陸地棉與金花葵花朵差異代謝物篩選與分析

甄軍波 宋世佳 劉琳琳 劉 迪 歐陽艷飛 遲吉娜*

(1.河北省農林科學院 棉花研究所/農業農村部黃淮海半干旱區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室,石家莊 050051; 2.河北省農林科學院 人事處,石家莊 050051)

植物能產生數量眾多的代謝物，這些代謝物在植物生長發育、應對生物脅迫和非生物脅迫的過程中發揮著重要的作用，同時，代謝物也是連通植物基因型和表型的重要“橋梁”[1-3]。棉花和金花葵的花在形態上有很高的相似度，本研究室前期開展的金花葵轉錄組測序結果表明，金花葵基因和棉花基因序列具有很高的相似度，組裝的Unigene比對物種相似度最高的是雷蒙德氏棉(28.83%)，其后依次是陸地棉(18.89%)、亞洲棉(16.31%)，合計有64.03% 的Unigene與棉花的序列有很高的相似度，可見，兩者具有很近的親緣關系。

棉花是世界上重要的纖維和油料作物，同時也是鹽堿地改良的先鋒作物，我國已經是世界上最大的原棉生產國，新疆是我國最大的棉花種植區域和原棉生產區[4-6]。近年來，隨著勞動力等棉花種植成本的增加，植棉效益有所下降，因此，積極開拓棉花利用的新途徑，提高棉花產品的利用率，將有利于提高棉花種植的經濟效益[7-8]。棉花作為半木本植物，秸稈是棉花重要的副產品之一，其有機物含量高，是一種豐富的可再生資源[5]，秸稈資源豐富、價格便宜，還是食藥用菌栽培基質的重要來源[9]。

金花葵又名菜芙蓉和野芙蓉，為一年生草本植物，花朵可加工成花茶，莖和葉片可加工成粉，作為食品添加劑使用[10]。研究表明，金花葵富含黃酮、有機酸、核苷類、氨基酸、多糖、維生素E、礦物質、多種微量元素和植物纖維[11-15]。黃酮類物質等成分具有解熱消炎、鎮痛，抗氧化和降血脂等多種藥理活性作用，有機酸類成分、核苷類物質具有抗氧化，抗病毒，抗腫瘤，抗血小板凝集等多種藥理活性，多糖則具有免疫調節和抗腫瘤活性[10,14,16]，雖然還沒有被收入藥典中，但是金花葵兼具食用、藥用和保健功能，具有較高的營養價值。

由于棉花的無限生長習性[17]，棉花花朵也是可利用的資源之一。目前，關于棉花代謝物的研究中，更多的是研究代謝物在棉花抵御病蟲害過程中發揮的作用[18-21]，而對于棉花花朵中的有益代謝物以及利用價值的研究鮮見報道。本研究利用代謝組學分析陸地棉和金花葵的花朵中共有代謝物和差異代謝物，旨在探明棉花花朵中潛在的有利用價值的代謝產物，以期為提高棉花綜合利用率提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料均種植于河北省農林科學院棉花研究所小安舍實驗站，所用陸地棉材料為研究室多年自交非轉基因材料‘JZ-1’，取開花當天10：00的花朵，金花葵的花取自‘冀金葵1號’開花當天10：00的花朵，每組樣品3次生物學重復。采集的樣品送邁特維爾(武漢)生物科技有限公司開展代謝組學檢測。

1.2 代謝組學統計分析

參考Chen等[22]和戴宇樵等[23]的方法，基于邁維自建數據庫MWDB(Metware database)，根據二級譜信息進行物質定性，利用三重四級桿(QQQ)質譜多反應檢測代謝物數據。以差異倍數(fold change)≥2.0或者差異倍數(fold change)≤0.5，結合OPLS-DA模型中VIP≥1.0篩選差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 主成分分析

在主成分分析中，第一主成分的貢獻率為76.12%，第二主成分的貢獻率為8.46%，2種主成分貢獻率之和為84.58%，表明2種主成分能夠反映陸地棉和金花葵樣品的主要特征信息。由圖1可見，在OPLS-DA模型中，代謝物越靠近左下角和右上角，表明其差異性越顯著。

2.2 代謝組學篩選

通過代謝組學分析，在陸地棉和金花葵中共檢測到代謝物465個，有196個代謝物在兩者之間差異不顯著，篩選到差異顯著表達代謝物269個，主要包含黃酮類(92種)、氨基酸及其衍生物(36種)、酚酸類(35種)、脂質類(29種)、生物堿類(20種)、有機酸(12種)、鞣質(12種)、核苷酸及其衍生物(10種)、木脂素和香豆素(5種)以及萜類(1種)和其他類(17種)。在陸地棉中117種代謝物的含量高于金花葵，僅在陸地棉中檢測到的代謝物有41種(表1)；在金花葵中152種代謝物含量高于陸地棉，僅在金花葵中檢測到的代謝物有29種。

2.3 差異代謝物KEGG富集分析

由圖2可知，共有123個差異代謝物被注釋到68個KEGG代謝通路上，陸地棉和金花葵花朵差異表達代謝物主要集中于代謝、次生代謝物合成、黃酮及黃酮醇合成、類黃酮生物合成、氨基酸生物合成及苯丙烷生物合成等代謝通路。

2.4 黃酮類物質

由表2可知，在陸地棉和金花葵的花中，共檢測到黃酮類物質132種，有92種黃酮類物質在兩者之間存在顯著差異。在金花葵中36種黃酮類物質含量高于陸地棉，有13種黃酮類物質僅在金花葵中檢測到，差異最小的為二氫楊梅素(蛇葡萄素)，是陸地棉含量的2.2倍，差異最大的為異鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖苷，是陸地棉含量的2.58×106倍。在陸地棉中56種黃酮類物質含量高于金花葵，有19種僅在陸地棉中檢測到，差異最小的為金圣草黃素 O-乙酰基己糖苷，是金花葵含量的2.2倍，差異最大的是兒茶素-(7,8-bc)-4α-(3,4-二羥基苯基)-二氫-2-(3H)-吡喃酮，是金花葵含量的2.4×106倍。陸地棉和金花葵的花中均檢測出具有藥用價值的金絲桃苷和槲皮素，這2種物質在陸地棉和金花葵花中的含量差異均不顯著，但是金花葵中的蘆丁是陸地棉含量的7.5倍，楊梅素含量是陸地棉含量的7.0倍。可見，陸地棉的花中也含有種類豐富的黃酮類物質。

，代謝物VIP≥1.0；，代謝物的VIP<1.0 ， Metabolite VIP≥1.0； ， Metabolite VIP<1.0圖1 陸地棉和金花葵花朵中代謝物的OPLS-DA S點圖Fig.1 OPLS-DA S-plot map

表1 僅在陸地棉中檢測到的代謝物Table 1 Metabolites only detected in Gossypium hirsutum L.

表1(續)

圖2 KEGG代謝通路富集情況Fig.2 Enriched column map of KEGG

表2 陸地棉和金花葵中差異顯著的黃酮類物質Table 2 Flavonoids detected with significant difference in Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

表2(續)

表2(續)

2.5 氨基酸及其衍生物

由圖3可知，在陸地棉和金花葵的花中共檢測到56種氨基酸及其衍生物，其中共有36種氨基酸及其衍生物含量差異顯著。金花葵和陸地棉的花中均檢測到7種人體必須氨基酸，但是金花葵中的含量比陸地棉更高。陸地棉中含量比金花葵中高的氨基酸及其衍生物有4種，分別為順式-4-羥基-D-脯氨酸、L-無水天冬酰胺、N-乙酰蘇氨酸和組胺，陸地棉花朵中含有很多重要藥用和食用價值的氨基酸及其衍生物。

圖3 陸地棉和金花葵花朵中氨基酸及其衍生物之間的差異Fig.3 Differences between amino acids and derivatives in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

2.6 酚酸

在陸地棉和金花葵的花朵中共檢測出酚酸類物質66種，其中31種酚酸類物質在陸地棉和金花葵之間差異不顯著，包括阿魏酸、丁香酸和綠原酸等物質。由圖4可知，陸地棉中的肉桂酸、對香豆酸和咖啡酸等肉桂酸型酚酸的含量高于金花葵；對羥基苯甲酰蘋果酸、短葉蘇木酚酸、水楊酸芐酯、對-香豆醇、肉桂酸、香豆醛和岷江百合苷等7種物質僅在陸地棉的花中檢測到；金花葵中的芥子酸和香草酸含量更高；芥子酸甲酯、松果菊苷、芥子酰咖啡酰酒石酸、西伯利亞遠志糖A5、芥子酰葡萄糖醛酸和松柏苷僅在金花葵的花朵中存在。

2.7 生物堿、有機酸、脂質和核苷酸及其衍生物

由圖5可知，金花葵的花朵中富含生物堿，共檢測到生物堿類物質24種，有13種生物堿含量高于陸地棉，包括藥用成分鹽酸多巴胺。陸地棉中有7種生物堿的含量比金花葵高，其中包括有藥用價值的色胺。

由圖6可知，金花葵的花中有機酸含量豐富，富含富馬酸、酒石酸和莽草酸等具有藥理作用的有機酸；陸地棉中2種有機酸比金花葵的花含量高，分別為辛二酸和奎尼酸；16種有機酸在陸地棉和金花葵中差異不顯著。

由圖7可知，在金花葵和陸地棉的花朵中，有29種脂類物質的含量差異顯著，32種脂類物質的含量差異不顯著，金花葵中含有種類豐富的溶血磷脂，陸地棉中溶血磷脂酰膽堿18∶4(18表示碳原子數目，4表示不飽和鍵數目)的含量比金花葵高。此外，金花葵和陸地棉均富含有益人體健康的不飽和脂肪酸，如亞油酸和亞麻酸等。核苷類成分是生物維持生命活動的重要物質，尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、胸苷、胞苷、尿嘧啶核苷、2-脫氧腺苷、腺苷和鳥苷等物質在陸地棉和金花葵中的含量差異不顯著，有10種核苷類物質在金花葵和陸地棉中的含量存在顯著差異(圖8)，陸地棉中脫氧胞苷和鳥嘌呤的含量更高。

圖4 陸地棉和金花葵花朵中酚酸之間的差異Fig.4 Difference between phenolic acid in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

圖5 陸地棉和金花葵花朵中生物堿之間的差異Fig.5 Difference between alkaloids in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

圖6 陸地棉和金花葵花朵中有機酸之間的差異Fig.6 Difference between organic acids in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

圖7 陸地棉和金花葵花朵中脂質之間的差異Fig.7 Difference between lipids in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

2.8 鞣質、木脂素和香豆素及其他物質

由圖9可知，陸地棉的花中有種類更加豐富的鞣質類物質，主要包括原花青素A3、棕兒茶素B3、檳榔鞣質B1、肉桂單寧和三兒茶素等原花青素，其中，檳榔鞣質A2、檳榔鞣質B1、肉桂單寧B2、三兒茶素、原花青素A3、原花青素C1、原花青素C2和棕兒茶素B3等8種原花青素僅在陸地棉中存在。

陸地棉的花朵中東莨菪苷、東莨菪內酯、5,7-二甲氧基香豆素含量比較高，金花葵中羅漢松脂素和松脂醇含量比較高，金花葵和陸地棉中均含有藥用成分七葉苷，見圖10。同時，還有一些物質被歸為其他類，包括棉酚、半棉酚、脫氧半棉酚等物質，在金花葵和陸地棉中的含量均有顯著的差異(圖11)。

3 討 論

陸地棉和金花葵同屬錦葵科植物，兩者的花在開花后的形態和顏色等方面很相似，棉花是世界上重要的纖維和油料作物，同時，棉花的棉籽殼、棉籽油和棉根皮都具有重要的藥用價值[24-25]，此前針對棉花開展的轉錄組和代謝組學的研究更多的集中于棉花的纖維發育[26]和體細胞再生[27]等方向，有必要對棉花的花開展代謝組學研究，以充分開發其潛在的藥用價值。

圖8 陸地棉和金花葵花朵中核苷酸及其衍生物的差異Fig.8 Differences between nucleotides and derivatives in flowers ofGossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

圖9 陸地棉和金花葵花朵中鞣質之間的差異Fig.9 Difference between tannins in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

圖10 陸地棉和金花葵花朵中木脂素和香豆素之間的差異Fig.10 Differences between lignans and coumarins in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

圖11 陸地棉和金花葵花朵中其他類物質之間的差異Fig.11 Differences between other metabolites in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

黃酮類物質是植物中非常重要的一類次生代謝物，Nix等[28]研究表明，棉花的花朵、葉片、根、莖、種子和棉鈴中均存在黃酮類物質，合計有52種黃酮類物質，其中棉花的花朵中黃酮類物質的種類最豐富。Xu等[29]利用靶向代謝組學對開花當天和開花后1 d棉花花朵中的黃酮類物質進行了鑒定，檢測出了7種黃酮類物質，包括異黃酮、花青素、黃酮醇、黃酮碳糖苷、兒茶素衍生物、黃烷酮和黃酮。該研究還表明，異槲皮苷是黃酮類中含量最高的成分，但并沒有檢測出查爾酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇和黃烷醇類物質。本研究結果表明，陸地棉和金花葵中均含有具有藥用價值的黃酮類物質，金絲桃苷是黃酮類中主要的藥用成分[15]，共檢測到9類黃酮類物質，包括查耳酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇、花青素、黃酮、黃酮醇、黃酮碳糖苷、黃烷醇類和異黃酮，并沒有檢測出兒茶素衍生物和黃烷酮類物質。不同研究檢測出的黃酮類物質的差異，可能與花朵的取樣時期不同有關，此外，隨著人們對于黃酮類物質研究的不斷深入和檢測技術的進步，一些新的黃酮類物質也在不斷增加，因此，棉花花朵不同發育時期黃酮類物質的代謝規律有待進一步研究。

除黃酮類物質外，棉花還富含其他種類豐富且具有一定藥用價值的代謝物，棉花的花朵中含有人體必須的7種氨基酸，阿魏酸和綠原酸等酚酸，酚酸具有抗氧化和抑菌等生物活性[30]，棉花中還含有含量更高且具有藥用價值的色胺[31]，陸地棉和金花葵也都含有豐富的有機酸和核苷類物質，以及有藥用價值的溶血磷脂[32]。此外，陸地棉的花中富含種類豐富的原花青素，原花青素在人體抗氧化、抗炎和抗菌等方面均具有非常重要的作用[33]，陸地棉也含有種類豐富的香豆素，陸地棉中這些具有潛在藥用價值的次生代謝物有待進一步開發和利用。

4 結 論

本研究利用代謝組學檢測陸地棉和金花葵開花當天的花朵中的代謝物，結果表明，金花葵在氨基酸及其衍生物、生物堿、有機酸、脂質和核苷酸及其衍生物等次生代謝物的種類和含量上比陸地棉的花朵更加豐富，陸地棉的花中含有的黃酮、酚酸、鞣質和香豆素等次生代謝物更加豐富，陸地棉的花朵中也檢測到有藥用價值的氨基酸及其衍生物、生物堿、有機酸、脂質和核苷類物質，這些物質都具有藥用價值。