攜載Ce6核殼納米粒的雙模態成像及光熱治療研究

盧佳慧，朱熹，黃天濠，劉雅文，倪晨，莊銀蘋，時梅林，胡俊峰

乳腺癌是女性最常見且致死率高的惡性腫瘤之一，發病具有年輕化的趨勢，起病隱匿的特征使得部分患者確診時已是癌癥中晚期，錯過了最佳的手術保乳時機。為了更好地控制病情的進展，早期診斷和及時治療對乳腺癌患者具有重要的臨床意義[1,2]。分子影像對病變的檢測具有極高的敏感性，可在分子或細胞層面檢測到腫瘤的發生和發展。目前，能否構建出新型分子探針，實現在細胞層面上對乳腺癌發生發展的可視化檢測，并對早期治療進行指導，是當前分子影像學在乳腺癌的診療中亟待解決的熱點問題[3]。活體MRI不受組織深度的影響，可以較好地觀察組織器官的內部結構，適用于絕大多數腫瘤的成像。活體熒光成像由于熒光穿透深度有限，主要應用于表淺性腫瘤的成像。光熱治療則是憑借光熱轉換劑可在近紅外激光下吸收能量并轉換為熱能的性能，通過提高局部溫度來殺傷癌細胞的一種腫瘤治療策略，具有侵入性小、選擇性高以及可控性強的優點[4]。但其穿透深度不足，因此主要適用于表淺腫瘤(如乳腺癌，黑色素瘤等)的早期治療。乳腺癌屬于表淺性腫瘤，在實現活體熒光成像及光熱治療上具有獨特的優勢。

本研究擬構建一種新型診療納米粒子--介孔二氧化硅(mesoporous silicon,MSN)-聚多巴胺(polydopamine,PDA)核殼納米粒子(MSN-Ce6@PDA-Gd nanoparticles,MSN-Ce6@PDA-Gd NPs)，以實現乳腺癌的分子影像及光熱治療。此新型納米粒子所借助的核殼納米載體介孔二氧化硅-聚多巴胺具有生物相容性好、負載能力強的優點，既可穩定遞送熒光成像劑二氫卟吩e6(chlorine e6，Ce6)，亦具有能進行磁共振T1WI的釓離子(Gd)，并憑借聚多巴胺具有光吸收和熱轉換的性能。本研究中對此新型診療納米粒子在體內、外行磁共振-熒光雙模態成像的潛能以及介導光熱治療乳腺癌的效能進行了探討。

材料與方法

1.實驗材料

主要試劑中十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammoniumchloride，CTAC)、氯化鈉、三乙胺、環己烷、正硅酸四乙酯和甲醇，均購于國藥集團化學試劑有限公司(中國)；二氫卟吩e6購于Frontiersci公司(美國)；鹽酸多巴胺購于Aladdin公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷和氯化釓(GdCl3·6H2O)購于Sigma-Aldrich公司(美國)。

試驗設備和材料：德國Sigma 3-30KS離心機；美國DMI3000B透射電子顯微鏡；英國Nano ZS90馬爾文粒徑分析儀；UH4150紫外可見分光光度計；德國Leica倒置熒光顯微鏡；美國Biotek酶標儀；GE Discovery 750W 3.0T磁共振儀和GE AW4.6后處理工作站；PSU-Ⅲ型激光器；美國Fotric紅外熱成像儀；美國Bio-Rad熒光成像系統。

實驗動物：雌性健康無特定病原體級昆明小鼠6只(鼠齡6周)以及雌性BALA/C裸鼠6只(鼠齡6周)，均購于徐州醫科大學動物實驗中心。動物實驗均嚴格按照徐州醫科大學實驗動物倫理道德管理委員會的規定進行。

2.藥物制備和性能檢測

氨基化介孔二氧化硅(aminated mesoporous silicon,MSN-NH2)的制備參考Dai等[5]的方法并進行了改良，具體步驟：(1)將26 mL純水、20 mL百分比濃度為25%的CTAC及250 μL三乙胺溶液倒入圓底燒瓶中，置于70℃水浴中反應1 h，再加入20 mL環己烷與正硅酸乙酯的混合液后繼續反應24 h后，使用百分比濃度為1%的氯化鈉-無水甲醇溶液進行脫模板，得到介孔二氧化硅。(2)采用甲苯回流法進一步制備氨基化MSN。稱取150 mg MSN粉末置于燒瓶中，并加入10 mL無水甲苯，待水浴溫度達到70℃后，加入15 μL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在氮氣氛圍下繼續反應4 h。收集所得混合液進行離心洗滌，并冷凍干燥以備用。

MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的制備：將1.0 mL Ce6溶液(3.0 g/L)分別加入不同質量(3.0、4.5、6.0、7.5和9.0 mg)的MSN-NH2中，室溫下攪拌一夜，所得混合液進行充分的離心洗滌，直至上清液接近無色，再向沉淀中加入2.5 mL鹽酸多巴胺溶液(10.0 g/L，Tris-HCl緩沖液)攪拌6 h，隨后加入2.5 mL GdCl3·6H2O溶液(10.0 g/L)繼續攪拌4 h。最后將此混合液進行3次高速離心洗滌(離心半徑65 mm，20 min，14100 rpm)，即可得到MSN-Ce6@PDA-Gd NPs。全程避光操作。

使用透射電子顯微鏡及Nano ZS90儀器測量所制備納米材料的形貌、粒徑和表面電位；使用紫外可見分光光度計檢測MSN與Ce6不同配比的上清液的吸收光譜，以計算Ce6的包封率和負載量；使用熒光發射光譜檢驗所制備MSN-Ce6的熒光強度；使用紅外熱成像儀監測MSN-Ce6@PDA-Gd NPs在808nm激光照射下的升溫情況；使用酶標儀檢測各種處理下MSN的吸光度。

3.細胞毒性實驗

采用細胞增殖及細胞毒性檢測(cell proliferation and cytotoxicity test，MTT)分析此納米診療劑對小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)和人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)活性的影響。以5×103個細胞/孔的密度接種于96孔板，培養至細胞生長面積達到80%左右，然后分別加入含不同濃度(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的新鮮培養基(每組設置6個復孔，使每孔最終體積為100 μL)孵育24 h。使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗3遍后，每孔加入100 μL新鮮培養液以及20 μL噻唑藍MTT溶液(5.0 g/L)，孵育4 h后棄上清。每孔再加入100 μL二甲亞砜溶液，并放入恒溫搖床振蕩15 min。最后使用多功能酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度，并計算相對細胞存活率。

4.MRI和熒光成像性能離體檢測

MRI性能檢測：配置含不同Gd濃度(0、0.0106、0.0408、0.3260、0.4091、0.5168和0.9438 mmol/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs水溶液，每種濃度的溶液各取500 μL注于0.5 mL的離心管中，以純水為對照組，使用3.0T MR掃描儀進行掃描，通過采集T1弛豫時間并計算T1弛豫率，來觀察其MRI性能。為進一步檢測此納米材料與細胞結合后的T1WI效果，將人乳腺癌細胞MDA-MB-231以1×105個細胞/孔的種植密度接種于6孔板內，然后放于37℃細胞培養箱中進行培養，待細胞生長面積達到80%左右，棄去培養基并對6孔板內的細胞使用PBS洗滌兩次，然后吸出PBS，再向6孔板內分別加入2 mL不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液(0.0、50.0、100.0和200.0 mg/L)與細胞孵育3 h，對照組加入相同體積的PBS與細胞孵育3 h。使用胰酶將貼壁的人乳腺癌細胞MDA-MB-231進行消化，并將得到的懸浮細胞收集至離心管內，經離心(離心半徑76 cm，5 min，3000 rpm)后使細胞沉積于管底，經細胞攝入的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs也會沉入管底，向每個離心管內加入等體積的PBS后行MRI冠狀面掃描。掃描參數：TR 425 ms，TE 14.0 ms;視野18 cm×18 cm，層厚3.0 cm。

熒光成像性能檢測：以4×104個細胞/孔的密度接種在6孔板的蓋玻片上，過夜孵育使細胞貼壁，隨后向含有細胞的6孔板內分別加入含不同Ce6濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(0，4，8，16 mg/L)的培養基，并共同孵育4h。依次進行PBS漂洗、4%多聚甲醛固定細胞、細胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復染以及再次PBS漂洗等步驟。最后使用倒置熒光顯微鏡進行成像(×20)。Ce6的激發波長為400 nm，發射波長為665 nm，DAPI的激發波長為358 nm，發射波長為461 nm。

5.光熱性能和光熱治療效果檢測

配置不同濃度(0.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液，吸取1.0 mL于石英比色皿中，使用808 nm激光以1.5W/cm2的強度照射10 min，在紅外熱成像儀監測下每30 s記錄一次溫度值，并繪制升溫曲線。

為了進一步探究此納米材料對人乳腺癌細胞的光熱治療效果，以5×103個細胞/孔的密度接種MDA-MB-231細胞于96孔板內，培養至細胞生長面積達到80%左右，向96孔板內加入不同濃度(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液后孵育4 h。換液后非激光組直接放入恒溫培養箱，激光組采用808 nm以1.5W/cm2的強度照射3 min后放入恒溫培養箱，后續步驟同細胞毒性實驗。最后，使用多功能酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度，計算相對細胞存活率以評估光熱治療(photothermal therapy,PTT)的療效。

6.體內生物相容性分析

選取雌性健康無特定病原體級的昆明小鼠6只，鼠齡6周，體質量(32±2) g。對照組(n=3)不進行處理，實驗組(n=3)注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液。根據昆明小鼠血容量為體重的6%～7%計算，其血容量約為2.0 mL。為保證納米材料在小鼠血液循環中能保持200 mg/L的濃度，因此經昆明小鼠尾靜脈注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的劑量為20 mg/kg。在注射后第21天經解剖獲得小鼠的心、肝、脾、肺和腎臟標本，經過固定后使用蘇木精-伊紅染色法制作病理切片，在顯微鏡下觀察各器官的組織結構。

7.體內代謝途徑及半衰期

將MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(20 mg/kg，200 μL)經尾靜脈注射入3只乳腺癌荷瘤裸鼠體內，在注射后的不同時間點(0、2、6和12 h)采集裸鼠的全身磁共振圖像，觀察此納米材料的代謝途徑。MRI檢查掃描參數：冠狀面GRE T1WI，TR 11.2 ms,TE 3 ms，TI 28.0 ms，層厚1.0 mm，層間距0.5 mm。此外，在注射后不同時間點(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00和12.00 h)對荷瘤裸鼠經尾靜脈取血，將血液與濃硝酸以體積比1/10的比例進行充分混合，采用電感耦合等離子體質譜儀檢測的方法ICP-MS法對血液樣品中釓離子的含量進行檢測，計算Gd在體內的半衰期。

8.在體MRI及熒光成像性能

將人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)懸液注射到BALB/C雌性裸鼠的右側腋背部皮下軟組織內，待乳腺癌皮下移植瘤長出，即成功建立荷瘤裸鼠模型。取生長狀態良好、腫瘤大小接近的兩只荷瘤裸鼠。在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(劑量20 mg/kg)前、后的四個時間點(0)分別對荷瘤裸鼠的腫瘤區域進行MRI和熒光成像，觀察腫瘤的成像情況。MRI掃描參數：冠狀面GRE T1WI，TR 11.2 ms，TE 3 ms，TI 28.0 ms，層厚1.0 mm，層間距0.5 mm。熒光成像時每幀圖片的曝光時間為白光50 ms、綠光150 ms。

9.在體光熱治療效能

將建立成功(荷瘤裸鼠腋下腫瘤生長至直徑約5 mm)的6只荷瘤裸鼠模型隨機分為2組，每組3個樣本。對實驗組和對照組荷瘤裸鼠分別經尾靜脈注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs(20 mg/kg)和200 μL生理鹽水。待腫瘤體積達到50 mm3時對實驗組荷瘤裸鼠進行治療。經尾靜脈注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs后2 h進行激光照射(波長808 nm，強度1.5W/cm2，時間10 min)，每三天治療一次，治療期為兩周，在治療前和治療結束后兩個時間點使用相機和磁共振掃描儀進行檢查。對照組的荷瘤裸鼠不進行治療。

10.統計學分析

使用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.理化性能表征

透射電鏡圖顯示MSN-NH2具有明顯的介孔結構，且孔徑和大小均一。MSN-Ce6@PDA-Gd NPs亦呈圓形，介孔結構模糊，表面較為光滑(圖1a)，提示材料合成成功。Zeta電位監測結果顯示MSN-NH2的Zeta電位值為正值，而經過制備的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的Zeta電位值已成功變為負值，測量值為(-16.03±0.12) mV(圖1b)。經馬爾文粒徑檢測結果，MSN-NH2和MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的水合粒徑分別為(122.03±0.21)和(142.10±0.29) nm(圖1c)。根據離心所得上清液的紫外吸收光譜測量結果，發現MSN-NH2與Ce6的質量比為2.5時，Ce6的包封率(53.58%)和負載量(17.65%)較好(圖1d)，因此最終選擇該配比制備納米材料來進行后續的實驗。

圖1 MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的表征。a)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs和MSN-NH2(左下)的透射電鏡圖；b)MSN-NH2和MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的電位圖；c)MSN-NH2和MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的粒徑-光強度分布曲線；d)不同質量比的MSN-NH2與Ce6混合液離心所得上清液的紫外吸收光譜圖，顯示不同質量比得到的產物在404、505和660nm的吸光度峰值均不同。 圖2 兩種類型腫瘤細胞與不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液共同孵育后細胞毒性實驗結果，在0～200mg/L的濃度范圍內細胞存活率均在90%以上。

2.細胞毒性實驗

MTT實驗結果顯示，小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3及人乳腺癌細胞MDA-MB-231與不同濃度(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液孵育后，細胞存活率均在90%以上(圖2)，總體差異均無統計學意義(FNIH-3T3=2.317，P>0.05；FMDA-MB-231=2.344，P>0.05)。

3.MRI和熒光成像性能

MRI性能檢測：在MR T1WI上，PBS對照組在T1WI上呈低信號；實驗組中，隨著納米材料中Gd濃度的升高(0、0.0106、0.0408、0.3260、0.4091、0.5168和0.9438 mmol/L)，在T1WI上信號呈逐漸增高的趨勢，在相應的T1值偽彩圖上表現為由綠色逐漸變為藍色，提示T1值逐漸減小(圖3a)；對應的T1弛豫時間測量結果依次為(2115.83±0.60)、(232.24±1.01)、(203.57±0.46)、(175.53±0.46)、(113.97±0.33)、(89.10±0.16)和(69.07±0.35) ms。相關性分析結果見圖3b，顯示Gd濃度與T1值的倒數呈良好的線性正相關關系(R2=0.9984)。不同濃度的納米診療劑與人乳腺癌細胞MDA-MB-231結合后經離心而沉積于EP管底部，在冠狀面T1WI上可見隨著納米診療劑濃度的增加(0～200 mg/L)，離心管底部的信號強度逐漸增高，在T1-rainbow偽彩圖上離心管底部的顏色由藍色過度到綠色、最后至紅色(圖3c)，表明沉積細胞的T1值逐漸減小。結果表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs具有良好的T1加權成像能力。

圖3 MRI性能檢測結果。a) 不同Gd濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的MR T1WI圖像及T1-mapping偽彩圖； b) Gd濃度與1/T1值的相關性分析點線圖，顯示兩者間呈良好的線性相關關系； c) 不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液與MDA-MB-231細胞孵育后置入離心管內后的T1WI圖像及T1-rainbow偽彩圖，顯示隨著納米材料的濃度增加，在T1WI上信號強度逐漸增加，而T1值逐漸減小(在T1-rainbow偽彩圖上的顏色依次為藍色-綠色-紅色)。

熒光成像性能表征：采用倒置熒光顯微鏡觀察MDA-MB-231細胞與納米診療劑的結合情況，由于DAPI是一種能與DNA強力結合的熒光染料，與細胞中的DNA結合后顯示為藍色熒光，因此DAPI通道中顯示的藍色熒光為細胞核區域；由于Ce6的可在熒光激發下顯示為紅色熒光，因此Ce6通道中顯示的紅色熒光反映了MSN-Ce6@PDA-Gd NPs在細胞內的分布；Merge通道中顯示的是藍色熒光和紅色熒光的融合，可觀察MSN-Ce6@PDA-Gd NPs在細胞內的分布情況。本研究中發現PBS組中僅觀察到藍色熒光，無紅色熒光；以PBS為對照組，將細胞懸液加入含不同Ce6濃度(4、8和16 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-GdNPs溶液(依次簡稱為NP-4、NP-8和NP-16組)的培養基中孵育4 h后，細胞懸液中則觀察到明顯的紅色熒光，且隨著Ce6濃度的增加在顯微鏡圖像上的熒光亮度逐漸提高(圖4)。使用Image J軟件進行單個細胞平均熒光強度的半定量分析，結果顯示NP-4、NP-8和NP-16這3組的單個細胞平均熒光強度值分別為54.47±1.14、65.35±0.99和103.87±1.07，3組間的差異有統計學意義(F=4298.203，P<0.001)；NP-4和NP-8組分別與NP-16組比較，差異均有統計學意義(t=44.679，P<0.001；t=37.294，P<0.001)。上述結果表明人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)對MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的攝入具有濃度依賴性，當其內Ce6的濃度為16 mg/L時乳腺癌細胞具有較好的熒光顯像效果。

圖4 倒置熒光顯微鏡檢測MDA-MB-231細胞對納米診療劑的攝取情況(標尺長度代表100nm，×20)。含有PBS溶液及含有不同Ce6濃度(4、8、16mg/L)MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的培養基與人乳腺癌細胞(MDA-MB-231細胞)共同孵育后，熒光顯微鏡下DAPI通道可見細胞核區域呈藍色熒光；Ce6通道可觀察到，相較于對照組(PBS組)，實驗組隨著Ce6濃度濃度的增加(NP-4、NP-8和NP-16)，紅色熒光的亮度逐漸增強；Merge通道可見紅色與藍色區域不重疊，表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs不進入細胞核。

4.光熱性能和光熱治療效果

本實驗結果顯示，隨著激光照射時間的增加，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的溫度逐漸升高并趨于平衡(圖5a)。在808 nm激光輻照(1.5W/cm2，)10 min后，150 mg/L組溶液溫度可達到43.7℃，200 mg/L組溶液溫度可高達51.5℃。細胞光熱治療作用的實驗結果顯示：在激光輻照組中，當納米材料的濃度為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 mg/時，細胞存活率分別為100.83%±4.68%、95.51%±2.30%、92.07%±1.15%、89.18%±1.08%、68.74%±0.57%、43.83%±2.22%和23.07%±1.41%，總體差異有統計學意義(F=793.216，P<0.001)。無激光輻照組中各濃度(0～200 mg/L)的納米材料以及激光輻照組中納米材料的濃度為0～50 mg/L時，細胞存活率較高；而在激光輻照組中當納米材料的濃度達100～200 mg/L時，細胞存活率顯著降低(圖5b)。

圖5 MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的光熱效能。a)PBS溶液以及不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液在激光照射下(808 nm,1.5W/cm2,10 min)的升溫曲線；b)不同濃度MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液在有或無激光處理后的細胞存活率條形圖。

5.納米材料在體內的生物相容性

21天后的蘇木精-伊紅染色后的組織切片結果顯示，與空白對照組比較，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs組的昆明小鼠體內臟器(心、肝、腎臟、肺和脾)無明顯異常(圖6)。表明該核殼納米診療劑具有良好的體內生物相容性。

圖6 各臟器的組織病理圖(×400，HE)。圖a～e依次為對照組中小鼠的心、肝、腎臟、肺和脾臟標本的病理圖，圖f～j依次為實驗組在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液21天時小鼠的心、肝、腎臟、肺和脾臟標本的病理圖。兩組小鼠的心肌組織均顯示肌纖維正常分布，細胞橫紋清晰，間質細胞正常，胞核完整，無炎癥細胞浸潤現象；兩組小鼠的肝臟組織均顯示肝細胞索間界限清晰，胞漿界限明顯，肝細胞以中央靜脈為中心向周圍放射狀排列；兩組小鼠的腎臟組織均顯示胞核完整，細胞核清晰可見，胞質和胞漿對比鮮明；兩組小鼠的脾臟細胞結構均顯示清晰，紅髓和白髓界限較明顯。

6.體內代謝途徑及半衰期

荷瘤裸鼠在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs后，增強早期在MR T1WI上即可見肝臟有較明顯強化，隨著時間推移，強化程度逐漸減低，12 h后肝臟信號強度恢復至注射前(圖7)。提示MSN-Ce6@PDA-Gd NPs通過肝臟進行排泄。此外，以荷瘤裸鼠注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs后的取血時間為橫坐標，以電感耦合等離子體質譜儀測得的血液樣品中的Gd濃度為縱坐標進行繪圖及計算，獲得其代謝曲線(圖8)，結果顯示此納米材料中Gd的血液半衰期約為2.03 h。

圖7 荷瘤裸鼠在注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液前、后4個時間點的MRI圖像。a)T1- rainbow偽彩圖顯示肝臟(箭)在0 h時呈綠色。注射后2 h黃色區域增加，6h時黃色區域較前減少，12 h時恢復至綠色，由于rainbow偽彩圖上的顏色藍色-綠色-黃色-紅色代表T1值逐漸由高到低，因此結果表明肝臟區域的T1值先減小，6 h后增加，再至12 h恢復至接近初始水平；b)T1WI顯示注射后2 h肝臟區域的信號強度增高，6 h時肝臟的信號強度減弱，在12 h時肝臟的信號強度恢復至與0 h時接近。

7.在體磁共振及熒光成像性能

在獲得較好的體外成像效果后，我們進一步評估了MSN-Ce6@PDA-Gd NPs活體成像效果。荷瘤裸鼠的在體MRI和熒光成像檢查顯示，注射此納米診療劑后腫瘤區域有明顯強化(圖9a)和明顯的熒光強化(圖9b)。在體成像結果表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs可實現對乳腺癌病灶的在體MR和熒光雙模態成像。

圖8 血液內Gd離子濃度-時間曲線，Gd離子濃度在體內的半衰期為2.03±0.31 。 圖9 荷瘤裸鼠在體MRI及熒光成像。a)MR T1WI顯示注射納米診療劑后腫瘤組織有明顯強化(箭)；b)熒光成像圖(顯示注射納米診療劑后腫瘤組織有明顯熒光強化(箭)。 圖10 MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的光熱治療性能檢測。圖a～d為對照組(注射生理鹽水)圖像，圖e～h為實驗組(注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs)圖像。a)治療前對照組裸鼠照片；b)激光輻照治療結束后對照組裸鼠照片，顯示皮下腫瘤(箭)較前明顯增大；c)治療前對照組裸鼠MR T1WI；d)激光輻照治療后對照組裸鼠T1WI，顯示腫瘤(箭)較治療前明顯增大；e)治療前實驗組裸鼠照片；f)治療后實驗組裸鼠照片，顯示皮下腫瘤(箭)較前明顯減小；g)治療前實驗組裸鼠MR T1WI；h)激光輻照治療后實驗組裸鼠T1WI，顯示瘤體(箭)較前明顯減小。

8.在體光熱治療效能

在治療前及激光輻照治療兩周后進行在體光熱治療效能的評估。裸鼠照片及MR圖像顯示，對照組中裸鼠皮下的腫瘤組織明顯大于未治療時(圖10a)；而注射MSN-Ce6@PDA-Gd NPs結合808 nm激光組裸鼠的腫瘤在治療后小于治療前的大小，且該組瘤體的大小明顯小于對照組(圖10b)。本組結果表明了MSN-Ce6@PDA-Gd NPs+808 nm激光能實現有效的乳腺癌在體光熱治療。

討 論

分子影像中MRI和熒光成像雙模態成像技術兼具MRI的空間分辨率高、不受組織深度影響以及熒光成像的時間分辨率高、可實時成像的優點，可作為乳腺癌早期診斷的有效手段[6-7]。第二代光敏劑二氫卟吩e6(chlorine e6，Ce6)具有光穩定性好，成像性能佳的優點，其激發光為紅色熒光，可有效區別生物體的黃綠色背景熒光，是一種性能優異的熒光成像劑[8]。但強疏水性使Ce6易發生團聚，進而將顯著影響其在腫瘤細胞中的攝取[9]。本研究中采用負載潛能高的介孔二氧化硅為載體，并與親水性能良好的聚多巴胺涂層聯合使用，以提高對疏水性光敏劑Ce6的負載性能。值得一提的是，本研究所使用的聚多巴胺涂層，是金屬離子(如釓離子﹑錳離子和鐵離子)的強配位體，故具有成為MRI對比劑的潛能[10]，還具備近紅外光吸收和光熱轉換能力，是一種有效的光熱治療劑。因此，本研究中所構建出的多功能納米體系可具有磁共振和熒光成像能力及光熱治療效能。

人乳腺癌細胞MDA-MB-231屬于高轉移性惡性乳腺癌細胞系，呈貼壁生長，其形態為上皮細胞樣，是研究乳腺癌轉移的經典模型細胞系[11]。因此，本研究中使用該細胞系用于后續的研究。細胞毒性結果顯示，當MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的濃度為0～200 mg/L時，小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3和人乳腺癌細胞MDA-MB-231的相對存活率均維持在90%以上。相較于Dong等[12]制備的錳配位聚多巴胺溶液的細胞存活濃度范圍(0～80 mg/L)，以及Yang等[13]制備的介孔硅裝載二氫卟吩e6的細胞存活濃度范圍(0～200 mg/L)，本研究中制備的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的細胞毒性較低。此外，與空白對照組比較，此納米材料經昆明小鼠尾靜脈注射后21天的病理切片可觀察到，所有被檢器官均無明顯的器質性病變﹑炎癥和其它異常。

本次研究中對MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的磁共振成像和熒光成像性能進行了分析，結果顯示此納米材料在體外具有明顯的磁共振成像效果，縱向弛豫率為9.845 mM-1s-1，是臨床上常規使用的MRI對比劑釓噴酸葡胺的縱向弛豫率(4.49 mM-1s-1)的2.36倍[14]。在細胞層面，未經此納米材料處理的腫瘤細胞未見明顯增強表現，而隨著與腫瘤細胞共同孵育的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液的濃度逐漸增高(50.0、100.0和200.0 mg/L)，腫瘤細胞沉積物在磁共振T1WI上信號強度逐漸增高。為了解較低濃度的納米診療劑可否實現細胞熒光成像，我們在研究中將含有不同Ce6濃度(0、4、8和16 mg/L)的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液與人乳腺癌細胞MDA-MB-231一起孵育，發現隨著濃度的增加，孵育細胞表現出逐漸增強的紅色熒光，16 mg/mL濃度組的細胞熒光強度可實現較好的熒光成像效果。根據負載量計算，Ce6的濃度為4、8和16 mg/L時對應的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs的濃度分別為22.66、45.33和90.65 mg/L。由此可見，濃度為90.65 mg/L的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液對乳腺癌細胞即可具有良好的熒光成像能力。對乳腺癌荷瘤裸鼠的在體MRI和熒光成像結果顯示，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs可實現對乳腺癌的雙模態成像。此外，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs中的Gd離子在荷瘤裸鼠血液內的半衰期約為2.03 h，與臨床常用的磁共振對比劑釓噴酸葡胺相比，半衰期明顯增加，為實現光熱治療作用提供了基礎[15-16]。

本研究中還發現，MSN-Ce6@PDA-Gd NPs表現出良好的升溫效果。將1.0 mL的MSN-Ce6@PDA-Gd NPs溶液(200 mg/L)經尾靜脈注入荷瘤裸鼠體內，注射2 h后對腫瘤組織使用808 nm激光輻照(1.5W/cm2)10 min，腫瘤組織的局部溫度可升高至51.5℃，顯著高于光熱消融腫瘤的溫度標準(43℃)。此外，經該濃度的納米材料處理的乳腺癌細胞MDA-MB-231，相較于無激光輻照組，激光輻照組中的細胞存活率更低。乳腺癌荷瘤裸鼠的在體實驗結果也表明MSN-Ce6@PDA-Gd NPs可實現有效的腫瘤治療效果。

綜上所述，本研究成功構建了基于介孔硅-聚多巴胺的核殼結構的納米診療劑MSN-Ce6@PDA-Gd NPs，其具有磁共振和熒光雙模態成像效果及光熱治療乳腺癌的效用，為實現乳腺癌的診療提供了新思路。

(利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突)。