核苷(酸)類似物經治的慢性乙型肝炎患者低病毒血癥的研究現狀

魯鳳民，封 波，鄭素軍，蔣素貞，楊瑞鋒，福軍亮，紀 冬，黨雙鎖，魯曉擘，陳紅松，陳新月，任 紅，高志良，南月敏，徐小元，牛俊奇，張文宏，莊 輝

1 北京大學 基礎醫學院 病原生物學系暨感染病中心，北京 100191; 2 北京大學人民醫院, 北京大學肝病研究所，北京 100044; 3 首都醫科大學附屬北京佑安醫院 肝病中心一科，北京 100069; 4 解放軍總醫院第五醫學中心 肝纖維診療中心，北京 100039; 5 西安交通大學第二附屬醫院 感染科，西安 710004； 6 新疆醫科大學第一附屬醫院 感染科·肝病中心 烏魯木齊 830054； 7 重慶醫科大學 病毒性肝炎研究所，重慶 400060； 8 中山大學附屬第三醫院 感染性疾病科，廣州 510630; 9 河北醫科大學第三醫院 中西醫結合肝病科，石家莊 050051; 10 北京大學第一醫院 感染疾病中心，北京 100034； 11 吉林大學第一醫院 肝膽胰內科，長春 130021; 12 復旦大學附屬華山醫院 感染科，上海 200040

HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)、肝纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)的重要病因。全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年死于HBV感染相關肝硬化、肝衰竭和HCC的患者高達88.7萬人[1]。我國現存慢性HBV感染者仍超過7000萬人，其中CHB患者高達2000～3000萬例，嚴重危害國人健康[2]。

目前臨床抗HBV治療藥物有核苷(酸)類似物(NAs)和聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)。由于這兩類藥物均不能直接清除肝細胞核內的共價閉合環狀DNA(cccDNA)，HBV感染難以徹底“治愈”。因此，國內外主要指南均以最大限度地長期抑制HBV復制，減輕肝細胞炎癥壞死及肝纖維化，降低肝硬化和肝癌風險，從而改善生活質量和延長生存時間作為CHB抗病毒治療的目標[2]。由于NAs抑制HBV DNA復制作用強、副作用小和給藥方便等原因，臨床應用更為廣泛，其中恩替卡韋(ETV)、富馬酸替諾福韋酯(TDF)和富馬酸丙酚替諾福韋(TAF)具有強效抑制病毒和低耐藥等優勢，被推薦為一線NAs。

近年來，在長期接受規范的NAs治療患者中，即使應用ETV、TDF或TAF一線藥物，部分患者的血清HBV DNA仍持續或間歇性地低水平檢出陽性，即存在低病毒血癥(low-level viremia，LLV)問題。由于LLV可能促進肝纖維化進展、顯著增加肝硬化患者HCC風險，針對LLV的研究已成為目前抗病毒治療的熱點和難點問題。本文將就LLV的定義、流行病學、對臨床結局的影響、發生機制及管理策略等方面的研究現狀和進展綜述如下。

1 LLV的定義

亞太肝病學會(APASL)2015年版乙型肝炎指南[3]中將“部分病毒學應答(partial virological response，PVR)”定義為：依從性良好患者接受NAs至少6個月或12個月的治療后，HBV DNA下降超過1 log10IU/ml但仍可檢測到；歐洲肝病學會(EASL)2017年版乙型肝炎指南[4]定義PVR為：依從性良好的患者在接受至少12個月的NAs治療后，HBV DNA下降超過1 log10IU/ml，但HBV DNA仍為陽性。我國2019年版乙型肝炎防治指南[2]在“應答不佳患者”部分中提到，CHB患者采用一線NAs治療48周，排除依從性和檢測誤差后，HBV DNA>2000 IU/ml。

目前，國內外對LLV尚無公認的定義。2018年美國肝病學會(AASLD)指南[5]指出：持續LLV是指HBV DNA<2000 IU/ml但仍能檢測到(最低檢測限為10 IU/ml)的患者。有學者[6]將LLV患者定義為HBV DNA<2000 IU/ml，但仍能檢測到，包括持續性或間歇性LLV。筆者建議，慢性HBV感染者接受ETV、TDF或TAF等一線藥物治療至少48周以上，血清HBV DNA采用靈敏qPCR法(最低檢測限為20 IU/ml或10 IU/ml)仍可檢測到，但<2000 IU/ml，在排除依從性問題及病毒耐藥突變后，定義為LLV。LLV可以分為兩類：持續性LLV是指用靈敏的qPCR法檢測至少2次，每次間隔3～6個月，血清HBV DNA均為陽性，但均<2000 IU/ml；間歇性LLV是指用靈敏的qPCR法檢測至少3次，每次間隔3～6個月，HBV DNA呈間歇性陽性，但<2000 IU/ml。

診斷LLV時應排除：(1)患者對抗病毒治療的依從性差，如漏服抗病毒藥，自己減少藥物劑量，或自己改為隔天服藥，或服藥方法不當 (如ETV未遵從餐前或餐后至少2 h空腹服用) 等。(2)基線HBV DNA水平對48周NAs治療效果的影響。HBV DNA≥108拷貝/ml的患者治療至52周時HBV DNA雖有明顯下降，但仍可檢測到的概率為33.8%，持續治療3年時為23.5%[7]。對這些高病毒載量患者或許應該延長治療后再觀察時間再作LLV的診斷。(3)HBV耐藥突變：包括ETV治療后耐藥，拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韋酯(ADV)經治的ETV耐藥[8]；TDF耐藥也偶有報道，如B基因型及D基因型中rtA181V和rtN236T雙突變位點的TDF耐藥等[9]。由于臨床指南對耐藥引起的HBV DNA低水平復制有明確的處置意見，故本文中定義LLV時將耐藥排除在外。(4)藥物與藥物、藥物與食物的相互作用對一線NAs抗病毒作用的可能影響[10]。(5)排除HBV檢測因污染帶來的“假陽性”結果的可能。

2 NAs治療下的LLV發生率

考慮到低耐藥屏障NAs(如LAM、ADV、LdT)已經不作為CHB治療的首選藥物，本文僅限于對目前一線NAs藥物ETV、TDF或TAF相關的LLV展開討論。

2012年的EASL指南[11]曾總結了ETV和TDF治療后患者的HBV DNA陰轉情況：ETV治療48周或52周，HBeAg陽性和陰性患者血清HBV DNA可檢出率分別為33%與10%(HBV DNA<60～80 IU/ml)；TDF治療48周或52周，HBeAg陽性及陰性患者的血清HBV DNA可檢出率分別為24%及7%(HBV DNA<60～80 IU/ml)。TAF治療臨床研究[12-13]結果表明，治療48周的HBeAg陽性和陰性患者的HBV DNA可檢出率(HBV DNA>29 IU/ml)分別為36%及7%。TDF治療96周的HBeAg陽性和陰性患者的HBV DNA可檢出率分別為25%及9%；TAF治療96周的HBeAg陽性和陰性患者的HBV DNA可檢出率分別為27%及10%(HBV DNA>29 IU/ml)[14]。

隨著HBV DNA定量檢測技術的不斷革新，病毒載量的檢測下限越來越低。因此，舊檢測方法定義的病毒學應答，在使用更靈敏的檢測方法時可能被歸為LLV的范疇。一項研究[15]中，141份普通HBV DNA檢測試劑結果陰性的標本用高敏方法檢測，存在以下5種情況，即>500、20～500、10～20、<10 IU/ml和陰性，比例分別為13.5%、31.9%、18.4%、30.5%和5.7%。Lee等[16]對894例接受ETV治療的CHB患者回顧性觀察分析中發現，平均5年的隨訪期間，654例(73.2%)達到維持病毒學應答[MVR，即達到完全病毒學應答后，在隨訪期間HBV DNA持續檢測不到(HBV DNA<12 IU/ml)]，即達到完全病毒學應答后，在隨訪期間HBV DNA持續檢測不到 (HBV DNA <12 IU/ml)；240例(26.8%)出現LLV(HBV DNA>12 IU/ml)。另一項875例接受ETV治療的CHB患者回顧性隊列研究中，在平均4.5年的治療隨訪期間498例(56.9%) 達到MVR，377例(43.1%)出現LLV(HBV DNA>12 IU/ml)[6]。上述結果提示，先前研究NAs類藥物治療下獲得的病毒抑制率可能偏高，而LLV的發生率可能被低估。

3 LLV對CHB患者預后的影響：不利于肝纖維化逆轉，肝硬化患者HCC發病風險顯著增加

一項對239例有基線及治療78周時2次肝活檢、接受抗病毒治療的肝纖維化患者的隨訪研究[17]表明，治療78周后肝纖維化進展的患者其HBV DNA檢出率為50%，明顯高于發生肝纖維化逆轉患者(19%)和肝纖維化是否逆轉難以確定的患者(26%) (P=0.015)，表明LLV可能不利于CHB患者肝纖維化逆轉，甚至可促進肝纖維化進展。

近年來的一些研究表明，NAs治療下血清HBV DNA和 pgRNA低值陽性可能與疾病進展和肝癌的發生有關。一項來自我國香港的隊列研究[18]采用了更加靈敏的HBV DNA和HBV RNA(檢測下限分別為10 IU/ml和51.5 IU/ml)檢測方法，結果顯示，NAs治療下HBV DNA和pgRNA 低值陽性與患者HCC發生有關。在ETV治療乙型肝炎相關肝硬化失代償期患者中，未達到病毒學應答(HBV DNA<20 IU/ml)已被證實是HCC發生的重要危險因素(HR=7.74，P=0.022)[19]。而在接受ETV治療的肝硬化患者，PVR是治療2年后發生HCC的獨立危險因素[20]。Kim等[6]研究也表明，LLV患者比MVR患者更易發生HCC(14.3% vs 7.5%,P=0.015),其危險比為1.98(P=0.002)，其中肝硬化伴LLV患者的HCC風險明顯高于MVR者(23.4% vs 10.3%，P=0.002)。然而，對于非肝硬化患者，該研究未發現LLV和MVR患者之間的HCC風險存在顯著差異。這些研究提示，對于肝硬化患者，LLV與更高的肝癌風險相關。但也有研究[16]顯示，不考慮ETV服藥依從性情況下，LLV是肝癌發生的獨立危險因素(P=0.031)；而在高依從性組中，MVR組和LLV組的肝臟相關死亡或移植、肝癌和肝臟失代償的發生率無顯著差異。這表明在真實世界中堅持ETV治療的患者，NAs治療期間的LLV可能不是HCC和肝硬化并發癥的危險因素。目前，有關LLV的危害尚缺乏更多前瞻性研究數據，但無論如何，NAs治療下LLV患者的預后值得密切關注。

4 LLV發生的可能機制

4.1 NAs競爭性抑制作用的局限性 HBV cccDNA以微小染色體的形式穩定地存在于感染肝細胞核內，是HBV感染慢性化和難以治愈的關鍵[21-22]。cccDNA的來源包括初始感染和胞內復制回補2種途徑[23]。新感染病毒進入肝細胞后，病毒核衣殼將HBV松弛環狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)帶入肝細胞核內并在宿主DNA修復系統的作用下轉化為cccDNA。由其轉錄的pgRNA既是核心抗原和P蛋白的mRNA，又可作為逆轉錄模板形成新的rcDNA。新合成的rcDNA一方面可成為有感染性的完整病毒顆粒，再感染新的正常肝細胞；另一方面，新合成的rcDNA也可進入細胞核，經過修復后回補核內cccDNA，以維持肝細胞核內cccDNA池的穩定性[24]。NAs藥物的作用機制正是通過與細胞內dNTP競爭性地與P蛋白結合，抑制子代病毒rcDNA的合成。不同的NAs在具體作用機制上存在差異。其中臨床上曾廣泛使用的模擬dATP的ADV和模擬dCTP的LAM在磷酸化后不具有3′端的-OH，無法繼續形成磷酸二酯鍵，進而終止DNA負鏈的合成[25-26]；β-L-核苷類似物LdT在體外抑制DNA聚合酶活性并抑制DNA正鏈的合成[27]。目前各大指南推薦的模擬dGTP的ETV在磷酸化后具有正常的3′-OH，摻入合成中的DNA鏈后仍有DNA鏈的合成，但由于空間位阻，在插入位點后2～3 nt處終止[28-29]；新型的無環5′-單磷酸腺苷類似物TDF在磷酸化后缺少3′-OH并在體外劑量依賴性抑制P蛋白活性[30]。

前文提到，這些NAs是通過與細胞內源dNTP競爭結合抑制P蛋白的活性來抑制HBV DNA復制。在同一種細胞中各種脫氧核苷酸含量存在一定差異，平均胞內每種dNTP含量約為10 nmol/108個細胞水平[31]。NAs藥物需與胞內不同濃度的dNTP競爭才能有效抑制P蛋白活性。以半最大效應濃度(EC50)為3.75 nmol/L、有效半衰期為24 h的ETV為例[32]，在HepG2.2.15細胞培養液中加入100 μmol/L的ETV，6 h后使用TOF-LC/MS系統檢測胞內ETV濃度為5 pmol/2×106個細胞，胞內三磷酸化(TP)ETV濃度為5 pmol/6×105個細胞[33]。即向細胞培養液中加入高濃度的ETV藥物后，胞內ETV-TP濃度約為dNTP濃度的1/12。由此可見，NAs摻入逆轉錄形成的脫氧苷核酸鏈中，雖然可以不可逆地抑制該病毒新DNA鏈的合成，然而由于胞內大量dNTP的存在，NAs并不能徹底地抑制HBV復制[34]，NAs不能阻止新感染肝細胞中cccDNA的形成[35]，這為控制CHB患者HBV對新肝細胞的感染、有效耗竭cccDNA池帶來了新的挑戰。因此需要長期NAs治療以盡可能耗竭cccDNA，降低停藥后復發的風險。值得慶幸的是，一旦有NAs的摻入，子代病毒將因其DNA鏈的不可逆終止而失去感染性[36]。

綜上，NAs對HBV逆轉錄過程的競爭性抑制特性使之無法100%阻斷DNA鏈合成，可能會導致部分NAs治療患者的血清HBV DNA持續或間歇高于檢測下限(10 IU/ml或20 IU/ml)，即出現LLV。

4.2 不活躍的肝細胞增殖使cccDNA不能被有效稀釋 在肝臟發生炎癥性損傷后，感染了HBV的肝細胞同樣參與了損傷后的代償性增殖[37]。由于感染肝細胞內以附加體(episome)形式存在的cccDNA缺乏染色體特有的著絲粒，其在細胞有絲分裂過程中難以有效進入子代細胞新形成的細胞核內，導致子代細胞內cccDNA的丟失和cccDNA池的稀釋。德國Dandri實驗室的一項研究[38]很好地詮釋了這一過程。在他們利用肝細胞人源化小鼠的HBV感染與肝細胞增殖的研究中觀察到，感染了HBV的人原代肝細胞在快速代償性增殖時包括cccDNA拷貝數在內的所有病毒學指標表達均快速下降。相反，隨著肝細胞代償性增殖減慢，上述病毒學標志物開始反彈。與之一致，來自臨床的觀察研究發現：患者在NAs治療中，反映肝細胞損傷的ALT升高與更明顯的血清HBV DNA載量下降有關[39]，提示有一定肝臟炎癥活動度的患者對NAs抗病毒治療往往有更好的應答。同樣，與基線時無明顯肝臟炎癥(G<2)患者相比，肝臟炎癥活動度高的患者(G≥2)在開展抗病毒治療6個月后的血清HBV DNA和HBeAg下降更為明顯[40]。除此之外，在增殖的肝細胞中 NTCP的表達及細胞膜定位的明顯下調也不利于HBV的再感染[40]。但是，低增殖狀態肝細胞易被HBV感染并利于HBV有效復制，出現cccDNA蓄積[41]。低增殖狀態是否與部分接受NAs治療的CHB患者出現LLV有關，有待更多的臨床與基礎研究驗證。

5 與LLV診斷相關的檢驗方法學

需要開發更靈敏且準確度更高的HBV DNA檢測方法，以更加有效地對LLV患者的血清HBV DNA水平進行監測。并且應對HBV DNA“未檢測到”和“HBV DNA存在但低于檢測下限”兩種結果模式進行區分，后者表示有PCR擴增曲線和痕量DNA存在，只是無法準確定量。此外也應考慮過分片面地強調HBV DNA檢測的靈敏度，會導致污染帶來的低值陽性結果被誤當作LLV，從而給CHB的診治帶來困擾[42]。

6 LLV臨床管理策略

AASLD指南建議LLV的CHB患者繼續原藥物單一治療，但證據等級很低；并指出沒有足夠的比較證據支持增加第2種藥物或改用另一種藥物來代替繼續單一治療[42]。在其更新的指南(2018年)中建議不管ALT水平如何，接受ETV、TDF或TAF單藥治療96周，但持續LLV(<2000 IU/ml)的CHB患者繼續單藥治療(證據質量：很低，有條件推薦)[5]。

部分基于真實世界研究[16,43-45]指出，對于依從性好的患者，在ETV治療期間經歷LLV可能沒有必要調整抗病毒藥物。與此相反，鑒于LLV的潛在危害性，近年來已發表多項對ETV經治的LLV治療的不同策略的研究，如換用或聯合TDF[46-49]、換用TAF[50]或聯合PEG-IFNα治療[51-55]。目前TDF或TAF經治LLV患者改變治療方案的臨床研究尚少。AASLD以外的其他主流CHB管理指南尚未提出針對LLV的管理策略，但多給出了PVR的應對策略，這可能對臨床管理LLV患者提供思路。2017年版EASL指南[4]中指出任何NAs都有可能發生PVR。首先需檢查患者的依從性。如果患者服用低耐藥屏障的藥物(LAM、ADV或LdT)，建議換用非交叉耐藥的NAs。此外應注意的是，大多數時候高病毒載量患者ETV或者TDF治療后更易發生PVR。該現象并非藥物無效，而與其有限的抑制病毒復制的能力相關。故此，對高病毒載量的患者在48周發生PVR時需要考慮藥物動力學：HBV DNA水平持續下降者延長治療時間可能應答率升高，而且長期治療耐藥風險非常低，可繼續原ETV或TDF單一治療。TAF亦是如此；若HBV DNA不再下降時可換用或加用另一種NA。2018年版AASLD指南[5]僅建議繼續ETV或TDF單一治療。而我國2019版指南[2]推薦應答不佳患者(HBV DNA>2000 IU/ml)調整NAs治療(應用ETV者換用TDF或TAF，應用TDF或TAF者換用ETV，或兩種藥物聯合使用)(C2)，還建議可以聯合PEG-IFNα治療(B1)。

PEG-IFNα在HBeAg血清學陰轉及HBsAg清除方面，比NAs治療方案更具有優勢。但IFN的抗病毒作用相對較弱、耐受性低、不良事件發生風險較高，限制了醫生和患者對IFN的使用。因此，如何篩選能獲得良好應答的患者成了PEG-IFNα用于臨床治療的關鍵問題[52]。我國學者早期開展的HBeAg陽性CHB患者ETV與PEG-IFNα-2a聯合/序貫治療的持續應答研究 (OSST研究)，共納入200例HBeAg陽性CHB患者，入組患者接受ETV治療9～36個月，且HBV DNA<1000 拷貝/ml、HBeAg<100 PEIU/ml[53-54]。入組患者隨機接受換用PEG-IFNα或繼續ETV治療48周，其中換用PEG-IFNα者接受ETV重疊治療8周。結果發現，高達17.78%(8/45)的優勢NA經治患者(基線HBsAg<1500 IU/ml)接受PEG-IFNα序貫治療96周可獲得HBsAg清除[55]。對于NAs治療應答不佳/耐藥的HBeAg陽性CHB患者，前期的一項小樣本研究提示，與NAs換藥或者加藥組相比，在換藥或加藥基礎上進一步聯合PEG-IFNα治療，可明顯抑制病毒復制[55]，若研究結果能在大樣本臨床隊列中得以驗證，無疑將為LLV的治療提供新的思路和方法。

7 總結

在NAs治療后，存在一定比例的LLV患者。其發生的原因可能與NAs競爭性抑制HBV 復制、對cccDNA無直接作用的機制相關。因此，理論上，NAs經治的LLV患者通過換用或加用新的NAs藥物難以徹底解決LLV問題。同時，隨著更加靈敏的HBV DNA檢測試劑和方法的應用，會有更多的LLV被檢測出。考慮到LLV可能與肝纖維化的進展、肝硬化甚至肝癌發生相關，加強該方面的基礎與臨床研究顯得越發重要而迫切。

基礎研究方面，針對LLV的發生機制，除了上述的NAs藥物作用機制的固有缺陷外，是否還有宿主免疫、遺傳、肝細胞增殖調控或其他方面的影響？臨床研究方面，對于LLV的臨床結局，LLV不同HBV DNA水平對肝病進展和預后的影響是否不同？不同預后是否存在相應界值？闡明這些問題有助于制訂更合適的HBV DNA定量的PCR檢測下限。LLV臨床治療方面，在HBV特效新藥研發成功前，如何優化現有治療方案？NAs維持原方案治療、換藥或加藥，或聯用PEG-IFNα，哪種方案更有效？聯用PEG-IFNα能否在解決LLV的同時，進一步實現臨床治愈和減少肝癌發生？由于可能受研究經費和其他因素影響，考慮到臨床研究的可行性和效率，是更適宜采用隨機對照還是真實世界觀察，來開展大樣本的、多中心的臨床研究？上述諸多問題的解決，不僅有助于奠定徹底解決LLV問題的基礎，也可能為新的藥物開發提供思路和方法。

志謝參與線上研討及線下討論的專家(按姓氏拼音順序)：陳香梅、成軍、段鐘平、高沿航、韓濤、胡鵬、黃燕、賈繼東、江建寧、李軍、林炳亮、劉軍平、劉燕娜、呂君、王豪、王暉、王磊、魏來、謝青、徐京杭、余祖江、張大志、張繚云、張欣欣、張躍新。此外，本文還經部分中華醫學會肝病學分會肝病基礎醫學與實驗診斷協作組成員共同討論成文。李德瑤、張鵬參與了文獻查閱和整理工作。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：魯鳳民、封波、鄭素軍、莊輝教授負責構思主要框架及修改文章關鍵內容；蔣素貞、楊瑞鋒、紀冬、黨雙鎖、魯曉擘、陳紅松、陳新月、任紅、高志良、南月敏、徐小元、福軍亮、牛俊奇、張文宏參與修改文章。