冬蟲夏草治療腎精虧虛證網絡藥理學研究

范衛鋒，王秋燕，李皓翔，鄒園生，梅全喜，錢正明*

(1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510011；2.宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司，湖北 宜昌443300；3.深圳市寶安純中醫治療醫院，廣東 深圳 518102)

冬蟲夏草是我國傳統名貴中藥，已有一千多年的藥用歷史，為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(BerK.) Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體，具有補腎益肺、止血化痰的功效，臨床上用于腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘、勞嗽咯血等[1]。中醫學認為“腎精”是生命的本原性物質，貫穿人體生長、發育、壯實、生殖、衰老、死亡各個階段，能養骨、充髓、健腦、化血、生氣，生成生殖之精和御邪抗病的正氣[2]?，F代醫學研究發現腎精與免疫、遺傳、神經、內分泌、生殖、造血等有關[3，4]，腎精虧虛易導致免疫功能下降、兒童發育不良、骨質酥松、不孕不育、老年病等[5]。冬蟲夏草具有補腎益精的功效，臨床上運用冬蟲夏草治療少精不育癥，提高精子質量，減緩慢性腎功能衰竭進程[6，7]，但其補腎的物質基礎及其作用機制尚不清楚。本研究通過網絡藥理學分析冬蟲夏草治療腎精虧虛證的成分和作用機制，以期進一步為臨床上應用提供生物學依據。

1 材料與方法

1.1 冬蟲夏草主要活性化合物的篩選

本研究依托TCMSP、CNKI、PuBmed檢索冬蟲夏草的主要活性化合物，以口服吸收利用度(OB)≥30%，藥物類藥性(DL)≥0.18為指標篩選，篩選后得到冬蟲夏草的有效成分。

1.2 冬蟲夏草預防腎精虧虛靶點的收集和預測

利用TCMSP、Drugbank、Stitch、Swiss target prediction查詢冬蟲夏草的靶點信息；檢索GeneCard、OMIM數據庫，以“kidney essence deficiency”為關鍵詞，選擇物種為Homo sapiens，檢索與腎精虧虛相關的基因；通過R軟件包對冬蟲夏草活性成分作用的靶點和腎精虧虛靶點取交集并繪制韋恩圖，獲得共同靶點基因。

1.3 冬蟲夏草活性成分-靶點網絡的建立

用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，建立冬蟲夏草活性成分-靶點網絡圖。

1.4 冬蟲夏草PPI 網絡圖和頻次分布圖的構建

將篩選出的共同靶點基因導入String數據庫，將蛋白種類定義為Homo sapiens進行篩選，最低要求交互分數設置為中等(0.4)，獲得蛋白互作網絡圖(PPI)，并使用R 3.6.2軟件包統計共同靶點在網絡中的相互作用的頻次，并繪制條形圖展示前19位關鍵靶點。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

采用R 3.6.2的org.Hs.eg.db程序包將藥物與基因的交集靶點名轉換成基因名，并使用R 3.6.2的colorspace、stringi、ggplot2等程序包進行可視化處理，對GO功能和KEGG通路富集分析，得到冬蟲夏草作用的生物學功能和潛在作用腎精虧虛通路信號，繪制氣泡圖。

2 結果

2.1 冬蟲夏草活性成分的篩選

通過分析檢索TCMSP數據庫與文獻[8-9]中冬蟲夏草成分，共收集到347個冬蟲夏草化合物，根據篩選條件OB≥30%和DL≥0.18進行篩選，得到可供進一步分析的有效成分22個。

2.2 冬蟲夏草抗腎精虧虛靶點

根據GeneCards和OMIM數據庫檢索腎精虧虛的相關基因，共有438個靶點。檢索TCMSP、Drugbank、Stitch、Swiss target prediction等數據庫得到冬蟲夏草22個活性成分相關靶點103個，運用韋恩圖R軟件包做冬蟲夏草活性成分調控的靶點基因與腎精虧虛的靶點基因交集，得到19個共同靶點，見圖1；冬蟲夏草有13個活性成分參與抗腎精虧虛，見表1。

圖1 冬蟲夏草與腎精虧虛靶點的韋恩圖

表1 冬蟲夏草活性成分和靶點相關信息

2.3 冬蟲夏草活性成分-靶點網絡

采用Cytoscape 3.7.2軟件建立冬蟲夏草防治腎精虧虛證的化合物-靶點網絡模型，構建成完整的網絡圖，紅色“三角形”代表分子，綠色“四邊形”代表靶蛋白，“邊”代表冬蟲夏草活性成分與腎精虧虛靶點相互作用關系。通過網絡分析，冬蟲夏草有13個活性成分，與腎精虧虛證的19個相關靶點、30條網絡關系參與治療腎精虧虛證，黃豆黃素、花生四烯酸、膽甾醇、11，14-二十碳二烯酸可能為冬蟲夏草抗腎精虧虛的核心成分，PTGS2、CNR1、PPARA、SLC6A2為治療腎精虧虛的重要靶點。從網絡圖中可以看出黃豆黃素可以調控SP1、NOS1、NOS2、NOS3、MMP3、PTGS2靶點，酒渣堿、川芎哚、黃豆黃素、花生四烯酸等8個活性成分同時調控PTGS2靶點，這表明冬蟲夏草多成分、多靶點共同作用腎精虧虛。

圖2 冬蟲夏草活性成分-共同靶點網絡關系

2.4 冬蟲夏草PPI網絡和頻次分布圖

將上述19個交集靶點導入String數據庫進行PPI網絡分析，構建共同靶點的PPI網絡。PPI網絡圖(圖3a)包含19個節點，48條邊，靶蛋白平均節點度值為5.05。蛋白與蛋白之間線條表示靶點之間相互作用關系，線條越多表示關聯度越大，處于較核心位置，如PTGS2、NOS3、CASP3和PPARA等。對全部靶點蛋白(19個)進行統計并繪制條形圖(圖3b)。

注：a.PPI網絡圖；b.前19個靶點的頻次圖。圖3 冬蟲夏草與腎精虧虛共同靶點PPI圖和頻次分布

2.5 GO和KEGG通路富集分析

在GO功能分析結果中，在P<0.05基礎上對前20功能特征的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組分(CC)進行分析。GO分析結果顯示，生物過程(BP)主要涉及小分子代謝調節、血壓調節、有機羥基化合物轉運等；羧酸結合、有機酸結合、血紅素結合和四吡咯結合等分子功能(MF)；細胞組分(CC)涉及膜筏、膜微區、膜區和高密度脂蛋白顆粒等，詳見圖4。

注：a：生物過程；b：分子功能；c：細胞組分。圖4 冬蟲夏草治療腎精虧虛靶點的GO富集圖

KEGG分析共得到12條信號通路，主要涉及到鈣信號通路、精氨酸生物合成信號通路、膽固醇代謝信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路等，將上述信號通路利用R 語言軟件進行數據可視化處理得到氣泡圖(圖5)，其中氣泡的顏色越紅，富集越顯著；氣泡大小表示通路相關聯的基因數量，氣泡越大表明富集的基因越多。

圖5 冬蟲夏草抗腎精虧虛靶點的KEGG富集圖

3 結論

腎精虧虛證是指腎精虧損、髓海空虛所致的發育遲緩、未老先衰、成人生殖機能減退、肢體痿弱不用、耳鳴、癡呆等臨床表現的總稱[10-12]。中醫采用補腎益精方治療腎精虧虛證取得了良好效果[5]，冬蟲夏草歸肺、腎經，具有明顯的補腎益精作用。

本研究通過對冬蟲夏草有效成分-靶點網絡關系的挖掘，發現冬蟲夏草的黃豆黃素、花生四烯酸、膽甾醇、11，14-二十碳二烯酸為核心有效成分，可能在治療腎精虧虛證中起著重要作用。黃豆黃素有一定的促成骨細胞增殖活性，在低濃度時呈現正相關趨勢，隨著濃度的增加，細胞增殖明顯，但在1×10-5mol·L-1時抑制骨細胞增殖，使骨細胞皺縮、死亡[13]?；ㄉ南┧嵘险{C-Fos和Egr-1的表達，能誘發細胞的生長，促進生長發育，常常作為食品營養強化劑添加在嬰幼食品中[14]。錢正明等[15]研究發現冬蟲夏草的蟲體、子座均有膽甾醇，其含量在蟲體中較高高，其均值為1.78 mg/g，子座中膽甾醇含量較低，其均值為0.61 mg/g。膽甾醇是動物組織(特別在大腦和脊髓組織)的重要物質，參與細胞膜構成、激素合成的生理作用[16]。11，14-二十碳二烯酸降低LPS誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞中NO產生，增加PEG2和TNF-α的產生，改變巨噬細胞對炎癥刺激的反應[17]。鈣信號通路在細胞存活、增殖、代謝中有著重要作用，Ca2+進入細胞內，激活各種Ca2+依賴性酶，形成Ca2+-CaM，通過活化、磷酸化，激活鈣信號通路，張玉琴等[18]研究栝樓桂枝顆粒通過對鈣信號通路中促進CREB、CaMKII 的磷酸化，抑制CaM 的表達，對N-甲基-D-天冬氨酸誘導的神經元興奮性毒性損傷具有保護作用。CUI等[19]在鵪鶉體內絨毛尿囊膜實驗和多種內皮細胞體外模型試驗中，發現四氫巴馬汀通過調節精氨酸生物合成通路的促血管生成。WEN等[20]從膽固醇代謝通路的角度闡明尼古丁暴露雌性產前小鼠可導致調節性T細胞衰退，調節性T細胞的衰退誘導自身免疫性疾病。PATIN等[21]發現精氨酸和脯氨酸代謝通路在肌萎縮性側索硬化癥演化過程中起中心作用，與該通路相關的基因肌酸激酶、脯氨酸-4-羥化酶或亞精胺合成酶失調有關。文獻研究表明冬蟲夏草能補腎陽虛，可顯著逆轉氫化可的松所致小鼠腎陽虛的活性，升高T-SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC 的水平，改善小鼠運動能力、性腺器官萎縮、減輕腎臟病理變化[22]。

本研究通過文獻研究共檢索到347個冬蟲夏草成分，其中包含核苷類、氨基酸類、肽類、鞘酯類等，這些化合物都具有較強的生物活性，蟲草核苷類提取物能抑制明顯改善糖尿病腎病小鼠的腎功能，抑制P38和ERK信號通路的活化[23]，氨基酸可以減緩順鉑治療肺癌患者腎毒性和作為急性腎衰竭患者進行連續性腎臟替代治療時的補充劑[24，25]，蟲草多肽預防由四氧嘧啶誘導的糖尿病性骨質疏松癥小鼠的骨質減少，增強骨密度和骨礦含量[26]。但由于OB≥30%和DL≥0.18的篩選條件限制，核苷類、氨基酸類、肽類、鞘酯類等化合物被排除在外。根據文獻報道冬蟲夏草含有大量的多糖、蛋白類成分，冬蟲夏草含有粗蛋白約30%，總糖類約13%[27]，從冬蟲夏草中純化出4.39×104Da的半乳糖甘露聚糖能降低SD大鼠的血清尿素氮和肌酐水平，明顯減輕大鼠腎臟細胞病變癥狀[28-29]；冬蟲夏草蛋白能上調Bax誘導凋亡，抑制A549細胞增殖，促進巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1、IL-12，激活免疫反應抑制A549細胞增殖[30]。由于冬蟲夏草的多糖和蛋白等大分子化合物分子結構復雜，難以準確發現其治療疾病的靶點，暫未被TCMSP數據庫收錄。建議未來加強冬蟲夏草大分子成分的補腎精虧虛的作用研究，完善冬蟲夏草腎精虧虛證的藥效物質基礎研究。

本研究運用網絡藥理學探討冬蟲夏草治療腎精虧虛證的有效活性成分、靶點和通路，為后續進一步試驗等提供了理論支持。但還有更多冬蟲夏草的活性成分、靶點和通路有待發現，本研究也難以全面解釋其治療腎精虧虛證的作用機制，需要在以后的研究中，針對某一通路和靶點驗證冬蟲夏草可治療腎精虧虛證。