液相色譜-串聯質譜技術在多種類獸藥殘留分析中的應用

胡一諾 楊雨婷 王涵宇 劉振利 陳冬梅

（華中農業大學動物醫學院，國家獸藥殘留基準實驗室（HZAU），農業農村部畜禽產品質量安全風險評估實驗室（武漢），武漢430070）

動物性食品是全人類飲食的主要組成部分[1]。動物性食品在生產、加工和流通過程中極易受到污染，可能對人類健康造成很大威脅[2]。如今在全球市場上，食品質量與安全越來越受到消費者、政府和生產者的關注[3]。我國動物性食品的市場消費量巨大[4]，因此動物性食品中獸藥檢測、篩查成為保障國民食品安全的一個重要技術手段[5]。

目前，隨著現代化步伐的邁進，政府對獸藥殘留分析的要求也在不斷提高，殘留檢測方法也應向著高通量、高效率的方向發展，監控的藥物范圍逐步從單一類別發展為多類別的同時分析，傳統的單一種類藥物的檢測已不能滿足需要。本文總結了常見的獸藥殘留種類及其危害，并主要對液相色譜－串聯質譜技術在多種類獸藥殘留分析中的應用進行了綜述。

一、常見獸藥殘留種類及其危害

獸藥，是指用于預防、治療、診斷動物疾病或者有目的地調節動物生理機能的物質（含藥物飼料添加劑），主要包括血清制品、疫苗、診斷制品、微生態制品、中藥材、中成藥、化學藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品及外用殺蟲劑、消毒劑等[6]。常見獸藥殘留的種類有抗菌類藥物、抗寄生蟲類藥物和激素類藥物等[7]。獸藥的不規范、不合理使用，會使動物性食品中的獸藥殘留含量超標，影響食品安全，危害人類健康。因此，高通量檢測多類獸藥殘留的檢測技術日漸受到人們的關注。

（一）抗菌類藥物抗菌類藥物對大部分病原微生物都有良好的抑制或殺滅作用，使用量較大的抗菌類藥物包括抗生素類和人工合成抗菌藥。其中，抗生素類包括β－內酰胺類、林可胺類、四環素類、氨基糖苷類、大環內酯類、氯霉素類等；人工合成抗菌藥包括喹諾酮類、磺胺類、喹噁啉類、硝基呋喃類、硝基咪唑類等[8]。人體攝入低劑量的獸藥殘留物，會緩慢的積蓄并造成傷害，如β－內酰胺類藥物青霉素可導致過敏人群發生變態反應[9]；過量的磺胺類藥物會損害泌尿系統，出現結晶尿[10]；氯霉素類藥物可以使人患再生障礙性貧血和導致肝損傷等[11]；大多數氨基糖苷類藥物表現出一定的腎毒性和耳毒性，且造成的聽力損傷不可逆[12]；過量的四環素類藥物會導致機體生化功能紊亂，有一定的腎毒性、肝毒性和生殖毒性[13]；喹諾酮類藥物具有一定的肝毒性、神經毒性和軟骨毒性[14]；喹噁啉類藥物雖然能促進動物生長，但其具有肝、脾、腎、腎上腺、生殖及遺傳毒性等[15]；硝基呋喃類代謝產物在動物體及環境中殘留時間較長，具有“三致”風險，現已被許多國家禁用于食品動物[16]。

（二）抗寄生蟲類藥物預防和治療寄生蟲的獸藥主要有苯并咪唑類、阿維菌素類、硝基咪唑類、聚醚類、咪唑并噻唑類、四氫嘧啶類藥物等。為預防寄生蟲病，養殖者通常將抗寄生蟲藥物添加到飼料中，但不合理的用藥程序，長期處于亞劑量藥物濃度的寄生蟲更加容易突變，產生耐藥性，繼而使藥物使用壽命縮短，危害生態健康[17]。苯并咪唑類是一種廣泛的抗寄生蟲藥物，但有研究表明，苯并咪唑類在實驗動物上有致畸和致突變的作用[18]。硝基咪唑類中的二甲硝唑和甲硝唑具備致癌和致突變的可能性，故歐盟禁止這兩種藥在畜禽養殖中使用[19]。聚醚類藥物對預防和治療球蟲病有積極作用，但其具有較強的細胞毒性，用藥的安全范圍非常窄，添加過量會導致藥物殘留，通過食物鏈影響人類健康[20]。

（三）激素類藥物激素類藥物分為類固醇激素類、非甾體激素類等。激素類藥物可以調節機體的代謝活動，提高動物的生產性能。類固醇激素中的多種性激素可以調節動物發情周期，使經濟型動物更好地被集約化管理，但是攝入性激素殘留超標可能會對人體致癌，也會使兒童性早熟[21]。糖皮質激素類具有抗炎、抗休克作用，但會引起免疫抑制、胃潰瘍，可誘發精神病和癲癇，長期大劑量使用會引起骨質疏松[22]。非甾體激素是指不含甾體的一類藥物，多數具有芳香酸基本結構，經水解反應生成酸和醇。該類藥物具有解熱、鎮痛、消炎和抗凝血等作用，使用該類藥物不當可能導致胃黏膜潰瘍，對其過敏會發生瘙癢、丘疹甚至呼吸困難等，嚴重時危及生命安全[23]。

二、液相色譜-串聯質譜技術的應用

近年來，隨著食品安全越來越受到人們的重視，餐桌上的安全成為執法部門和人民群眾關注的重點話題。尤其是經過了“瘦肉精豬肉[24]”“孔雀石綠水產[25]”“蘇丹紅鴨蛋[26]”“三聚氰胺奶粉[27]” 等食品安全事件后，如何檢測食品中的獸藥殘留成為重中之重。目前，動物性食品中獸藥殘留的檢測技術主要有氣相色譜法 （GC）[28～29]、 高效液相色譜法（HPLC）[30～32]、氣相色譜－質譜法（GC－MS）[33～35]、液相色 譜－串 聯 質 譜 法 （LC－MS/MS）[36～41]、ELISA法[42～45]、生物傳感器[46～47]等。

液相色譜法適用于測定極性大、沸點高、相對分子質量＞300的化合物，在獸藥殘留檢測方面應用最為廣泛。液相色譜－串聯質譜法（LC－MS/MS）將液相色譜儀與質譜儀進行聯合檢測研究，將液相色譜法的定量與質譜法的確證功能有機地結合起來，因此其檢測過程更加準確和靈敏[48～49]。相比其他方法，液相色譜－串聯質譜法檢測范圍廣，精準度高，已經逐步發展成為檢測各類食品中農獸藥殘留的一種重要方法[50]。液相色譜－串聯質譜又分為液相色譜－三重四極桿質譜（LC－TSQ－MS）[51]、液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（LC－Q－TOF－MS）[52]、液相色譜－離子阱質譜（LC－IT－MS）[53]、液相色譜－四極桿－軌道阱質譜（LC－Q－Orbitrap MS）[54]。

（一）液相色譜－三重四極桿質譜（LC-TSQMS）四極桿質譜是由四根帶有直流電壓的平行桿疊加一個射頻電壓構成的，四極桿通過使用一個可變電場選取具有不同質荷比的離子。只有特定質量的離子才能發射出四極桿，被倍增器檢測得到，過大或過小質量的離子會撞向正負極桿或被彈射出軌道[55]。ZHANG等[56]采用液相色譜－三重四極桿質譜（LC－TSQ－MS）建立了一種同時檢測雞肉中極性獸藥氟喹諾酮類、磺酰胺類、大環內酯類和泰妙菌素類10種獸藥殘留的方法，流動相分別為0.05%甲酸－乙腈和0.05%甲酸水溶液，檢測限為0.3～2.0μg/kg，定量限為2.0～5.0μg/kg，該方法選擇性高、靈敏度好。GRANELLI和BRANZELL[57]建立了一種檢測畜禽肉中四環素類、喹諾酮類、磺胺類、大環內酯類等19種抗微生物藥物的液相色譜－三重四極桿質譜（LC－TSQ－MS）法，有機相是乙腈，水相是含0.2%甲酸水溶液，檢測限在2～15μg/kg。CHEN等[58]利用液相色譜－三重四極桿質譜（LC－TSQ－MS）測定了奶、蛋、組織中的磺胺類、氟喹諾酮類、四環素類、大環內酯類等120種獸藥，使用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相，檢測限為0.5～3μg/kg，定量限為1.5～10 μg/kg。STUBBINGS和BIGWOOD[59]采用液相色譜－三重四極桿質譜（LC－TSQ－MS）測定了雞肉中磺胺類、氟喹諾酮類、苯并咪唑類等41種獸藥，流動相為0.1%（v/v）甲酸水、0.1%（v/v）甲酸乙腈和0.1%（v/v）甲酸甲醇，定量限為0.33～111 μg/kg。侯建波等[60]利用液相色譜－三重四極桿質譜（LC－TSQ－MS）建立了測定豬肉中磺胺類、苯并咪唑類、喹諾酮類、大環內酯類等54種獸藥的方法，流動相為甲醇、乙腈和0.1%甲酸水溶液，定量限為0.3～3μg/kg，相對標準偏差為2%～19.8%。HAN等[61]采用超高效液相色譜－三重四極桿質譜（UPLC－TSQ－MS）建立了牛奶中磺胺類、β－內酰胺類、四環素類等38種獸藥的檢測方法，流動相為乙腈和0.1%甲酸水溶液，定量限為0.03～10μg/kg。CAPRIOTTI等[62]利用液相色譜－三重四極桿質譜（LC－TSQ－MS）測定雞蛋中的四環素類、抗球蟲藥、青霉素類、磺胺類等獸藥殘留，流動相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈，回收率為62%～119%，相對標準偏差為3%～17%。

（二）液相色譜-離子阱質譜（LC-IT-MS）離子阱質譜的主要原理在于，它是由兩個雙曲環形端蓋電極和兩個雙曲面端蓋電極共同組成，隨著兩個雙曲環形端蓋電極的連續射頻使其電壓逐漸明顯增加，離子按質荷比由小至大的順序排除，并對此進行質譜記錄，因此可以直接得到離子質譜的示意圖。離子阱質譜適合于物質結構的精確鑒別及分析[63]。尹志強[64]利用超高效液相色譜－三重四極桿/線性離子阱質譜法（UPLC－Qq LIT－MS）篩查了豬肉中21類210種藥物，包括大環內酯類藥物、糖皮質激素類藥物、殺蟲劑類藥物等，流動相分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇，定量限＜10 μg/kg，從制備樣品到采集數據結果只花費了150 min，體現了該方法的快速、靈敏、高通量，適用于大批量樣品的快速篩查。

（三）液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（LCQ－TOF－MS）飛行時間質譜（TOF－MS）是利用動能相同而質荷比不同的離子在恒定電場中運動，經過恒定距離所需時間不同而鑒定出不同的化合物。它的優點是具有很高的分辨率和靈敏度，檢測速度很快，得出離子質量的準確度比四極桿質譜和離子阱質譜高出100多倍，適用于生物大分子的分析[65]。陳吉漢[66]利用超高效液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（UPLC－Q－TOF－MS）建立了150種藥物的識別譜庫，包括他汀類藥物、磺胺類藥物、大環內酯類藥物、β－受體激動劑類藥物和激素類藥物，流動相分別為乙酸銨水溶液和乙酸銨－甲醇，檢出限為0.1～0.5μg/kg，定量限（S/N＝10）為0.3～1.0μg/kg，線性范圍為0.5～100μg/kg，相關系數均＞0.994 8。尹志強[64]利用超高效液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（UPLC－Q－TOFMS）建立了雞蛋中25類65種化合物的檢測方法，包括苯并咪唑類藥物、喹諾酮類藥物、甾體激素類藥物等，流動相分別為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水溶液，方法的定量限在0.006～0.95μg/kg之間，且用時僅20 min，體現了該方法的快速、高效、靈敏。WENG等[67]采用超高效液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（UPLC－Q－TOF－MS）建立了測定雞肉中126種農藥殘留的方法，包括殺螨劑、殺蟲劑、除菌劑、植物生長調節劑等，流動相分別為含1%甲酸、5 mmol／L甲酸銨的水溶液和含1%甲酸、5 mmol／L甲酸銨的甲醇溶液，檢出限為0.01～6.19μg/kg，定量限為0.02～19.3μg/kg，方法選擇性高、特異性好。ORTELLI等[68]利用超高效液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（UPLC－QTOF－MS），檢測了牛奶中阿維菌素類、喹諾酮類、磺胺類、苯并咪唑類、β－內酰胺類等150種獸藥，流動相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇，檢測限在0.5～25μg/kg之間。DENG等[69]利用液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（LC－Q－TOF－MS）測定了肉、蛋、奶中類固醇類、苯并咪唑類等150種獸藥，流動相為含0.1%甲酸、5 mmol／L甲酸銨的水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，回收率在71%～115%之間，檢測限為5μg/kg。STOLKER等[70]采用液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（LC－QTOF－MS）測定了牛奶中大環內酯類、苯并咪唑類、喹諾酮類、四環素類、青霉素類等101種獸藥，流動相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈，回收率為70%～120%，定量限為1～50μg/kg。PETERS等[71]采用高效液相色譜－飛行時間質譜法測定了牛奶、雞蛋和魚肉中的大環內酯類、苯并咪唑類、喹諾酮類、青霉素類等115種獸藥，提取試劑為乙腈－水（6∶4，V∶V），流動相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液，回收率為70%～100%，定量限為4～400μg/kg。KAUFMANN等[72]建立了檢測畜禽肉中氟喹諾酮類、磺胺類、β－內酰胺類、四環素類、林可胺類等100種獸藥殘留的超高效液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（UPLCQ－TOF－MS）法，流動相為0.3%甲酸乙腈溶液和0.3%甲酸水溶液，檢測限為5μg/kg，定量限為0.2～10.9μg/kg。ZHANG等[73]建立了高效液相色譜－四極桿－飛行時間質譜（HPLC－Q－TOFMS）測定蜂蜜和牛奶中大環內酯類、磺胺類、喹諾酮類、四環素類等90種獸藥化合物的方法，采用5%乙酸－乙腈提取，流動相為0.1%甲酸水溶液和乙腈，蜂蜜的回收率為70%～120%，定量限為0.21～20μg/kg，批間變異系數在1.77%～9.9%之間；牛奶的回收率為73%～122%，定量限為0.1～17.3μg/kg，批間變異系數在1.3%～9.61%之間。

（四）液相色譜-四極桿-軌道阱質譜（LC-QOrbitrap MS）四極桿－軌道阱質譜（Q－Orbitrap MS）是基于傅立葉變換的混合儀器之一，將高性能的四極前驅物選擇與高分辨率、精確質量Orbitrap檢測結合起來，前體離子可以通過引入高能碰撞解離（HCD）而離解[74]。付曉燕[75]采用超高效液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC－Q Exactive Orbitrap HRMS）建立了乳品中獸藥多殘留的高通量檢測方法，獸藥種類包括金霉素、青霉素、洛美沙星、磺胺甲嘧啶等62種，流動相為乙腈和0.1%甲酸水溶液，牛奶和奶粉中的檢出限分別為0.5μg/kg和1.0μg/kg，定量限分別為5μg/kg和10μg/kg，該方法便捷高效、靈敏準確。WANG等[76]采用超高效液相色譜－四極桿－軌道阱質譜（UPLC－Q－Orbitrap MS）法檢測了牛奶中硝基咪唑類、氟喹諾酮類、β－內酰胺類、青霉素類、磺胺類等獸藥殘留，采用試劑乙腈、乙二胺四乙酸提取，流動相為0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨水溶液和0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液，定量限在1～100μg/kg之間。JIA等[77]建立了測定牛奶中苯并咪唑類、阿維菌素類、磺胺類、抗蠕蟲藥等300種獸藥殘留的超高效液相色譜－四極桿－軌道阱質譜（UPLC－Q－Orbitrap MS）方法，采用甲醇－水（84∶16，V∶V）提取，流動相為0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨的水溶液和0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液，回收率為80%～111%，檢測限為0.01～5.35μg/kg，定量限為0.01～9.27μg/kg。王立丹[78]建立了測定豬肉、豬腎、魚肉、雞肉中β－受體激動劑、喹諾酮類、四環素類、大環內酯類、磺胺類等60種獸藥的液相色譜－四極桿－軌道阱質譜（LC－Q－Orbitrap MS）法，流動相為0.1%甲酸水溶液和甲醇，3種基質定量限范圍為0.1～5.0μg/kg。

三、展望

隨著動物性食品的發展，人類對食品安全的重視提高，動物性食品中獸藥多殘留檢測技術成為了科學研究的主要方向，獸藥檢測范圍從單種類向多種類發展無疑是一種必然趨勢。近幾年，獸藥殘留檢測技術也在不斷改進和完善，在多種類獸藥殘留檢測的基礎上，越來越多新型的技術朝著快速、簡便、靈敏、準確發展。這將對提高動物性食品品質，規范農牧業養殖，保障人類健康發揮重要作用。