作物基因克隆技術應用進展

劉雨菲

(西南大學，重慶 400700）

基因克隆技術是19世紀70年代初開始發展起來的一項研究技術。它是研究某一特定基因的表達和功能研究的第一步。基因克隆技術的發展為作物研究提供了新的技術方法和研究方向。研究人員利用作物基因克隆技術，通過改變基因型實現了農作物產量、品質、抗性等多種性狀的改良，顯著提高了農作物的質量。隨著基因克隆技術的不斷發展并投入實踐應用，關于基因克隆的技術研究也在不斷改進。目前幾乎作物研究的每個領域，都有基因克隆技術的身影。

作物基因的克隆技術是作物育種研究的重要組成部分。主要內容是鑒別分離突變體特異基因并得到完整的基因序列種，進行基因定位，篩選有利性狀，最后應用到作物生產實踐中。作物基因克隆技術通常分為兩種。相對比較傳統的研究途徑的是正向遺傳學方式。反向遺傳學途徑是新型研究方法，它是先獲得遺傳基因片段，反向研究基因。本文主要從幾種基因克隆技術的角度出發，來介紹作物基因克隆技術的研究進展，并展望了作物基因克隆技術的發展前景。

1.常用傳統基因克隆技術

1.1 功能克隆

功能克隆是出現最早的基因克隆技術之一。它主要通過研究表達的異常蛋白質，在已知遺傳損傷所引起的蛋白質缺陷信息的情況下，進行基因定位并克隆。步驟的關鍵是先已知蛋白質，再將其的mRNA反轉錄成cRNA，然后作為探針，從而從基因組中克隆到所需基因。

更有趣的是，當獲得某一個植株的相似基因，且核苷酸序列高度保守時，也可以通過利用這些已知基因片段，去篩選未知基因庫，從而分離出未知新基因。周兆斕等利用Kond等克隆和測序編碼了水稻巰基蛋白酶抑制劑的基因組，之后將其導入甘薯、馬鈴薯、茄子等多個作物，極大地改善了作物的抗蟲能力。

功能克隆是人們在克隆領域摸索出第一種最基本的克隆方法，它在作物基因克隆的研究中有重要地位。功能克隆是簡單實用的方法，但是它需要已知基因信息才能進行克隆，因此最初應用功能克隆方法的時候，具有很大的局限性。

1.2 定位克隆

定位克隆又叫圖位克隆，是人們研究出的可以克服基因編碼序列未知對功能克隆限制性的一種克隆方法。定位克隆的主要方法是根據目標基因在染色體上的表達位置進行基因分離，即通過分子標記技術將基因在染色體精確定位，構建相關基因組文庫，利用探針篩選獲得目的基因。

定位克隆在作物基因研究領域中應用很多，其中以研究抗病基因為主。早在21世紀初，定位克隆就應用在玉米莖基腐病抗性基因的研究中。2016年，黃雅敏等人在水稻葉片早衰的研究中對突變體psls1的進行定位并克隆。

當編碼序列不清楚的情況下無法進行功能克隆時，定位基因克隆技術的優勢就十分明顯。但定位克隆主要適用于基因組小的作物，像玉米、小麥這一類基因組大且構建圖譜復雜的作物如，果采用這種方法會困難很多。但近年來隨著基因組學的發展，大多數作物的基因研究已經非常深入，定位克隆也有新的發展。

1.3 表型克隆

有些作物的遺傳機理復雜，很難分析它的基因產物，進行分離定位鑒定也十分煩瑣困難，但其在表型上有明顯差異。在多次嘗試以后，1995年首次有人提出了表型克隆。它主要是利用作物表型的差異來克隆作物基因。

目前人們已通過表型克隆的方法篩選出了多個作物的目的基因，如近年來水稻中得到的短根突變體ksr8和溫度敏感型黃葉突變體yl2(t)等。

表型克隆是一種極具發展潛力的技術方法，它利用的是連鎖作圖的方法，但與定位克隆不同的是，表型克隆不需要通過遺傳標記進行定位分析，更省時省力，大大提高了基因克隆速度。但是，表型克隆每次試驗分離鑒別一部分基因片段，可能對于其他區域序列的敏感性會有所差異。

2.新型基因克隆技術

2.1 DNA芯片技術

DNA芯片技術又稱生物芯片技術，它是由核酸片段如以特定熒光標記的不同的寡核苷酸探針，與游離靶序列雜交，或生物集成膜片上的固定的不同靶分子與游離的探針雜交，然后進行雜交信號的檢測。

這項技術在作物中主要用于基因表達的研究。DNA芯片技術可有助于更了解生物在不同階段和生理狀態下的表達基因，更好地研究作物生長發育和病變過程基因表達的內在機制。2014年，陳建省等人利用該技術與傳統分子標記結合，構建小麥遺傳圖譜以及QTL定位分析。2019年，賀超等人在基于基因芯片的研究中，進行了水稻胚乳發育相關基因生物信息學分析。

DNA芯片技術的出現是基因克隆研究史的一個重要節點。它有很多優點，如檢測速度快、效率高、適用范圍廣、容量大。近些年各學科交叉融合發展，隨著未來技術的提高，DNA芯片技術在作物基因研究領域會有更多重要的應用。

2.2 PCR擴增技術

PCR擴增技術的前提是已知克隆基因的基因序列。已知作物基因序列以后，根據已知基因的序列設計并合成引物，當克隆該基因時可先提取相關基因序列，然后進行PCR擴增，對擴增的基因片段進行純化再連接到適宜的載體上。

目前PCR技術在作物基因克隆方面已經得到大量應用。2015年，姜婷等利用實時定量PCR對脅迫下玉米內參基因穩定性進行了篩選驗證。2021年陳璨等在研究Acc1內參系統穩定性時也利用了此方法。

PCR擴增技術操作簡單，高效經濟且準確可靠，特別是在作物抗病性基因檢測分析和定位和轉基因植物鑒定方面有重要意義。

2.3 同源序列克隆

同源序列克隆是通過設計引物利用被克隆基因編碼序列同源性完成基因克隆。它克服了傳統克隆耗時耗力的問題，在作物基因克隆技術的應用中具備一定的優越性。

同源序列克隆方法在水稻、馬鈴薯、番茄、小麥等作物中已經有了較多應用，特別是野生稻的研究。2004年，楊明摯在野生稻中克隆了抗稻瘟病基因。2009年，崔玲玲通過LA-PCR擴增技術克隆了白葉枯病抗病基因RPS2。2014年，徐靖等通過T/A克隆技術，獲得了與抗病基因STK類相似的序列。2021年，陳立杰等人在對水稻OsUCH-L5基因試驗中也應用了該方法。

在同源序列克隆實際應用時需要注意如何確定獲得是真正的目的基因。這就需要考慮克隆中PCR的檢測時引物的設計以及對獲得的RGA后續的檢驗，進而作出正確判斷。同時，在之后的研究中，也要更多地運用現代新的分子生物技術來協助，使同源基因克隆的方法更加優化，效率進一步提高。

3.結語

基因克隆技術已經發展了數十年，本文中出現的只是其中的一部分，相同的是，它們在作物研究包括作物病理學研究、作物基因表達研究等領域中都起到了巨大的作用，為作物育種提供了寶貴的基因資源，它們中的許多方法技術都已經得到了廣泛應用，發展潛能是巨大的。

展望未來，作物基因克隆技術的發展與創新是多方面的。隨著技術的不斷進步，對于作物功能基因的研究越來越定量化、綜合化。將對單個基因的調控研究上升到許多基因的綜合調控，可以更好地發展利用功能基因改良作物性狀相關研究。作物陸續完成全基因組測序，這對作物遺傳改良的研究是十分有利的。作物基因研究僅僅靠之前的人為操作是不行的，未來的作物基因克隆技術研究將越來越多地通過計算機等現代電子技術，在基因研究方面實現突破。隨著基因研究的進步，加速基因克隆策略將會大量應用到未來的研究中。

作物基因克隆技術對于作物研究是至關重要的，未來應始終尋求作物基因克隆技術在作物基因克隆研究領域有更好的發展，在作物性狀改良方面有更大的突破。