微量營養素的抗氧化機制在口腔潛在惡性疾患中的研究進展

周 勇，林曉萍

氧化應激(oxidative stress，OS)是指體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成和抗氧化防御之間平衡受損的狀態，參與口腔扁平苔蘚(orallichenplanus，OLP)、口腔白斑(oral leukoplakia，OLK)和口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis，OSF)等口腔潛在惡性疾患(oral potentially malignant disorders，OPMD)的發生。機體對OS的防御可以通過微量營養素(礦物質和維生素)的抗氧化活性和酶的相互連接系統來完成，可清除、抑制自由基的形成或修復自由基造成的損傷來保護機體免受OS的影響，在一定程度上避免疾病的發生[1]。近年來，隨著微量營養素研究手段的不斷提升，越來越多的證據表明，OPMD和抗氧化微量營養素之間存在聯系。本文就微量營養素的抗氧化機制與OPMD的相關性和治療潛力等方面進行探究。

1 礦物質在OPMD中的抗氧化作用

1.1 鋅

鋅(Zn)是維持口腔健康的必需微量元素，除在牙菌斑、唾液和牙體硬組織中存在外，口腔黏膜也是鋅的“口腔儲庫”之一[2]。鋅在細胞生長和增殖、維持正常免疫功能、膠原合成和傷口愈合中發揮著關鍵作用[3]。

越來越多的研究發現，缺鋅可導致OPMD發病率增加[4]。OSF患者普遍存在鋅含量減低的情況，這可能與口腔黏膜在纖維化、炎癥及中和過量自由基等過程中，鋅需求量增加有關[5]。研究發現，鋅在治療和預防OSF惡變中具有一定的積極作用：①鋅是天然抗氧化劑超氧化物歧化酶(即銅鋅蛋白復合物)的輔因子，該酶在OSF中具有抗癌活性；②鋅會降低含銅賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)的活性，抑制膠原沉積，并通過膠原酶和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)促進病理性膠原降解，顯著改善張口度及黏膜對刺激性食物的敏感程度；③鋅能提高細胞內谷胱甘肽水平，介導維生素A和維生素C有效發揮抗氧化活性以維持上皮的完整性，減輕口腔黏膜的燒灼感[6-7]。也有學者指出，鋅通過調控免疫反應和OS反應來保護口腔黏膜屏障免受傷害[8]。細胞毒性T細胞的激活、MMPs的活化、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表達增加以及氧化-抗氧化狀態失衡被認為是OLP的常見發病機制[9]。一方面，MMPs是一種依賴鋅的蛋白水解金屬酶，鋅不僅能夠阻止MMP-1的激活，抑制T淋巴細胞在OLP中的積累，還能下調MMP-9的表達，抑制Ⅳ型膠原成分的降解，從而維持基底膜的完整性[10]；另一方面，鋅被證明能清除細胞內ROS，后者下調COX-2的表達，并抑制前列腺素E2(prostaglamdin E2，PGE2)的釋放，提示補鋅能有效抑制患者機體的OS反應并減輕涉及COX-2和PGE2途徑的炎癥反應，改善OLP患者的炎癥狀態[11]。

1.2 銅

銅(Cu)存在于多種氧化酶(酪氨酸酶、銅藍蛋白、胺氧化酶、細胞色素氧化酶)中，是維持細胞穩態的重要組成部分，參與多個生物過程[12]。銅通常與蛋白質結合，可以被釋放出來，成為游離銅，催化高活性羥基自由基的形成，增加脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷。銅缺乏會影響抗氧化酶(如銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，Cu-Zn-SOD)(SOD1))的形成，降低機體應對OS的能力[13]。

多項研究發現，OPMD和惡性腫瘤(如鱗狀細胞癌)會誘發OS狀態，血清和唾液中的銅含量均明顯升高[6,14]。OSF患者患口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的風險較高，且具有更高的侵襲性、轉移率和復發率，而銅的血管生成和抗氧化能力在OSF的發生和癌變過程中起重要作用[15-17]。市售檳榔制品中含有高銅成分，在咀嚼過程中銅與口腔黏膜角質形成細胞直接接觸，以被動擴散的方式進入上皮細胞后，一部分與金屬硫蛋白結合，另一部分通過基底膜轉移進入組織，銅在攝入短短15 min內就會出現在血液中，還會在唾液中存留較長時間(長達30 min)，可溶性銅含量的增加能夠上調LOX的活性來促進膠原纖維的增生，表明銅是OSF的一種致病因素[18]。隨著血清和唾液中銅水平的增加，OSF的組織學分級也隨之增加[12,18]，可能的原因有：一方面，銅可以激活幾種血管生成因子(VEGF、TNF-α、IL-1、b-FGF)與內皮細胞結合，誘導細胞從G0期進入到G1期，促進細胞增殖；另一方面，血清中高濃度的銅能夠誘導ROS和OS，ROS可以刺激c-fos和c-jun等早期生長相關基因的表達，促使細胞有絲分裂活性增加造成口腔黏膜組織損害。在OSF惡變過程中，除血清銅中游離態的銅增加外，銅藍蛋白(ceruloplasmin，CER)(主要的銅轉運蛋白)以及SOD1活性也隨之增加，這兩項指標的升高均與清除自由基有關，而唾液銅升高的局部效應可能比血清水平升高起更重要的作用，上述均提示了銅直接或間接地參與癌變過程[12,17]。OPMD和OSCC患者血清銅含量的增加可能是由于銅蛋白酶、CER升高和銅的分解代謝減少所致，其中CER水平在惡性進展過程中會增加4～8倍，進一步表明在OS的發生過程中，機體的抗氧化保護機制也同時啟動[12]。銅的抗氧化能力主要是通過影響含銅抗氧化酶的活性來實現的，一項動物實驗發現，銅缺乏會使血清中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、SOD1及CER的活性下降，脂質過氧化物(LPO)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，導致機體抗氧化能力降低，經蛋氨酸銅40 mg/kg補充治療40 d后上述指標均有所改善[19]。在針對OLP患者血清中差異蛋白的初期篩選過程中發現，抗氧化蛋白質CER的表達量明顯增加；此外，CER也是合成SOD1所需銅離子的來源之一，研究表明，SOD1表達增加的小鼠循環中CER和銅濃度減低[12,20]。在此背景下，銅螯合療法作為一種新的抗癌策略被提出。有學者指出，銅螯合劑不僅能夠通過降低血清中游離銅離子水平直接抑制ROS引發的細胞增殖，還能通過螯合SOD1中活性催化中心的Cu2+使其失活，降低過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)濃度，抑制失控的胞內ROS-MAPK信號轉導通路，進而間接地控制細胞過度增殖和癌變的發生，并通過抑制NF-κB介導的促血管生成因子(包括VEGF、FGF2、IL-1α、IL-6和IL-8等)相關基因的轉錄活性以及MMP-9的表達來抑制血管生成，減少細胞外基質降解和腫瘤侵襲擴散[21-22]。但關于抗銅療法在抑制腫瘤生長和血管生成方面的研究目前僅限于炎癥性乳腺癌小鼠模型和伴有嚴重免疫缺陷小鼠頭頸部鱗狀細胞癌模型，因此，降低銅水平是否在OPMD中具有良好的化學預防作用仍是未來研究的方向[17,22]。同時學者們更應該探尋一個合適的維持細胞正常生理功能的Cu2+濃度范圍，因為銅過高或過低都會引發嚴重的疾病，段曉東等[23]發現微摩爾級濃度(1×10-6～1×10-5mol/L)Cu2+產生的ROS在達到34.29%～40.47%時表現出明顯的促人角質形成細胞(human keratinocyte cell，HaCat)增殖效應。

1.3 硒

硒(Se)是多種硒蛋白的關鍵活性成分，其中GSH-Px和硫氧還蛋白還原酶(TrxRs)是硒蛋白家族中主要的抗氧化劑[24]。硒蛋白存在于許多細胞器或細胞區室中，其具有特定的組織分布和對硒水平變化的敏感性[25]。已有的研究表明，低硒水平引起的硒蛋白活性降低與癌癥風險增加息息相關[26]。

早期在一項對伊拉克扁平苔蘚(lichen planus，LP)患者的研究中觀察到，血清硒水平與LP病損的持續時間和嚴重程度呈負相關[27]。世界衛生組織(World Health Organization，WHO)將OLP歸類為癌前病變，提示其具有向鱗狀細胞癌轉變的潛力[28]。Khanna等[29]研究發現癌癥組血清硒含量較癌前組明顯降低，提示在癌變過程中，硒發揮了全面的保護性抗氧化作用。OLP患者體內的低硒水平可使體內谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX-1)活性降低，導致其無法清除由線粒體超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)歧化反應產生的H2O2，促使癌細胞轉化為更具侵襲性的表型，增加了OLP癌變風險[30]。硒在調節宿主免疫和抗OS方面發揮著重要作用。一項隨機對照臨床試驗發現，硒(外用制劑和全身給藥)治療糜爛型OLP 6周時的療效與外用皮質類固醇相當，但隨著隨訪周期的延長(12周)，硒治療似乎更有優勢：療效維持時間更長，止痛效果更佳，其具有的抗真菌作用還能有效避免局部皮質類固醇使用后的副作用，即繼發性念珠菌病[24,31]。從機制上講，一方面，補硒可以抑制NF-κB蛋白與炎性介質基因啟動子的結合，降低炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達，從而減輕OLP病損的炎癥狀態；另一方面，補硒可通過調節CD3+/CD4+和CD4+/CD8+的表達以及維持Th1/Th2平衡來恢復細胞免疫的正常功能狀態，進而避免OLP的反復波動[24,32]。在OLP中存在高OS狀態，過量的ROS會在以CD4+T淋巴細胞為主要炎性細胞浸潤的情況下加劇炎癥反應，破壞角質形成細胞的脂膜，導致更嚴重的局部組織破壞和ROS產生，形成惡性循環。硒在治療OLP時可通過清除H2O2和有機過氧化物來保護口腔黏膜免受損傷[24]。

2 維生素在OPMD中的抗氧化作用

2.1 維生素A和維生素E

脂溶性維生素A是一組有機化合物，包括視黃醇、視黃酸、維甲酸和維生素A原(類胡蘿卜素)，在降低上皮角化率、抗炎、抗氧化和免疫調節方面具有關鍵作用[4, 33]。維生素E，特別是α-生育酚，除在谷胱甘肽過氧化物酶途徑中起抗氧化劑的作用外，它還可以通過清除脂質過氧化鏈式反應中產生的有害自由基，保護細胞膜免受氧化損傷[33]。雖然維生素A和維生素E均能夠有效抑制細胞膜脂質過氧化，但兩者的聯合使用卻有一定的拮抗作用[34-35]。

流行病學研究表明，非酶類抗氧化劑(維生素A、維生素E)缺乏會增加OLK、糜爛型OLP等OPMD的易感性，且隨著疾病病程的進展，其含量逐漸降低[36-37]。由煙草和檳榔相關的致癌物及促進劑(如亞硝胺、兒茶酚和檳榔堿等)產生的自由基和ROS被認為是OPMD患者體內MDA升高的原因。脂質過氧化物對口腔黏膜組織產生的細胞毒性和遺傳毒性效應能夠導致口腔黏膜組織遭受OS損害，經證實，脂質過氧化物含量越高，正常細胞轉變為突變細胞的數量越多，從而導致OPMD患者疾病嚴重程度的加重[38]。維生素A和維生素E等抗氧化劑被證實可以降低脂質過氧化程度，而其水平的降低以及由此對組織產生的氧化損傷可能在口腔黏膜癌變過程中起著重要作用。研究顯示，胡蘿卜素的抗氧化作用可能會導致癌前病變的消退或抑制其發展為癌癥[38]。早期一項印度OLK患者的干預試驗顯示，在煙草和檳榔來源的致癌物持續存在期間，服用低劑量抗氧化維生素A或β-胡蘿卜素6個月后能夠有效縮小病損面積、抑制新發病損并降低頰黏膜細胞微核和核結構損傷的發生率，提示維生素A或β-胡蘿卜素可以降低口腔黏膜癌變風險[39]。此外，口服阿維A酸(9-順式維甲酸)(30 mg，每日1次)對常規治療無效的嚴重OLP患者有顯著的臨床療效且副作用更少[40]。維甲酸對癌前細胞的抑制作用除抗氧化作用外，可能還與其直接激活維甲酸受體(RARs和RXRs)或抑制激活蛋白-1(AP-1)的活性有關，但口腔黏膜異常增生細胞是否同口腔鱗癌細胞系一樣存在維甲酸抵抗還需進一步研究[41]。相關研究也指出，α-生育酚的強抗氧化作用能使體內自由基、脂質過氧化產物和某些微量元素水平改變，從而消除口腔癌前狀態下產生的自由基[42]。一項關于14種中草藥衍生物隨機臨床試驗進行的網絡薈萃分析(NMA)也支持了上述觀點，該研究認為番茄紅素與維生素E聯合應用在治療OSF方面效果最好(治療評分P-SCORE=0.958 6)[43]。

然而，維生素A相關化合物治療OPMD所產生的療效并不持久，全身應用維生素A所產生的毒性反應成為其使用的主要限制因素。其中口腔黏膜不良反應主要包括唇炎、口腔黏膜炎、口干癥、胡蘿卜素血癥(由于色素過度沉積導致黏膜變黃)和愈合障礙。因此能有效治療和預防腫瘤的維生素A類臨床一線藥物還有待進一步探索[44]。

2.2 維生素C

維生素C(L-抗壞血酸)是一種水溶性維生素，也是一種重要的天然抗氧化劑，它能與有機自由基反應，保護生物膜免受自由基損傷[45]。維生素C與維生素E有協同作用，當維生素E轉化為生育酚而失去抗氧化能力時，維生素C可將生育酚(α-生育酚的一種氧化形式)還原為α-生育酚，起到激活維生素E的作用[46-47]。在致癌和致突變過程中，ROS和氮物種會對DNA造成氧化損傷。相對于其他唾液生物標志物而言，聯合使用8-羥色胺、MDA、維生素C和維生素E來區分OPMD與正常健康組織的敏感性和特異性明顯高于單獨使用生物標記物的方法，目前該技術已經被提出用于口腔癌前病變和癌癥的早期檢測[48]。

維生素C在水中的溶解性使其具有在細胞內外發揮對抗自由基作用的優勢，可以保護宿主細胞免受感染引起的OS[49]。Nicolae等[49]研究發現與無感染的LP患者相比，伴感染的LP患者尿中維生素C濃度顯著降低，且隨著病程的加重，維生素C濃度逐漸降低。此外在動物模型中發現，吞噬細胞和淋巴細胞中的抗壞血酸濃度明顯高于細胞外液中抗壞血酸的濃度，進一步證明了維生素C可增強宿主細胞對感染的抵抗能力[49]。Abdolsamadi等[34]研究發現，在排除了年齡和性別等混雜因素后，OLP患者唾液中MDA明顯升高，總抗氧化能力(TAC)以及抗氧化維生素A、C和E明顯降低，并出現糜爛型病損，提示OS的增加和抗氧化防御能力的降低是糜爛型OLP易感性的潛在決定因素。另外，維生素C還可作為代謝途徑的中間產物參與到OS過程中，促進代謝重排和腫瘤進展，維生素C水平降低激活了ROS和OS的發生，高水平的OS導致核酸(8-羥基脫氧鳥苷)、蛋白質(蛋白質羰基)和脂質(8-異前列腺素F2α)及其代謝標志物(葡萄糖、總膽固醇和總蛋白)的氧化損傷，使癌細胞具有更強的侵襲性，并啟動細胞分裂以促進疾病的發展[50]。

維生素C會根據濃度梯度的不同在口腔環境中發揮雙重作用。生理濃度的維生素C可以減輕自由基和活性中間體產生的有害影響。然而，近年來發現它還具有雙峰活性，在高濃度的情況下，維生素C可以通過還原過渡金屬在體內加劇OS，起到促氧化劑的作用[49]。維生素C的促氧化理論顯示，H2O2的生成量會隨著維生素C含量的增加而增加，具有強氧化性的H2O2能夠誘導癌細胞的DNA損傷，啟動癌細胞死亡[51]。

2.3 其他維生素的抗氧化作用

2.3.1 維生素B復合體 維生素B復合物由8種水溶性成分組成：硫胺素(VB1)、核黃素(VB2)、煙酸(VB3)、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、生物素(VB7)、葉酸(VB9)和鈷胺(VB12)，它們在蛋白質、脂質和核酸合成，新陳代謝和免疫防御等方面相互聯系，相互配合[52]。每種維生素B都被證明有較強的抗氧化能力[52]。Chen等[53]發現，血紅蛋白、鐵或維生素B12缺乏以及血同型半胱氨酸水平異常升高與OLP有顯著關聯，且糜爛型病損平均血同型半胱氨酸水平更高。鐵、維生素B12缺乏可導致貧血，由于血紅蛋白的降低，血液向口腔黏膜組織輸送氧氣的能力亦下降，最終導致口腔黏膜萎縮。糜爛型OLP患者較高的血同型半胱氨酸水平會引起OS，增加口腔上皮細胞供血小動脈的血栓形成，進而破壞口腔上皮屏障，從而增加糜爛型OLP的發生頻率。研究發現，OLP患者的高血同型半胱氨酸水平可能與維生素B6、B12以及葉酸缺乏有關，該指標的升高已作為判斷維生素B復合體參與抗氧化應激的重要標志[53]。雖然在大多數情況下，復合維生素的經驗性補充在一定程度上能夠改善患者的主觀癥狀，但調查顯示維生素B1、B6、C、葉酸、胡蘿卜素的缺乏并不是OLP的主要致病因素，一些研究發現在強化補充復合維生素的兩個月中，無患者得到完全恢復[54]。

2.3.2 維生素D 維生素D是一種脂溶性維生素，其亞型7-脫氫膽固醇、膽鈣化醇、維生素D2和骨化三醇能夠通過減少脂質過氧化表現出抗氧化特性[55]。已有的研究證實，維生素D缺乏與OLP風險增加密切相關[56]。1，25-二羥基維生素D3(1，25(OH)2D3)是維生素D的活性形式，其生物學功能主要受特異性核激素受體維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)的調節，VDR在多種組織的上皮細胞中均有顯著表達[56]。在體外培養的HaCat細胞模型中證實，依賴維生素D受體的1，25(OH)2D3能夠通過調節NF-κB信號通路來對抗脂多糖誘導的炎性細胞因子過度表達來減緩OLP的炎癥過程[56-57]。與此同時，維生素D在降低黏膜DNA氧化損傷方面也發揮著重要作用。研究發現，補充外源性維生素D能夠顯著改善潰瘍性結腸炎患者血清中OS指標(氧化型低密度脂蛋白、過氧化脂質、MDA和超氧化物歧化酶)，對腸黏膜OS損傷有良好的修復作用。口腔是消化道的起點，表達于口腔角質形成細胞中的VDR與維生素D特異性結合也可以通過降低OS水平和清除ROS，修復受損的口腔黏膜上皮屏障，促進病損愈合[58-59]。1，25(OH)2D3-VDR信號通路在維持口腔黏膜組織完整性中具有保護性作用，由此推測補充維生素D可能是治療OLP病損的一種潛在策略。

3 小 結

綜上所述，OPMD與OS之間存在密切聯系。微量營養素主要以直接抗氧化劑(如維生素A、C和E)或作為抗氧化酶的組成部分(如Cu、Zn、Se)發揮抗氧化作用。微量營養素水平的改變可以通過調控相關轉錄因子及其信號通路參與機體炎癥和OS反應。