急性肝衰竭動物模型的研究進展

龍富立，林 鏞，彭子明，馮 逢，張建玲，毛德文，韋艾凌,3

1 廣西中醫藥大學研究生學院，南寧 530200； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病科，南寧 530023； 3 廣西中醫藥大學成人教育學院，南寧 530001

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由多種原因引起的肝細胞大量壞死，肝功能嚴重障礙，以其病情進展迅速、惡化嚴重及高病死率為顯著特征，為患者和社會帶來嚴重負擔[1]。治療上肝移植能有效降低患者病死率，但由于費用高昂和肝源缺乏，仍以內科及人工肝為優先選擇，但病死率居高不下。迄今為止，對于ALF的發病機制尚未明確，而符合ALF表現的高質量動物模型仍然缺乏，想要深入了解ALF發病機制、探求更加有效的治療方式、提高患者生活質量，制備與臨床發病相似并可復制的動物模型尤為重要。

1 實驗動物

1.1 嚙齒動物 嚙齒動物在ALF造模中最為廣泛，大鼠品系一般以 Wistar 和 SD 為主，小鼠以 ICR、C57BL/6J、KM在研究實驗中最為常見，也有其它品系鼠類在研究中出現，可以看出ALF造模對鼠類品系無嚴格要求。

1.2 兔、豬、犬 兔、豬、犬制備有手術和藥物兩種造模方式，因中大型動物手術對體內觀察情況較為直觀，是研究肝膽外科疾病良好的動物模型，其手術模型多用于試驗新型人工肝支持系統，化學藥物模型常用于研究ALF發病機制和組織病理變化等。

1.3 非人靈長類 研究[2]表明，非人靈長類動物肝臟發育和內環境變化與人類極其相似，其模型在臨床上與 ALF 患者的臨床特征、肝臟指標、組織病理學和壽命等表現出相似的變化，常用于深入研究ALF發生的潛在機制及新型病毒基因型試驗研究[3]。

2 造模方法

常見的ALF造模方法有化學或藥物、手術、手術結合藥物、感染等。化學藥物建模包括D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、硫代乙酰胺( thioacetamide，TAA)、對乙酰氨基酚 (acetaminophen，APAP)、四氯化碳 (carbon tetrachloride，CCl4)、刀豆球蛋白A(CONA)、卡介苗、鵝膏蕈堿等。手術建模包括肝缺血模型和肝切除(次/全)模型。不同的建模方法涉及不同的實驗流程，每種動物模型各有優勢，但同時存在一定的不足。

2.1 化學或藥物模型

2.1.1 對乙酰氨基酚(APAP)

2.1.1.1 原理 APAP通過誘導細胞氧化應激增強、線粒體功能障礙導致肝細胞壞死，而其中線粒體功能障礙是APAP誘導 ALF 模型成功的主要機制，其通過抑制線粒體 ATP 酶活性，并對線粒體超微結構造成損傷[4]。

2.1.1.2 造模方法 (1)嚙齒動物：以750 mg/kg APAP腹腔注射小鼠，12 h后肝臟病理符合臨床ALF特征表現，提示造模完成[5]。(2)犬類：Ortega等[6]方法為在動物禁食12 h后，以500 mg/kg APAP每90 min靜脈注射，此方法48 h后肝臟典型病理為Ⅲ區呈肝小靜脈匯合性壞死，76 h內動物全部死亡，且具有臨床ALF生化和形態學特征。(3)豬類：Dargue等[7]予250 mg/kg APAP經豬十二指腸給藥，并使用0.5～4 g/h的維持量將血清APAP濃度維持在300 mg/L以上，造模成功指標為凝血酶原時間>3 s，模型病理呈現肝小葉到中部肝細胞變性壞死，血清指標與臨床APAP誘導的ALF相似，包括肝性腦病的跡象。

2.1.2 D-氨基半乳糖胺(D-GalN)

2.1.2.1 原理 D-GalN可快速消耗體內尿苷酸，使細胞器和酶的生成補充障礙，導致肝細胞出現不可逆的損傷。LPS能刺激肝臟巨噬細胞、Kupffer細胞等產生TNFα，破壞血管內皮的完整性，使肝細胞壞死[8]。而D-GalN又能加強LPS的急性毒性，所以D-GalN的單一用藥和D-GalN配合LPS使用均可誘導ALF模型。

2.1.2.2 造模方法 (1)D-GalN/LPS：①小鼠。吳小紅等[9]腹腔注射200 μl LPS (2.5 mg/kg) /D-GalN (0.3 g/kg)的生理鹽水溶液一次成膜，小鼠存活時間為8～12 h。②大鼠。龍富立等[10]予D-GalN(600 mg/kg)聯合LPS(20 μg/kg)腹腔注射大鼠一次成模，造模時間為48 h；Kitazawa等[11]腹腔注射 D-GalN(500 mg/kg)/LPS(50 μg/kg)3 h 后，可達到ALF水平。③豬類。彭承宏等[12]經門靜脈注射0.5 g/kg D-Ga lN和1 μg/kg LPS的方法建立ALF模型，約48 h造模完成，肝臟病理可見肝細胞壞死伴出血，7 d病死率為83%，造模后表現及生化指標皆與臨床相似，可輔助部分原位肝移植治療ALF的研究。(2)D-GalN：①大鼠。Zhang團隊[13]經過實驗后證實1.4 g/kg D-GalN劑量制備的大鼠ALF模型在血清組織學、臨床表現等方面與人類相似。②豬類。Zhang等[14]通過分離頸靜脈后行中央靜脈導管給藥，D-GalN劑量為1.2 g/kg，模型在24 h各血清和炎癥指標升高，48 h后成膜，其病理表現為肝小葉結構異常，Disse腔明顯擴張，并有肝細胞溶解性壞死和碎片樣壞死，模型動物死亡約72 h。③犬類。Patzer等[15]使用異氟醚麻醉后經靜脈注射1.5 g/kg D-GalN，血清指標在16 h明顯上升而核苷酸、氨、膽紅素含量則在32 h出現高峰，模型平均生存時間 43.7 h。④非人靈長類。Feng等[16]以小隱靜脈穿刺代替血管插管，注射2.5 g/kg D-GalN可誘導ALF模型，模型在5 d內全部死亡，病理顯示在壞死區域有肝細胞彌漫性腫脹，并伴有細胞變性；肝酶、TBil、炎癥指標及內毒素水平均符合臨床ALF表現，也存在治療窗口期。

2.1.3 硫代乙酰胺(TAA)

2.1.3.1 原理 TAA首先是使細胞氧化應激增加，促使氧化產物的積累，出現細胞壞死和肝損傷；其次是釋放促炎性介質引起炎癥傳播,使肝損傷進一步加重[17]。

2.1.3.2 造模方法 (1)小鼠。楊天翼[18]予200 mmg/kg TAA腹腔注射小鼠，一次成膜，小鼠病理血清、病死率均與臨床相似，但伴有明顯腸道損傷；(2)大鼠。毛德文等[19]采用10%TAA溶液6 ml/kg皮下注射，24 h后重復注射同等劑量，48 h可造模成功；張美華等[20]予不同劑量TAA研究藥物量效關系,發現250 mg/kg、350 mg/kg組肝性腦病發生率100 %。TAA為制備ALF常見藥物，腹腔注射建模劑量尚未統一，100 mg /kg、400 mg/kg、600 mg/kg等也均有報道，制備方式也均無小特殊，注意結合體質量及次數即可。

2.1.4 四氯化碳(CCl4)

雖然福州城市林業在數量指標上較高，但各區域在城市森林的均勻度方面差異還是比較大的，臺江是老城區，人口、建筑相對比較密集，城市綠地的比例相對較小，而倉山區、晉安區、馬尾區有嚴格的綠地規劃，其綠化覆蓋率與綠地率與人均公園綠地面積遠遠高于臺江區，鼓樓區雖然人口密集、建筑物較多，但區內有西湖公園、左海公園、溫泉公園等市級公園，故福州鼓樓區市民對其綠地感知差異不大，臺江區內綠地數量明顯不足，故臺江區市民在城市森林覆蓋率、均勻度、滿足精神需要等方面感知與其它各區域有顯著差異。

2.1.4.1 原理 CCl4進入機體經細胞色素P450激活后攻擊細胞膜上的磷脂分子，并與肝細胞膜脂質和蛋白質共價結合，破壞肝細胞膜結構和功能，影響蛋白質代謝和Ca2+內流增加，引起肝損傷及生化血液學的改變[21]。

2.1.4.2 造模方式 CCl4制備ALF模型有多種方式，而灌胃法CCl4直接經門靜脈作用于肝臟，建模以此法較為多見。(1)嚙齒動物。王歡等[22]以4 ml/kg的CCl4灌胃可誘導大鼠ALF模型；(2)豬類。Nardo等[23]以450 mg/kg劑量CCl4制備ALF模型研究體外門靜脈氧合作用，模型7 d病死率為100%，肝組織顯示60%～70%肝壞死；(3)犬類。采用CCl4聯合APAP，第1次予30%APAP(0.5 ml/kg)靜脈注射和40%CCl4(0.5 ml/kg)腹腔注射，12 h后重復給藥，劑量為第1次的1/2，可建立犬ALF模型。24 h病死率為0，76 h為90%，病理出現以中心靜脈為中心的大片壞死，壞死區充血及炎癥細胞侵潤等，肝損傷在24 h達到高峰[24]。(4)CCl4聯合LPS。前12 周連續腹腔注射 20% CCl4油溶液 5 ml /kg，每周 2 次，制備小鼠慢性肝損傷模型，12周+3 d后腹腔聯合注射 1 g/kg D-GalN 和 10 μg/kg LPS 制備ALF模型[25]。

2.1.5 刀豆球蛋白A(Con A)

2.1.5.1 原理 Con A激活T淋巴細胞使動物肝實質大量淋巴細胞浸潤(CD4+T、TNFα、IL-6為主)，導致肝組織壞死，門靜脈充血等特異性肝損傷[26]。此方法能較好地模擬人類病毒性肝炎、免疫性肝病等。

2.1.5.2 造模方法 高鈺迪等[27]通過小鼠尾靜脈注射20 mg/kg ConA約12 h建立ALF模型，總生存率為40%,病理呈現肝組織呈大塊壞死，肝細胞腫脹及大量炎癥細胞浸潤，轉氨酶、caspase-3、炎癥因子等均與臨床ALF相似；Li等[28]和朱鏐孌等[29]在研究中12 mg/kg和15 mg/kg ConA建立的模型也符合ALF臨床表現癥狀。ConA作為新近ALF造模藥物，建模動物選擇大都為小鼠，最佳劑量尚有待統一。

2.1.6 卡介苗

2.1.6.2 造模方法 Yang等[31]通過小鼠實驗報道，先經鼠尾靜脈注射卡介苗 2.5 mg/只，10 d后注射LPS 10 μg/只，可成功誘導小鼠急性肝損傷模型。

2.1.7 鵝膏蕈堿 Ishiguro等[32]以豬為實驗對象，采用Amanitin提取物α-氨基丁酸聯合LPS的方式成功建立ALF參考模型。Zhou等[2]以獼猴采用Amanitin結合內毒素建立ALF模型，在臨床表現、血清病理學等方面均與人類相似。

2.2 ALF手術模型

2.2.1 肝切除模型 (1)全肝切除模型：Filipponi等[33]手術方法為腹正中切口或右上腹肋緣斜切口進腹，先切斷肝周韌帶，然后整塊肝切除并行門-腔靜脈重新移植和門-腔分流。術中輸液以維持血流動力學穩定，術后予抗生素預防感染。從手術開始監測動物生命體征、顱內壓，按時段抽血觀察相關指標以檢測最佳ALF模型。Knubben等[34]對手術進行改進，方法是先植入Y形旁路行門-腔靜脈端側吻合及胸腔內腔靜脈吻合，然后進行肝切除術，其優勢在于不需要體外通道液體支持。全肝切除模型與ALF總體相似性不高，而且實驗結果的重現性、可逆性及應用均起到限制，現臨床使用不多。(2)部分肝切除模型：在手術方法上與全肝切除相類似，切除肝臟體積的70%～90%。Skawran等[35]手術切除豬70%的肝臟，并結合內毒素(400 μg/kg)構建ALF模型。Hung等[36]以兔為對象，摘除74%肝臟(三葉肝)后又結扎右外肝的肝蒂，適用于人工肝系統研究。Chen等[37]切除犬80%的肝臟制備ALF模型用以研究生物肝系統。占敏[38]、陳勇等[39]在切除85%、90%大鼠肝臟后可建立ALF模型。也有學者聯合藥物方法建模成功，曹友德等[40]報道的方法是一次性腹腔注射1000 mg/kg D-GalN和100 μg/kg LPS，同時加用乳果糖，3 h后使用戊巴比妥麻醉動物，隨后結扎切除肝左葉、右葉及尾葉共 50%肝組織，血清學表現與臨床相似，有較好的治療窗口期。

2.2.2 急性肝缺血模型 第一步，門-腔靜脈分流。開腹后分離門靜脈和下腔靜脈，再行端側吻合或側側吻合。第二步，肝動脈等肝血管阻斷。分流術后行肝動脈結扎，多數情況下為了保證不會出現新的側支循壞，常把膽總管、側支肝血管一并結扎[41]。也有報導聯合其他方法進行造模：Yuasa等[42]應用腹腔鏡在切除肝動脈后，通過門靜脈注射7.5 ml CCl4，結合門靜脈缺血誘導ALF模型，治療窗口為6.4 h。實驗能制備出較符合臨床的ALF模型，手術可逆性、重復性等較肝切除模型良好，但由于阻斷血流原因，其評估肝性腦病等神經系統變化方面存在不足。

2.3 感染模型 Tunon等[43]肌肉注射兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic diseaqse virus, RHDV)分離株2×104血凝單位，85%的兔子在36～54 h內死亡，36 h后兔模型出現血清組織學、腦部神經變化均符合臨床ALF癥狀。Crespo等[44]以同樣的方式進行研究，發現ALF模型的病毒復制和誘導的炎癥過程存在平行關系，而褪黑素可以通過抑制細胞自噬來降低RHDV RNA的復制發揮保護作用。

2.4 其他模型 Yamauchi等[45]注射人單克隆抗體(MoAb)誘發小鼠急性肝損傷，結果顯示，MoAb 與小鼠肝細胞發生交叉反應，并在肝細胞膜上識別出一個190 kD分子。模型在注射8 h后，血清組織學符合ALF表現。此方式證明注射自身抗體的方式也可誘發自身免疫性肝炎誘導急性肝損傷。

3 ALF模型評價

按照Terblanche和Hickman[46]提出的ALF理想動物模型應含有以下特點：有可逆性；模型有重復性；動物死于ALF；有適當治療窗口期；大型動物監測和建立體外循壞，指導臨床應用和效果評價；對環境、實驗人員危害最小。2000年Fourneau等[47]和Newsome等[48]作了三點補充：動物須有意識，可評估肝性腦病；生理代謝與人相似；符合倫理道德。然而就目前研究情況，尚未有滿足上述情況的ALF動物模型報道，現就以所查文獻結合上述評價標準做簡單評價。

通過上述造模方式可以看出嚙齒類藥物性ALF模型大都具有可逆性、重復性、動物死于ALF、有窗口期等標準，實驗具有重現性高、費用低等優勢，能很好的重現臨床相似的ALF癥狀，但生理代謝方面與人存在明顯的差異，行為意識上難以把握，在評估神經系統疾病上存在不足，所以該動物模型常用于內科對中西藥物機理和ALF發病機制的探討；嚙齒類動物手術模型對實驗要求嚴格，術中并發情況多，可逆性、重復性不高，手術建模尚不常用。兔、犬、豬藥物模型相比于嚙齒動物與人生理代謝相似度更高，具有一定神經系統表現指標、治療窗口期等優勢，但其價格和建模方法較嚙齒動物嚴格，兔、犬、豬手術模型可連續監測和建立體外循壞，常用于檢驗新型生物人工肝。RHDV感染兔模型能重現ALF相關特征，但兔與人類結構存在較大差異，其代表性仍有待商榷。從建模藥物上看，藥物模型以 D-GalN聯合LPS和CCl4最為常見，原因是其造模原理與臨床ALF發病機制相似，而且動物成模用時較短，易行性、重復性較高；手術模型上部分肝切除和肝缺血造模能重現較好的ALF癥狀，主要用于新型人工肝試驗。隨著科學技術的發展，手術結合藥物造模、ConA造模、Moab造模等新型方式不斷出現，研究人員可根據不同研究目的，選擇合適的建模方法。

4 展望與小結

目前，ALF的發病機制尚未完全明晰，給患者和社會帶來巨大的經濟負擔，建立良好的ALF動物模型對于發病機制和治療策略具有重要意義。但又因為人體與動物在結構上的本質區別，患病后藥物藥理作用、機體內環境變化、人文心理變化等方面有較大差別，對高質量動物模型帶來巨大的困難和挑戰。比如多種動物在神經系統方面無法很好觀察到符合人類的肝性腦病癥狀；同一方法在不同品種動物中所需的藥物劑量尚不統一；量效關系未明確等。綜上所述，制備一個高質量且可復制動物模型既必不可少，又充滿艱辛，需要在研究中開拓新思路、新方法，如采取現有多種造模方法聯合，取長補短；從基因組學、代謝組學、免疫組學模擬人體系統進行不斷嘗試；采用患者血清改造為造模藥物等。

作者貢獻聲明：龍富立、林鏞負責課題設計，資料分析，撰寫論文；彭子明、馮逢、張建玲參與收集數據，修改論文；毛德文、韋艾凌負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。