魚類低溫應激反應的調控機制

龍 勇 葛國棟 李西西 崔宗斌,

(1. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 廣東省科學院微生物研究所, 廣州 510070)

魚類的抗寒能力往往受遺傳、發育階段和熱經歷(Thermal history)等因素的綜合影響[1,2]。研究發現, 重要經濟魚類如羅非魚(Oreochromissp.)、大黃魚(Nibea albiflora)[3]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[4]和金頭鯛(Larimichthys crocea)[5]等均具有不耐寒的特點, 當寒潮來臨時經常被大量凍死,或因免疫力降低而導致大面積病害發生, 給水產養殖業造成巨大的損失。魚類在長期演化過程中形成了應對低溫脅迫的生理、生化和遺傳機制, 因此,可以通過解析對低溫應激反應和抗寒起關鍵作用的遺傳因子, 來研發增強魚類抗寒能力的技術方法。本文主要綜述了近年來魚類低溫應激反應與調控, 及抗寒性狀遺傳決定基礎方面的研究進展,為魚類生理和遺傳育種研究提供參考。

1 低溫脅迫造成分子、細胞和組織損傷

魚類遭遇急性低溫脅迫會產生分子、細胞和組織等多個水平的損傷作用[6]。溫度對核酸和蛋白質等細胞組分的結構和功能具有決定性影響[7]。在生理溫度條件下, 細胞表達與其環境溫度相應的酶和結構蛋白, 形成有利于實現各項生物學功能的細胞內穩態。當魚體遭遇低溫脅迫時, 核酸和蛋白質等生物分子不能正確折疊和組裝, 導致其活性降低[8]。低溫脅迫還能誘導活性氧(ROS)的產生, 對DNA和蛋白質造成氧化性損傷[6,9,10]。

在細胞水平, 低溫刺激可降低生物膜(包括細胞膜和細胞器膜)的流動性, 改變膜的結構, 影響膜及膜結合蛋白的功能[11,12]。在低溫條件下, 產生能量的速率降低, 導致細胞能量供應不足[13]。低溫影響微管蛋白的多聚化, 降低其穩定性, 從而破壞細胞骨架, 改變細胞形態[14]。另外, 低溫能誘導線粒體的超極化并使溶酶體膜的通透性升高[14]。低溫暴露還能引起脂肪的過氧化, 激活鐵死亡(Ferroptosis)等細胞死亡通路[9,15]。

在組織水平, 低溫暴露可降低心臟的收縮功能,導致組織缺血, 進而減少組織和細胞的氧氣供應,造成組織缺氧[6]。例如將鯉(Cyprinus carpio)從25℃直接轉移到15℃, 暴露90s后其腦部供血量即急劇降低[16], 從而影響神經系統的功能。在低溫脅迫條件下, 魚類鰓的呼吸和滲透壓調節功能受抑制[17], 離子平衡被擾亂[1]。低溫脅迫還降低魚體的免疫力[18,19]、組織的代謝率[20]及游泳和逃避捕食者的能力, 使其被捕食的風險增加[21]。無論在自然還是在養殖條件下, 冬季都會出現魚類大量死亡的事件, 其主要原因包括低溫應激、饑餓和疾病等[22],這些都與低溫對魚體造成的不利影響有關。

2 魚類的低溫應激反應及其調控機制

2.1 低溫信號的感知和傳遞

魚體通過對低溫刺激產生應激反應, 建立新的生理、生化和代謝穩態來增強抗寒能力, 這一過程稱為“低溫適應(Cold acclimation)”。機體和細胞必須感受到低溫刺激, 并將刺激信號傳遞至細胞核才能啟動低溫應激反應。在低溫信號的感知方面, 細菌細胞利用mRNA分子中特定的二級結構作為溫度感受器, 控制轉錄本在不同溫度條件下的翻譯效率[23]。真核細胞對低溫信號的傳遞主要依賴鈣離子信號系統, 低溫脅迫激發細胞外鈣離子的內流,進而激活相關的蛋白激酶和轉錄因子[24,25]。離體培養的昆蟲組織利用鈣離子信號感知低溫刺激和激活下游的“快速低溫強化(Rapid cold hardening,RCH)”機制, 使用特異性抑制劑抑制鈣離子的內流、鈣調蛋白的激活和鈣調蛋白依賴激酶Ⅱ(CaMKII)的活性都能消除RCH的抗寒效應[24]。脊椎動物下丘腦的視前區是控制溫度感知和體溫調節的區域,其接收來自外周溫度感受器的信號, 調控各種生理和行為的熱調節反應(圖 1)[26]。瞬時受體電位離子通道TRPM8是在哺乳動物中發現的低溫感受器, 其在感覺神經元中特異性表達, 低溫刺激時能迅速開放, 介導鈣離子的內流[25]。Trpm8敲除的小鼠仍然能感受低溫刺激, 說明動物細胞中還存在其他的低溫感受器[27]。有研究發現, 在小鼠(Mus musculus)下丘腦中表達的環核苷酸門控離子通道CNGA3也是一個低溫感受器[28]。

魚類的中樞神經系統也參與對低溫刺激的感知和低溫信號的傳遞。鯉下丘腦的視前區在受到降溫刺激后30s被激活, 其周圍的內分泌神經元被激活后可以釋放促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH),誘導下游的生理反應[16]。通過遺傳篩選發現線蟲(Caenorhabditis elegans)的GLR-3基因具有低溫感受器的功能, 該基因編碼一個谷氨酸受體, 其在斑馬魚(Danio rerio)中的同源基因gluk2也具有傳遞低溫信號的功能[29]。離體培養的組織和細胞也能感受低溫刺激、傳遞低溫信號和啟動低溫應激反應[24,30],說明還存在不依賴神經系統和細胞自主的低溫感受器。魚類的低溫感受器還需進一步鑒定, 鈣離子信號系統在魚類低溫信號傳遞中的作用尚待深入研究。

2.2 內分泌系統在調控低溫應激反應中的作用

在受到外界刺激時, 魚類的下丘腦-垂體-腎間腺(Hypothalamus-pituitary-interrenal, HPI)軸被激活。首先, 由下丘腦釋放CRH激活垂體的促皮質細胞, 使其釋放促腎上腺皮質激素(ACTH); ACTH誘導腎間細胞釋放皮質類固醇激素(CS), 即初級反應;皮質類固醇激素進入血液系統后調控代謝、血液、滲透壓和免疫反應(次級反應), 進而引起個體生理和行為的改變(三級反應, 圖 1)[1,16,31,32]。

圖1 內分泌系統在調控魚類低溫應激反應中的作用Fig. 1 Functions of endocrinology system in regulating cold stress responses of fish

皮質醇是硬骨魚類主要的皮質類固醇激素。低溫暴露能迅速誘導魚類血漿中皮質醇含量上升[9,32]。例如, 將水溫在30min內從25℃降低到12℃顯著升高了奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus)血漿中皮質醇的含量[33]。血漿中皮質醇的含量與降溫的幅度成正相關[34], 因此常被用作魚體受刺激程度的指標[31]。皮質醇進入細胞后與細胞質中的糖皮質激素受體(GR)結合。GR與激素結合后被激活, 發揮轉錄因子的功能, 調控糖皮質激素反應基因的表達[32]。皮質醇在調控魚類的中間代謝、滲透壓和免疫中具有重要的作用[32]。低溫刺激后奧利亞羅非魚血漿皮質醇水平的升高與吞噬細胞的活性被抑制有關[33]。皮質醇在魚類應激反應中的主要作用可能是調控能量的再分配, 促進糖異生以增加細胞能量供應; 同時抑制生長和免疫等耗能的生物學過程,從而增強細胞抵抗環境脅迫的能力[35]。目前, 皮質醇等糖皮質激素在調控魚類低溫應激反應和抗寒能力形成中的作用和機制還不清楚。

甲狀腺素也參與調控魚類的低溫適應。斑馬魚在18℃低溫適應的同時, 用丙基硫尿嘧啶(PTU)處理抑制甲狀腺素的合成, 能影響能量代謝相關基因的表達和降低低溫適應對個體持續游泳能力的增強作用[36]。抑制甲狀腺素的合成使個體持續游泳的能力降低, 主要表現為尾部擺動頻率下降, 這可能與肌肉組織中肌漿網鈣離子ATP酶(SERCA)活性降低和肌球蛋白重鏈的表達水平下降有關[37]。甲狀腺素在斑馬魚低溫適應過程中還能通過影響心率和SERCA的活性來增強心臟的功能[38]。

2.3 低溫誘導的轉錄反應及其調控機制

細胞接收到低溫信號以后, 通過對基因表達進行精細的調控, 從而建立新的胞內穩態, 修復低溫應激造成的分子損傷, 清除受損嚴重的細胞, 增強機體的抗寒能力。在低溫脅迫時, 魚類的中樞神經系統感受低溫刺激。作為低溫感受器的離子通道被激活, 使鈣離子進入細胞內。胞內游離鈣離子濃度升高, 激活相關的激酶, 進而使特定的轉錄因子發生磷酸化修飾而活化; 活化的轉錄因子進入細胞核激活下游基因的轉錄, 完成低溫信號的傳遞(圖 2)。

轉錄組研究是揭示魚類應激反應及其調控機制的重要手段。近年來, 應用基因芯片、RNA-seq和small RNA-seq等技術對多種魚類進行了研究, 鑒定低溫調控的基因、miRNA、lncRNA和轉錄本的可變剪接事件。研究的種類既有模式魚, 也有經濟魚類, 既有暖水性魚類, 也有冷水性魚類; 低溫處理方式有急性暴露, 也有慢性暴露; 刺激程度有溫和的、非致死的處理, 也有致死低溫暴露; 樣品的組織來源也多種多樣。雖然不同種類對低溫刺激的反應具有很大差異, 但鑒定到了低溫應激反應的標記基因, 如低溫誘導的RNA結合蛋白cirbp、高遷移率蛋白家族(hmgb)成員和硬脂酰輔酶A去飽和酶(scd)等, 這些基因在大多數情況下都能被低溫刺激誘導表達[39—42]。通過對低溫響應基因(Coldresponsive gene, CRG)進行基因本體(Gene ontology, GO)和信號通路富集分析發現, RNA剪接、轉錄調控、生物鐘節律和蛋白質分解代謝等是最具代表性的受低溫調控的生物學過程[18,39—41,43—45],FoxO信號通路在調控魚類抗寒能力的形成中具有重要作用[46]。不同組織對低溫刺激的反應既有共同的特征, 又有很高的組織特異性[39,44,45]。特定組織的低溫應激反應與其功能相關, 例如肝臟的CRG主要參與能量和脂肪酸代謝[4,5,47], 肌肉的CRG主要參與能量代謝和肌肉萎縮[39,48], 鰓的CRG主要參與離子調控[49]。

除了基因表達水平變化以外, 前體RNA發生低溫誘導的可變剪接, 產生不同的可變剪接體(圖 2),也是魚類低溫應激反應的重要組分[41]。在低溫條件下, 很多基因發生了可變剪接, 但是總的轉錄表達水平卻保持不變[41,50,51]。RNA-seq在檢測基因表達豐度的同時, 還能鑒定可變剪接和可變啟動子使用等轉錄調控事件。通過對羅非魚的42個RNA-seq數據集進行分析, 在腦和心臟中分別鑒定了483和208個低溫調控的可變剪接事件[50]。對底鳉(Fundulus heteroclitus)、三刺魚(Gasterosteus aculeatus)和斑馬魚的骨骼肌進行研究發現, 不同種類中發生低溫誘導可變剪接的基因數目為426—866,說明在低溫適應過程中大量的基因發生了可變剪接[51]。低溫誘導的可變剪接在調控擬南芥(Arabidopsis thaliana)的抗凍能力形成中具有重要作用[52],但在調控魚類抗寒中的作用和機制還不清楚。

研究魚類CRG的表達調控對于解析其抗寒能力建成的分子機制具有重要的意義。轉錄因子、miRNA和lncRNA是主要的轉錄和轉錄后調控因子。轉錄因子AP-1的結合元件在斑馬魚低溫誘導基因的上游序列中顯著富集, 轉錄因子Jun與Bcl6的復合體通過與AP-1元件相結合調控下游基因的表達[44]。研究者們應用small RNA-seq技術鑒定了魚類中受低溫調控的miRNA及其靶基因。在斑馬魚仔魚中發現dre-mir-29b調控低溫誘導基因per2的表達[53]。在鯉肝臟中發現, 高溫和低溫刺激調控相同的miRNA, 但是作用的方向相反; 這些差異表達的miRNA主要參與調控糖皮質激素代謝和胰島素信號通路[54]。在羅非魚的腎臟中發現miR-29a/122能調控scd基因的表達[55]。在斑馬魚ZF4細胞中發現低溫響應miRNA的靶基因主要參與磷酸化調控、細胞連接和細胞內信號傳導等生物學過程, 使用這些miRNA的抑制劑或類似物處理ZF4細胞, 可增強細胞的低溫耐受能力[56]。將致死低溫暴露后的大菱鲆(Scophthalmus maximus) 分為耐受組和敏感組, 同時檢測基因和miRNA表達, 鑒定了與抗寒能力相關的CRG和miRNA[57]。關于lncRNA調控魚類低溫應激反應的研究還很少。在斑馬魚ZF4細胞中鑒定了低溫調控的lncRNA, 這些lncRNA可能參與調控電子轉移、細胞黏附和氧化還原等生物學過程[58]。

2.4 低溫應激反應的蛋白質組和代謝組研究

在低溫條件下, 細胞優先翻譯包含特定序列的mRNA分子, 從而調整細胞的蛋白質組成; 低溫還誘導蛋白質的磷酸化和乙?；确g后修飾, 使其化學性質發生改變, 更有利于在低溫下發揮功能(圖 2)?；谫|譜分析的蛋白質組學技術極大地促進了低溫調控的蛋白質及蛋白質翻譯后修飾的鑒定。從蝦虎魚(Gillichthys mirabilis)的心臟中鑒定到37個受溫度影響的蛋白質, 這些蛋白質主要參與能量代謝、線粒體調控和細胞骨架組織等生物學過程; 在9℃低溫適應后, 蝦虎魚心臟肌酐激酶的表達豐度顯著上升, 說明磷酸肌酐能量系統在低溫條件下對心臟的功能具有重要作用[59]。在暗紋東方鲀(Takifugu fasciatus)的肝臟中發現了160個受低溫調控的蛋白質, 低溫誘導的RNA結合蛋白(CIRBP)、熱激蛋白90(HSP90)和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)是代表性的低溫誘導蛋白; 這些蛋白質富集的生物學過程包括氧化應激、線粒體酶和信號傳導等[60]。對金頭鯛的肝臟進行的定量蛋白質組研究發現, 低溫調控的蛋白主要參與分解代謝[61]。從鯉的血漿中鑒定了22個低溫誘導的蛋白, 這些蛋白質主要參與脂肪代謝和應激反應[62]。定量磷酸化蛋白質組研究從斑馬魚ZF4細胞中鑒定到702個低溫條件下發生差異磷酸化修飾的位點, 分布于510個蛋白質; 這些差異磷酸化蛋白與蛋白質定位、細胞內轉運和基因轉錄調控等生物學過程相關; 細胞外信號調節激酶(ERK1/2)是低溫適應過程中調控蛋白質磷酸化的關鍵激酶[30]。在斑馬魚仔魚上的研究也證明, 低溫刺激可激活ERK1/2和p38 MAPK(Mitogen-activated protein kinase, 絲裂原活化蛋白激酶), 抑制其活性可顯著降低仔魚抗寒能力[63]。蛋白質組研究結果為認識魚類抗寒能力建成的分子機制提供了數據支撐, 也為魚類低溫信號傳導機制研究提供了重要線索。

圖2 魚類低溫應激反應的遺傳調控Fig. 2 Genetic regulation underlying cold stress responses of fish

轉錄組和蛋白質組研究可揭示應激狀態下基因表達產物的結構和豐度等特征, 指示細胞代謝和生理狀態的變化趨勢, 而代謝組研究則檢測細胞和組織中各種代謝物的含量。代謝物是細胞生命過程的終產物, 代謝物水平被認為是細胞對環境變化所產生最終反應[64]。對金頭鯛的研究發現, 在降溫過程中(28d內將溫度從18℃降至11℃)肝臟的糖原、葡萄糖和ATP/ADP含量顯著降低; 在低溫維持過程中(11℃, 28d), 肝臟葡萄糖和ATP/ADP的含量回升; 而在恢復過程中(28d內將溫度從11℃升高到18℃)肝臟糖原和葡萄糖含量進一步升高[65]。對許氏平鲉(Sebastes schlegelii)血液的研究發現, 急性低溫刺激能引起脂肪酸代謝通路中相關代謝物水平的變化[66]。從大黃魚的肝臟中鑒定了受低溫和饑餓影響的代謝物, 這些代謝物主要與谷胱甘肽(GSH)代謝和不飽和脂肪酸合成等代謝通路有關[67]。對七彩神仙魚(Symphysodon aequifasciatus)的鰓進行了代謝組研究, 發現慢性低溫處理能激活抗氧化系統和GSH代謝[68]。以上研究結果表明, 能量代謝和抗氧化應激反應對魚類抗寒能力的建成具有重要影響。

2.5 低溫應激反應的“多組學”整合分析

機體和細胞的抗寒能力由不同類型的生物分子通過相互作用形成的網絡共同決定。因此, 進行“多組學”的聯合分析能有效地獲得與抗寒相關的效應基因, 更全面地解析魚類低溫適應和抗寒能力形成的分子調控機制。在對暗紋東方鲀的肝臟進行的“多組學”(轉錄組、蛋白質組和代謝組)分析中, 發現了36個共表達的差異表達基因(DEG)-差異表達蛋白(DEP)對, 19個變化方向相反的DEGDEP對, 及40個差異表達代謝物(DEM); 其中17個DEM和14個共表達的DEG-DEP對, 都參與脂肪酸代謝和膜轉運等生物學過程[47]。

2.6 表觀遺傳修飾對魚類抗寒能力形成的作用

低溫可誘導組蛋白發生乙?；确g后修飾,基因組DNA發生甲基化和去甲基化等修飾(圖 2)。大量研究關注魚類的“熱印記(Thermal imprint)[69]”,即發育的早期階段經歷的溫度環境對幼魚或成魚階段面臨溫度脅迫時產生反應的影響。斑馬魚胚胎期的培養溫度會影響成魚在低溫條件下的游泳能力、不同類型肌纖維的組成和肌肉組織對低溫刺激的轉錄反應[70]。金頭鯛胚胎和仔魚階段經歷的“熱印記”影響成魚對低溫脅迫的反應; 在低溫處理后, 金頭鯛血漿皮質醇、Na+、K+和葡萄糖水平,及骨骼代謝均受早期發育階段培養溫度的影響[69]。胚胎期的培養溫度還影響塞內加爾鰨(Solea senegalensis)和大西洋鱈(Gadus morhua)幼魚不同組織中miRNA的表達[71,72]。

這種“熱印記”的實質是個體的“熱經歷”使其基因組的相關位點發生了可以長期持續的表觀遺傳修飾。在三刺魚中研究了胚胎期的培養溫度和成魚期的適應溫度對肌肉DNA甲基化和基因表達的影響, 發現irs2b、klhl38b、gadd45ga和slc3a2a是對溫度刺激產生反應的代表性基因; 上調表達基因富集的生物學過程主要有細胞分裂、mRNA剪接和蛋白質降解, 下調表達基因富集的生物學過程主要包括細胞外基質組織和細胞黏附[73]。同時, 該研究還比較了差異表達基因和差異甲基化位點, 發現了324個低溫或高溫適應后與差異甲基化相關聯的差異表達基因[73,74]。該研究沒有發現與發育階段“熱印記”造成的差異表達基因相關聯的DNA甲基化位點, 可能“熱印記”的效應主要由其他類型的表觀遺傳修飾(如組蛋白乙酰化等)決定[73]。

2.7 魚類抗寒相關基因的功能研究

雖然通過組學研究已經鑒定了大量的CRG, 但對這些基因在調控魚類抗寒性狀中的功能卻知之甚少。目前, 已有研究者應用轉基因、轉座子介導的基因捕獲和CRISPR/Cas9技術, 建立了轉基因、基因插入失活和基因敲除的斑馬魚品系, 來研究目的基因在魚類抗寒中的功能。例如通過研制轉基因魚品系, 在斑馬魚肌肉中表達鯉的Ⅲ型肌酐激酶(M3CK), 顯著增強了其抗寒能力[75]。對斑馬魚grinaa基因轉座子插入失活突變體的研究發現, Grinaa能減輕低溫誘導的內質網應激和細胞凋亡, 從而提高魚體的抗寒能力[76]。另外, 還應用CRISPR/Cas9技術獲得了敲除自噬相關基因atg12和脂肪代謝相關基因cpt1b的斑馬魚品系, 發現這2個基因的突變都能降低斑馬魚的抗寒能力[77]。這些轉基因和基因突變的斑馬魚品系對研究目的基因在調控魚類抗寒中的功能和作用機制具有重要的意義。

3 其他因子對魚類抗寒能力的影響

3.1 低氧

在自然條件下, 由于棲息地的環境復雜多變,魚類往往會同時暴露于不同的環境刺激。對變溫脊椎動物來說, 暴露于不同類型的刺激, 都會造成組織缺氧和氧化應激[6]。溫度和低氧是對魚類生理功能具有重要影響, 且能相互作用的兩種環境刺激因子[78]。魚類在長期的演化過程中形成了對低氧和低溫等環境脅迫的適應能力。對斑馬魚仔魚的研究發現, 低氧適應(5%氧氣)能顯著增強個體對致死低溫(12℃)的耐受能力, 而低溫適應(18℃)卻使個體對致死低氧處理(2.5%氧氣)更加敏感[79]; RNA-seq分析結果表明, 低溫和低氧共誘導的基因主要參與氧化還原過程、氧氣轉運、造血、血紅蛋白合成和細胞離子平衡[79]。低溫和低氧脅迫都能誘導細胞和組織產生ROS[80,81]。急性低溫暴露誘導斑馬魚肝臟產生氧化應激, 投喂含α-硫辛酸或GSH等還原劑的飼料可以顯著降低低溫引起的氧化應激, 進而減輕組織損傷, 增強抗寒能力; 而H2O2處理誘導氧化應激則能降低斑馬魚ZFL細胞的耐寒能力[82]。

3.2 鹽度

鹽度是影響魚類生理的一個重要環境因子。降河洄游魚類會同時遭受高鹽度和低溫刺激[83]。水體鹽度對遮目魚(Chanos chanos)的抗寒能力具有明顯的影響, 在海水中適應的個體與在淡水中適應的個體相比, 抗寒能力顯著增強[84]。低鹽度刺激可能通過影響低溫條件下遮目魚肝臟糖原的分解代謝[85]、ATP合成[86]和鰓的離子調控[84], 來影響其抗寒能力。對刀鱭(Coilia nasus)同時進行高鹽度和低溫刺激, 發現神經遞質、受體和調控蛋白可能在洄游中起著重要的調控作用[83]。

另外, 一些低溫響應基因能被多種環境刺激誘導表達。如斑馬魚nr1d4a和nr1d4b基因能被重金屬、缺氧和高鹽度處理誘導表達[87]。這些能被多種環境刺激的誘導表達的基因可能代表細胞應激保護機制的核心模塊, 低氧和鹽度等環境刺激因子可能通過調控這些基因的表達影響魚類的低溫應激反應和抗寒能力。

3.3 饑餓和營養

低溫脅迫會降低魚的攝食率, 引起饑餓[77]。雖然長期的饑餓會導致能量耗竭, 但是一定水平的饑餓不僅可以優化營養物質代謝, 還可以通過增強自噬減輕細胞損傷[88]。研究發現, 饑餓48h能顯著增強斑馬魚的抗寒能力; 脂肪分解代謝和自噬的激活在禁食誘導的抗寒效應中起著關鍵作用; 另外, 抑制mTOR信號通路可以起到與禁食一樣的抗寒效果, 而激活mTOR信號通路則能減弱抗寒效應[77];根據該研究的結果, 養殖生產中適當禁食可以作為提高魚類抗寒能力的策略[77]。飼料的營養成分, 如脂肪的來源也能影響魚類的抗寒能力。尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)攝食添加玉米油或玉米油與魚油混合物(1∶1)的飼料時, 與添加魚油或可可油的飼料相比, 抗寒能力顯著增強[89]。該研究結果說明可以通過營養調控來增強羅非魚的抗寒能力。

4 遺傳多樣性與魚類的抗寒性狀

魚類等水產動物大多數都處于家養馴化的早期階段, 種內遺傳多樣性豐富, 可以通過遺傳篩選獲得顯著的性狀改良效應[90]。很多養殖魚類有眾多地方品種和選育品系, 不同的品種在體色、鱗片和體型等形態特征和應對環境脅迫的能力方面具有明顯差異。例如, 對于我國主要養殖魚類之一的鯉而言, 北方的黑龍江野鯉和人工培育的松浦鏡鯉都具有很強的耐寒能力, 可以在冬季長期冰封的池塘中生存, 但鯉的近緣種柏氏鯉(Cyprinus pellegriniTchang)卻對低溫非常敏感[91]。研究者們曾經嘗試應用RAPD(隨機擴增多態性DNA)和SSR(簡單重復序列)等標記定位鯉耐寒相關QTL位點[91,92];但由于檢測通量小, 標記數目不足, 遺傳圖譜不完全, 鑒定到的標記難以定位到染色體上[91]。因此,迄今尚未克隆到決定鯉耐寒能力的關鍵基因或調控元件。

最近的研究發現,hsp70和hmgb1基因序列中的單核苷酸多態性位點(SNP)與牙鲆(Paralichthys olivaceus)的抗寒能力顯著相關[93], 其中hmgb1是多種魚類中受到低溫刺激時高水平上調表達的標記基因[39,40]。對底鳉肌肉組織的研究結果表明, 線粒體的基因型對低溫應激條件下的基因表達也有一定影響[94]。研究核基因組和線粒體基因組遺傳多樣性與魚類抗寒能力的關系有望開發抗寒相關的分子標記, 促進魚類的抗寒育種。

5 展望

在應用各種組學技術開展的魚類低溫應激反應研究中, 發現了大量的低溫響應基因, 但是大部分基因的功能都還不清楚。在斑馬魚等模式魚上,應用基因工程和基因編輯技術研制轉基因、基因敲除和基因定點編輯的品系, 可以為系統解析目的基因的作用機制提供研究模型。在經濟魚類中, 可通過全基因組關聯分析(GWAS)和數量性狀位點(QTL)定位等技術鑒定影響抗寒能力的關鍵變異位點和分子模塊, 開發分子標記, 開展主要養殖品種的分子標記輔助抗寒育種。另外, 根據模式魚中抗寒相關基因的作用機制及關鍵位點的精細定位等研究結果, 對經濟魚類相應的基因及其調控序列進行定點編輯, 有望使其耐寒能力顯著增強。