80 ℃超低溫冰箱冷藏備用。

1.2.2 ?綠咖啡油加速氧化 ?采用Schaal烘箱加速氧化法，將制備好的綠咖啡油分裝于30 mL棕色玻璃瓶中，每瓶20 g，封口后置于60 ℃恒溫烘箱貯藏，每隔6 d取樣檢測，取至36 d[14]。

1.2.3 ?脂質氧化指標測定 ?（1）參照國家標準測定過氧化值（PV）（GB/T 5009.227—2016）、酸價（AV）（GB 5009.229—2016）、碘值（IV）（GB/T 5532—2008）、茴香胺值（P-AV）（GB/T 24304—2009）。

（2）游離脂肪酸（FFA）含量測定參考Nhouchi等[15]方法略作修改。準確稱取1.00 g的綠咖啡油溶解于20 mL二氯甲烷/乙醇（1∶1，V/V）混合溶液中。滴加2～3滴酚酞作為指示劑，攪拌均勻，用0.1 mol/L氫氧化鉀溶液滴定至溶液呈粉紅色并持續30 s不褪色。游離脂肪酸含量表示為每克綠咖啡油中KOH的含量（mg/g）。

（3）硫代巴比妥酸（TBARS）采用南京建成生物工程研究所生產的丙二醛（MDA）試劑盒測定。硫代巴比妥酸值表示為每毫升綠咖啡油中MDA的含量（nmol/mL）。

（4）總氧化值（TOTOX）由PV及P-AV計算，公式如下：

TOTOX=4PV+P-AV

其中PV為過氧化值，P-AV為對茴香胺值。

（5）共軛二烯（K232）和共軛三烯（K268）按照國家標準（GB/T 22500—2008）測定。

1.2.4 ?脂肪酸組成測定 ?脂肪酸組成參照國家標準（GB/T 5009.168—2016）進行分析。準確稱量1.00 g綠咖啡油進行脂肪皂化和脂肪酸甲酯化。利用安捷倫7890A-5975C氣質聯用儀，配有CP-Sil 88色譜柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm）。升溫程序：初始溫度10 ℃保持13 min，以10 ℃/min增加到180 ℃保持6 min，以1 ℃/min增加到200 ℃保持20 min，然后以4 ℃/min增加到230 ℃保持10.5 min。接口溫度和離子源溫度均為250 ℃。氦氣為載氣，流量1 mL/min，進樣量2 μL。

1.2.5 ?二萜類物質（咖啡醇、咖啡豆醇）測定 ?參考Chartier等[16]方法并稍作修改。稱取0.1 g綠咖啡油，加入2 mL 2.5 mol/L氫氧化鉀的甲醇溶液，80 ℃水浴1 h進行皂化反應，冷卻后加入2 mL去離子水和2 mL甲基叔丁基醚提取不皂化物，混勻并收集上清液，重復提取3次，合并上清液。旋轉蒸發濃縮后，加入5 mL正己烷溶解，過0.22 μm濾膜后，采用UPLC-DAD檢測。使用安捷倫1290超高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Zorbax Eclispe Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），流動相為甲醇和水，85%甲醇等梯度洗脫10 min，后運行時間6 min。柱溫25 ℃，流速0.7 mL/min，進樣量10 μL，DAD檢測波長210 nm。將咖啡醇、咖啡豆醇標準品用正己烷配制成100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL標準品溶液，采用UPLC檢測，以標準液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，含量以mg/g表示。

1.2.6 ?生育酚（α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚）測定 ?參照國家標準方法（GB/T 26635—2011）對綠咖啡油中生育酚含量進行分析。將0.5 g綠咖啡油溶解在2 mL正己烷中，過0.22 μm有機濾膜。使用沃特世E2695/W2475高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Zorbax Eclispe Plus C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相為甲醇和水，體積比98∶2，流速為1 mL/min。采用UPLC-FLD檢測，激發波長（λex）為295 nm，發射波長（λem）為325 nm。將α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品用甲醇配制成100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL標準品溶液，以標準液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，通過標準品溶液的保留時間及標準曲線來對生育酚進行定性和定量，含量以mg/100 g表示。

1.2.7 ?傅里葉變換紅外光譜分析 ?使用傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo Fisher，美國）監測分析綠咖啡油氧化過程中譜峰的變化趨勢。將干燥后的光譜純溴化鉀充分研磨后用壓片機壓成透明薄片，掃描后作為背景。用移液槍準確移取0.5 μL綠咖啡油滴在溴化鉀壓片上，待形成一層均勻液膜后進行掃描，測定掃描范圍為4000～400 cm–1，掃描次數為32次，分辨率為1 cm–1。利用OMNIC軟件對光譜進行平滑和基線校正處理，光譜數據輸出格式為吸光度。

1.2.8 ?拉曼光譜分析 ?拉曼光譜作為新興的檢測油脂氧化的分析手段有操作簡便、靈敏度高、樣品用量少的優點，使用拉曼光譜對綠咖啡油氧化過程中分子結構變化進行監測。參考林新月等[17]方法并稍作修改，顯微共聚焦拉曼光譜儀（Renishaw，英國）選用785 nm的激光光源，物鏡使用5倍焦距鏡頭，準確移取10 μL綠咖啡油滴在用錫箔紙包裹的載玻片上，將其置于顯微共聚焦拉曼光譜儀載物臺的物鏡視野下并找到合適的位置，調整焦距至清晰可見，設置掃描參數為光柵600 mm–1，積分時間為15 s，掃描次數為1次，掃描范圍設為200～3300 cm–1，掃描后對拉曼譜峰進行基線扣除。

1.3 ?數據處理

采用Microsoft Excel 2019軟件進行數據的整理與計算;在SPSS 22.0軟件上采用Ducan’s法進行一元方差方差分析（ANOVA）;使用Origin 2021軟件進行Pearson相關性分析及主成分分析（PCA）。實驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示。

2 ?結果與分析

2.1 ?綠咖啡油氧化指標分析

2.1.1 ?不同氧化時間對過氧化值、酸價、游離脂肪酸的影響 ?過氧化值（PV）用于通過測量油氧化降解形成的初級氧化產物（過氧化物）來確定油的質量，決定了油的穩定性。PV是綠咖啡油氧化酸敗的重要指標，反映了初級水平的脂質氧化程度。如圖1A所示，樣品的PV隨氧化時間的延長幾乎呈指數型增長。綠咖啡油的初始PV為0.97±0.04 meq/kg，經過36 d的氧化，PV增加到28.56±0.15 meq/kg。在氧化過程中，咖啡油樣品的PV越高，說明其氧化酸敗程度越高。初始階段PV增加可能是由于自由基對不飽和脂肪酸的影響和過氧化物的形成，由于過氧化物性質不穩定，會分解成二次氧化產物（醛、酮等）[18]。

酸價（AV）可作為油脂質量劣變的指標，其決定了甘油三酯水解產生的游離脂肪酸的數量。在光、熱或脂肪酶的作用下，脂質分子釋放出游離脂肪酸，這會影響油脂的穩定性。綠咖啡油在氧化過程中AV變化如圖1B所示，AV隨時間延長呈上升趨勢，從1.75±0.08 mg/g（0 d）增加到2.64± 0.06 mg/g（36 d），6 d到12 d與18 d到24 d的AV無顯著差異，在氧化后期，樣品AV變化速率較前期更快，說明油脂水解酸敗程度更高。在食用植物油國家標準中，植物原油的AV須低于4 mg/g。

游離脂肪酸（FFA）被用于測定油脂中甘油三酯水解情況。當甘油三酯分解，游離脂肪酸濃度增加時，促進了油脂的氧化過程，從而縮短了油脂的儲存期。如圖1C所示，游離脂肪酸初始含量為1.47±0.08 mg/g。所有樣品的游離脂肪酸含量在氧化36 d內均有增加，在氧化的中期12 d到24 d之間無顯著變化，氧化終點的FFA為2.28±0.05 mg/g，說明綠咖啡油在氧化的過程中發生了水解。氧化過程中FFA的形成影響了油的AV，因此，AV和FFA含量呈極顯著正相關。

2.1.2 ?不同氧化時間對茴香胺值、硫代巴比妥酸值、碘值的影響 ?茴香胺值（P-AV）能評估油脂次級氧化，醛羰基鍵在脂質次級氧化過程中形成。在本研究中，如圖2A所示。氧化初期P-AV為4.19±0.14，加速氧化6 d后，P-AV降到2.83±0.20，原因是在氧化初期并沒有發生次級氧化反應，在隨后氧化的30 d升高到19.19±0.13，說明綠咖啡油的氧化程度隨時間的延長而升高，產生較多的醛酮類物質導致P-AV上升。

硫代巴比妥酸（TBARS）主要用于評估氧化的次級產物（如醛和酮）的形成，這些產物主要來源于多不飽和脂肪酸的降解。過氧化脂質降解產物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸縮合，因而測試MDA的量可以反應油脂過氧化程度。食品中TBARS越高，代表食品越不新鮮。如圖2B所示，在氧化初期，TBARS為55.08±10.98 nmol/mL，

氧化中期即12～30 d，TBARS升高較為平緩，由77.62±1.26 nmol/mL升高至85.87±1.20 nmol/mL。油樣在氧化末期快速升高到102.38±2.18 nmol/mL，表明在氧化末期，綠咖啡油產生的醛類物質較多，次級氧化反應加快。

碘值（IV）可用于測定脂肪酸的不飽和程度，樣品中IV與不飽和雙鍵呈正相關，IV越高，不飽和脂肪酸含量越高。圖2C所示，在氧化的36 d內，碘值呈線性趨勢降低，由73.67±0.55 g/g逐漸下降至55.51±0.58 g/g。這種下降主要是由于脂肪氧化引起脂肪酸雙鍵破壞，不飽和雙鍵減少，不飽和脂肪酸含量降低。也有其他學者通過IV來反映油脂氧化程度，夏義苗等[19]在葵花籽油品質的研究中，在180 ℃加熱條件下，24 h內隨時間的延長，碘值迅速降低，氧化程度升高，不飽和鍵快速減少。

2.1.3 ?不同氧化時間對總氧化值的影響 ?總氧化值（TOTOX）由茴香胺值和過氧化值計算得來，它綜合了初級和次級氧化程度的信息，能評估油脂的總體氧化狀態。圖3所示為TOTOX值的變化趨勢，與過氧化值的變化趨勢相似，即綠咖啡油的TOTOX值在氧化期間呈指數型升高。TOTOX初始值為8.05±0.06，0～6 d油樣無顯著變化，在24～30 d的TOTOX升高速率最快，經過36 d的加速氧化，TOTOX增加到133.43±0.48。這些結果表明，氧化過程促進了初級和次級氧化產物的生成，從而降低綠咖啡油的氧化穩定性。TOTOX結合了初級化產物（氫過氧化物）與次級氧化產物（不飽和醛類）的指標，更能全面的評價油脂氧化劣變程度。

2.1.4 ?不同氧化時間對共軛二烯、三烯的影響 ?共軛二烯（K232）是在油脂發生氧化反應時由多不飽和脂質產生的十八碳二烯氫過氧化物，通過在波長為232 nm處的最大吸收峰進行定量測定。在波長268 nm處的吸光度能夠反映綠咖啡油氧化過程中次級氧化產物共軛三烯（K268）的多少[20]。從圖4A可以看出，K232值在0～12 d中無明顯變化，在12 d后開始升高，在36 d達到最大值。加速氧化對K268值的影響如圖4B所示，在36 d的氧化過程中，K268值在6 d時由0.26降低到0.22，最終增加到0.29，此現象能與茴香胺值在氧化6 d后降低相對應，表明在氧化初期并沒有生成次級氧化產物，在氧化后期次級氧化產物增加。

2.2 ?脂肪酸組成變化

如表1所示，本研究中共鑒定出11種脂肪酸：十五烷酸（C15∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、十七烷酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）、α-亞麻酸（C18∶3）、花生酸（C20∶0）、二十烷酸（C20∶1）、二十碳二烯酸（C20∶2）和二十一烷酸（C21∶0）。

如圖5A，樣品主要的脂肪酸為棕櫚酸（29.42%～26.64%）、硬脂酸（15.12%～20.65%）、油酸（10.53%～12.88%）和亞油酸（33.86%～ 26.40%），這是與本課題組前期研究結果一致[21]。在咖啡油氧化過程中，飽和脂肪酸（SFA）含量由53.30%上升至59.89%，不飽和脂肪酸（UFA）由46.70%降至40.11%（圖5B），導致SFA/UFA由1.14上升至1.49，這種現象是由于UFA水解和氧化產生的影響，與前文碘值下降的結果相印證。本研究中，油脂氧化過程中多不飽和脂肪酸（PUFA）含量存在顯著差異，在氧化過程中有明顯的下降。這可能是因為PUFA在氧化過程中不穩定，受溫度及時間影響而發生裂變、聚合等反應而氧化生成單不飽和脂肪酸（MUFA）和SFA，從而導致綠咖啡油中MUFA和SFA的含量隨氧化時間的延長而不斷增加。MUFA是最穩定的不飽和脂肪酸，MUFA與SFA的比率與健康特性相關，這是因為MUFA（主要是油酸）能夠降低血液中有害膽固醇（LDL）的水平，提高人體中的高密度脂蛋白（HDL）水平[8]。

2.3 ?二萜及生育酚含量分析

關于咖啡醇和咖啡豆醇的研究表明，咖啡醇和咖啡豆醇具有抗氧化、消炎和保護肝臟的作用，它們是咖啡脂質組分物質中特有的二萜類物質，對健康有積極的作用[22]，其含量如表2所示。咖啡豆醇與咖啡醇在氧化過程中均有上升的趨勢。咖啡豆醇含量由氧化初期的21.01±0.31 mg/g在氧化24 d時升高到23.44±0.52 mg/g，在之后的氧化過程中無顯著變化，油樣在30 d、36 d的咖啡豆醇含量分別為23.78±0.27 mg/g、23.69±0.19 mg/g。咖啡醇的變化趨勢與咖啡豆醇相同，含量由8.21±0.10 mg/g（0 d）升高到8.99±0.02 mg/g（24 d）后趨于穩定。

生育酚是植物油中一種重要的天然抗氧化劑，它不僅能阻斷自由基的產生，還能抑制單線態氧的產生，對植物油多不飽和脂肪酸氧化變質具有保護作用[23]。本研究共定性出3種生育酚，分別為α、δ和γ-生育酚。3種生育酚的抗氧化能力為：α-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚。本研究中γ-生育酚是綠咖啡油中的主要生育酚，占咖啡油生育酚總量的64.08%～76.34%，含量在26.40± 0.37 mg/100 g～33.19±0.47 mg/100 g，其次為α-生育酚、γ-生育酚。3種生育酚含量在氧化過程中均呈現出先上升后下降的變化趨勢，均在氧化18 d時達到最大值，因此在氧化后期，由于生育酚含量的減少，綠咖啡油的抗氧化能力隨之減弱。

2.4 ?傅里葉紅外光譜分析

綠咖啡油在波段為4000～400 cm–1范圍內紅外光譜圖如圖6A所示，從圖中可看出，油脂的光譜在波段3008、2927、2854、1745、1461、1375、1238、1164和721 cm–1處有吸收峰，這些譜峰與油脂化學結構中存在的官能團有關，揭示了組分的特征[24]。不同氧化時間下的譜峰的強度存在變化，這些變化是由于綠咖啡油氧化過程中生成了氫過氧化物、醛、酮、游離脂肪酸等氧化產物，因此，可采用紅外光譜從特征官能團的角度分析綠咖啡油的氧化過程。

波段721 cm–1處是順式取代烯烴的CH2伸縮振動與平面外振動的重疊峰，如圖6B所示，峰強度隨時間的延長而降低，表明氧化過程中，油脂分子鏈斷裂，分子量變小。1164 cm–1處為酯基團（-C-O）伸縮振動，在氧化過程中吸收峰變窄，1461 cm–1處為亞甲基（-CH2）彎曲振動，峰強隨時間增長有輕微下降（圖6C）。1746 cm–1為甘油三酯羰基（-C=O）伸縮振動峰，此處的吸收峰最強，此峰峰強隨著氧化時間的延長而增加，這是由于油脂氧化過程中生成醛、酮、酸等物質使官能團增加而引起的（圖6D）。2854 cm–1處為甲基（-CH3）對稱伸縮振動，2927 cm–1處為亞甲基（-CH2）不對稱伸縮振動，兩者在氧化過程中吸收峰強度增強（圖6E）。3008 cm–1處為油脂烯烴不飽和C原子上C-H伸縮振動，吸收峰在氧化過程中下降，此處吸收峰強度與油脂不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）含量相關，說明不飽和脂肪酸含量下降。通過紅外光譜分析綠咖啡油在氧化過程中譜圖的變化，能說明特征官能團吸收峰每一個微小的變化都反映了油脂內部的改變。

2.5 ?拉曼光譜分析

利用拉曼光譜可以監測脂質氧化過程中分子結構變化。圖7所示為綠咖啡油氧化過程中的拉曼光譜圖，從圖中可看出各峰所代表的組分分子基團結構信息。油脂中的每一種分子基團都能跟某種具有拉曼活性的振動方式相匹配，從而相應地在拉曼光譜中形成一個特征峰，并且該特征峰的強度隨著該分子基團濃度的增加或降低而增強或減弱，即兩者成正比關系。由圖7A可知，綠咖啡油氧化過程中，拉曼光譜的變化大多數集中在1000～1800 cm–1和2800～3050 cm–1區域，特別是1000～1800 cm–1區域。在1082、1265、1442、1658、1745、2850 cm?1區域觀察到拉曼強度的變化。在整個氧化過程中，咖啡油的拉曼光譜強度均呈減弱趨勢，說明基團發生了變化。1082 cm–1處的峰強與不飽和度呈正相關，此處峰強降低代表了脂肪酸不飽和程度降低（表3）。1265 cm–1和1658 cm–1處峰強減弱，是由于在油脂氧化的過程中，隨著氧化程度的加深，順式雙鍵發生異構化并重排成為穩定的反式雙鍵構型的趨勢越來越強烈，即在反式結構成分持續增多的同時，順式結構普遍減少[17]。

標準正態變量變換（SNV）主要是用以消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對光譜的影響。一階導數可消除光譜中基線的平移和漂移，可有效消除其他背景的干擾，分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度[25]。圖7B是將原光譜圖進行SNV和一階導數預處理后的結果，能清晰觀察到1000～1800 cm–1和2800～3050 cm–1區域拉曼強度隨氧化時間的增長而減弱。

2.6 ?主成分分析

主成分分析（PCA）是一種把多個指標轉化為少數幾個綜合指標的分析方法，目的是簡化數據和揭示變量之間的關系[26]。用PCA分析了綠咖啡油各氧化指標、活性物質、脂肪酸與氧化時間的關系。如圖8所示，第一主成分（PC1）貢獻率為87.1%，第二主成分（PC2）貢獻率為7.2%，累計貢獻率為94.3%，表明前兩個主成分可解析原始變量94.3%的信息。圖8A顯示了樣品的二維得分投影圖（PC1-PC2），根據樣品特征對不同氧化時間的樣品進行分類。顯然，不同氧化時間下的綠咖啡油在得分圖的四個象限很容易區分，氧化中期（18 d～24 d）的綠咖啡油樣品有輕微重疊。每個主成分都是原始變量的線性組合，線性組合中各變量對主成分的影響用載荷表示，載荷絕對值越大，其影響越大，各指標的載荷如圖8B所示。PC1中，酸價、過氧化值、總氧化值的載荷絕對值最大，均為0.28，說明這三個指標對PC1起決定性作用。PC2中，咖啡醇與K268的載荷絕對值最大，分別為0.44、0.43，表明這兩個指標是PC2的代表指標。氧化0 d的綠咖啡油與其他樣品區分開的主要影響指標是不飽和脂肪酸和碘值。PCA結果表明，各氧化時間下的綠咖啡油可根據不同指標進行聚類。此外，部分樣品氧化時間的分組較為緊密，這可能是二萜類和生育酚指標相似的結果。

2.7 ?相關性分析

為進一步探究綠咖啡油氧化過程中各指標間相關性，對其進行了Pearson相關性分析，如圖9所示為綠咖啡油不同氧化階段各氧化指標、生育酚、二萜、脂肪酸之間的關系。上三角區紅色橢圓表示二者呈正相關，藍色橢圓表示二者呈負相關，橢圓越扁顏色越深表明相關性越大，無星號標記表明二者無相關性;下三角區則標明了相關系數。過氧化值與酸價、游離脂肪酸、茴香胺值、總氧化值、共軛二烯、飽和脂肪酸呈極顯著正相關（P<0.01），這些指標都隨氧化時間的增長而升高;過氧化值與碘值、總生育酚、不飽和脂肪酸呈極顯著負相關。咖啡醇、咖啡豆醇與多個指標無相關性，表明脂質氧化對綠咖啡油中二萜類成分影響不大。由此可進一步說明在綠咖啡油氧化過程中，其品質變化與脂質氧化降解密切相關，各指標的變化有明顯的對應關系。

3 ?討論

油脂氧化的途徑有自動氧化、光敏氧化和酶促氧化。綠咖啡油貯藏過程中主要發生自動氧化，油脂氧化過度會導致感官分值降低、風味劣化、營養價值流失等一系列損害。不少學者通過熱誘導加速氧化法對油脂進行氧化處理，Li等[27]描述了加速氧化對大豆油顏色變化的影響，討論了返色與氧化之間的定量關系。Rotich等[28]對4種意大利特級初榨橄欖油的熱氧化穩定性進行了研究。

綠咖啡油中共檢測出11種脂肪酸，隨著油脂氧化，SFA和MUFA含量升高，SFA與USFA比值增大，這是由于PUFA在氧化過程中發生了裂變與降解。碘值降低、傅里葉紅外光譜中3008 cm–1處吸收峰強度降低和拉曼光譜中1082 cm–1處的峰強降低同時表征了USFA在氧化過程中含量減少的信息。此結果與Cui等[29]研究冷榨榛子油在加速氧化40 d過程中氧化特性、脂肪酸及主要生物活性物質的變化規律一致。

綠咖啡有中含有豐富的活性物質，本研究中測定的生育酚是常見的天然抗氧化劑，且存在多種構型。3種生育酚在加速氧化18 d后均呈下降趨勢，且α-生育酚減少59.11%，消耗最多且最快，其原因是α-生育酚生理活性在生育酚同系物中最強，更容易氧化降解。盡管綠咖啡油中存在一定的抗氧化物質，但僅能減緩而不能阻止油脂在熱誘導下的加速氧化，因此，不少學者通過添加抗氧化劑來增強油脂的抗氧化能力。Martin-Rubio等[30]研究了添加質量分數為0.002%～5%的α-生育酚對大豆油氧化穩定性的影響。Zhao等[31]研究了米糠油熱氧化過程中谷維素和生育酚最佳配比的添加及其與米糠油理化指標的關系，說明天然抗氧化劑對油脂的穩定性和營養特性十分重要。

4 ?結論

（1）熱處理會促進綠咖啡油的氧化，氧化程度越高，綠咖啡油品質越差。

（2）綠咖啡油中的活性物質咖啡豆醇、咖啡醇含量在氧化過程中均有上升，生育酚含量均呈先上升后下降的趨勢。

（3）綠咖啡油的紅外光譜分析結果表明氧化過程中的分子基團發生了變化，拉曼光譜譜圖中代表不飽和脂肪酸的基團峰強下降明顯。

（4）本研究為評判綠咖啡油加速氧化過程匯總品質變化提供了多個典型理化指標信息，不僅為利用綜合指標來評判油脂品質提供了有益思路，亦為綠咖啡油貯藏穩定性提升及制定阻控策略提供了參考。

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責任編輯：崔麗虹