基于網絡藥理學探討染料木素治療抑郁癥的分子作用機制

胡燕珍 張媛媛 黃 斌 王亞敏 陳 樂▲ 楊 治

1.江西省中醫藥研究院中藥研究所，江西南昌 330046；2.江西省兒童醫院新生兒外科，江西南昌 330006

抑郁癥是最常見的精神疾病之一，以生理、情感和認知障礙為主要特征，伴隨的癥狀包括情緒低落、快感缺失、絕望、精力喪失、有自殺念頭等[1]。世界衛生組織預測世界各地已超過3.5 億人患有這種疾病，涉及各個年齡段[2]。同時，隨著每年全球中老年女性的增多，圍絕經期抑郁癥的發病率呈逐年上升趨勢。相關研究表明，在歐美圍絕經期婦女中，輕度抑郁癥的人占總人數的50%～60%，嚴重抑郁癥占1%～3%[3]。圍絕經期抑郁癥的發生不僅影響中老年女性的生活質量，同時也給家庭和社會帶來了沉重的負擔[4]。現代研究認為，圍絕經期抑郁癥的發生與雌激素的缺乏有關[5]。其中，植物雌激素是一類存在于植物中具有雌激素生物活性的物質，其已作為臨床絕經期婦女激素替代療法的一種新選擇。染料木素是植物雌激素的一種，其可選擇性地與雌激素受體結合，表現出雌激素與抗雌激素活性。有研究報道，染料木素具有改善絕經后骨質疏松癥婦女的生活質量和抑郁癥狀的能力[6]。但目前有關染料木素治療圍絕經期抑郁癥的具體作用機制尚不明確。網絡藥理學的出現為染料木素治療抑郁癥的作用機制系統研究提供了新的思路和方法。網絡藥理學是一門以系統生物學理論為基礎，采用生物系統網絡分析方法，通過選取特定的信號節點對多靶點藥物分子進行系統設計的新學科[7]。基于此，本研究采用網絡藥理學方法，分析和預測染料木素治療抑郁癥的分子作用機制，以期為揭示染料木素治療抑郁癥作用機制的科學內涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 染料木素作用靶點預測

通過搜索下列數據庫獲得染料木素靶向蛋白編碼基因的完整列表：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）、比較毒理基因組學數據庫（http://ctdbase.org/）、TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）。結果僅限于“homo Sapiens”。

1.2 抑郁癥相關靶點預測

檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）和Home-NCBI-Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）數據庫獲得潛在抑郁癥相關靶點，關鍵詞輸入“depression”，設置物種為“homo Sapiens”。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖的構建

將染料木素作用靶點與抑郁癥相關靶點的交集部分導入STRING 數據庫（https://stringdb.org/），設置物種為“homo Sapiens”，獲取藥物-疾病靶點PPI 網絡關系數據，將處理后的數據導入Cytoscape Version 3.6.1軟件，繪制PPI 網絡圖，對生成的網絡圖進行拓撲分析，節點大小與degree 值呈正相關，并根據degree 值篩選出核心靶點。

1.4 “成分-靶標-疾病”網絡構建與分析

將染料木素化合物、抗抑郁相關作用靶點和疾病導入Cytoscape Version 3.6.1 軟件，構建“成分-靶標-疾病”網絡圖。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

使用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）將染料木素抗抑郁癥潛在靶點進行系統分析，設置列表和背景的限定物種為“homo Sapiens”，以P ＜0.05 進行關鍵靶基因GO 與KEGG 功能富集分析，并將結果以條形圖形式輸出。分析染料木素抗抑郁癥的生物學過程、細胞成分、分子功能和信號通路。

2 結果

2.1 染料木素抗抑郁靶點預測

檢索TCMSP、比較毒理基因組學、TTD 等數據庫，刪除重復數據，整理得到231 個染料木素的作用靶點。對Home-NCBI-Gene 和GeneCards 數據庫檢索結果進行整理，得到抑郁癥相關靶點537 個。將染料木素作用靶點與抑郁癥靶點相匹配，整理得到23 個染料木素抗抑郁癥潛在靶點。見表1。

表1 染料木素抗抑郁潛在靶點

2.2 PPI 網絡構建與分析

將23 個潛在靶點錄入STRING 數據庫，獲取靶點PPI的網絡關系數據，將其導入Cytoscape Version 3.6.1軟件，繪制PPI 網絡圖（圖1）。圖中節點代表靶蛋白，節點的大小和顏色表示degree 值的大小，節點越大、顏色越深對應的degree 值越大。圖中有相互關聯的蛋白以線連接，線條的粗細代表蛋白相互作用的強弱。圖中共有23 個節點，平均節點度為15.6，179 條邊，平均局部聚類系數為0.882。在PPI 關系中，MAPK1、PTGS2、MMP9、VEGFA、AKT1、TNF 等6 個靶點 的節點較大，推測這些蛋白可能是染料木素治療抑郁癥的關鍵靶點，在染料木素治療抑郁癥過程中發揮重要作用。

圖1 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.3 成分-靶點-疾病網絡構建

將染料木素化合物、23 個潛在靶點及疾病分別導入Cytoscape Version 3.6.1 軟件，構建“成分-靶點-疾病”網絡圖（圖2）。在網絡圖中，中間靠下節點代表染料木素，靠上節點代表疾病抑郁癥，外圈節點代表染料木素抗抑郁的潛在靶點，共23 個節點，作用靶點與活性成分和疾病的相互關聯用邊來表示。從圖中可看出染料木素可以對應不同的靶點，充分顯示染料木素抗抑郁具有多靶點的特性。

圖2 “成分-靶點-疾病”網絡圖

2.4 GO 富集分析

將染料木素抗抑郁的23 個潛在靶點導入DAVID數據庫，經R 語言運行后可獲得33 條GO 富集功能（P ＜0.05）。其中26 個生物過程（圖3A）主要與細胞分裂正調控、蛋白激酶B 信號轉導、絲氨酸肽基磷酸化正調控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正負調控、免疫應答、MAP 激酶活性正調控、細胞增殖正調控、血糖穩態、血管生成、NF-κB 信號正調控等相關。3 個細胞成分（圖3B）主要包括細胞外間隙、胞漿、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物。4 個分子功能（圖3C）主要涉及細胞因子活性、序列特異性DNA 結合、白細胞介素-1受體結合、類固醇結合。圖中黑色條代表基因個數，條越長表示該GO 條目富集的基因越多；灰色條代表P值，條越長代表P 值越小。

圖3 GO 富集結果條形圖

2.5 KEGG 通路富集分析

在KEGG 分析中，以P ＜0.05 為界共篩選出23 條信號通路（圖4），依次為癌癥信號通路、利什曼病、瘧疾、乙肝、結核病、NF-κB 信號通路、阿米巴病、腎細胞瘤、前列腺癌、細胞因子受體相互作用信號通路、丙肝、MAPK 信號通路、黑色素瘤、趨化因子信號通路、黏著斑、移植物抗宿主病、子宮內膜瘤、結直腸癌、慢性粒細胞白血病、造血細胞譜系、癌癥過程中的膽堿代謝通路、人體T 細胞白血病病毒Ⅰ型感染、卵母細胞減數分裂，提示染料木素可能通過作用以上多條通路達到治療抑郁癥的目的。圖中黑色條代表基因個數，條越長代表該通路富集的基因越多；灰色條代表P 值，條越長代表P 值越小。

圖4 KEGG 通路富集結果條形圖

3 討論

目前，現代醫學多用西藥來治療圍絕經期婦女抑郁癥，西藥能夠快速的改善患者的癥狀體征，但存在毒副作用大、依從性差、中斷治療復發率高等諸多問題，極大地影響了其在臨床中的應用。而中醫藥依據患者的病癥類型進行辨證論治，治療效果不低于西藥，且安全性更高，更受患者歡迎。研究表明，絕經期抑郁癥的發生發展與體內雌激素水平的降低密切相關[8]。其中，植物雌激素是從植物尤其是豆類植物中提取的可以替代雌激素的作用并同時防止雌激素不良反應的發生，給廣大圍絕經期女性追求健康、遠離煩惱帶來了新的希望。染料木素是植物雌激素的一種，已成為絕經期婦女激素替代療法的一種新選擇。因此，研究染料木素抗抑郁的作用機制具有重要意義。

本研究通過構建的PPI 網絡圖，發現染料木素可能通過調節MAPK1、PTGS2、MMP9、VEGFA、AKT1、TNF 等核心靶點達到治療抑郁癥的作用。MAPK1 參與細胞的自噬、增殖、遷移、侵襲和脂代謝等生物過程[9]，其參與抗抑郁的機制與內質網蛋白加工過程有關[10]。PTGS2 是前列腺素生物合成中的關鍵限速酶。前列腺素合成酶在抑郁癥患者中顯著下調[11]，提示前列腺素生物合成途徑的異常與抑郁癥的發生密切相關，其也可通過降低神經炎癥反應發揮抗抑郁的作用[12]。MMP9 又稱明膠酶B，可以高效降解Ⅳ型膠原，在血管重生、炎癥反應等生物過程中起關鍵作用。近年研究表明，抑郁癥與炎癥應答系統的激活有關，是一種炎癥疾病[13]。VEGFA 是PDGF/VEGF 生長因子家族的最主要成員之一，通常也被稱之為VEGF，在血管發生和形成過程中起著主要的調控作用。VEGF 是內皮細胞和神經元的一種有效的特異性有絲分裂原和神經營養因子，是突觸傳遞的調節劑[14]。研究表明VEGF在海馬神經發生和抑郁病理生理學中起重要作用，抑制神經細胞中VEGF 受體2 的表達會損害海馬依賴性突觸可塑性和情感記憶的鞏固[15]。AKT1 可通過PI3K 依賴的機制被胞外信號激活，在體內參與代謝、細胞增殖和存活、胰島素信號轉導及血管生成等多種生物學過程。AKT1 基因SNPrs3001371 多態性與重性抑郁障礙患者認知功能損傷存在一定的關聯性；G/G基因型患者與G/A 和A/A 基因型患者比較，認知功能損害更嚴重[16]。TNF 基因編碼的蛋白是一種多功能的促炎性細胞因子，分為TNF-α、TNF-β 兩種。其中，TNF-α 在抑郁癥的發生、發展及臨床藥理機制中發揮著重要作用[17]。抑郁癥相關性的薈萃分析（meta 分析）顯示，抑郁癥患者血清TNF-α 水平明顯高于健康人群[18]。同時，劉玉芝等[19]研究表明，TNF-α 基因rs1800629 多態性與首發抑郁癥的易感性相關。

靶點KEGG 通路分析表明，染料木素抗抑郁癥作用與癌癥通路、免疫炎癥反應通路（趨化因子信號通路、細胞因子-受體相互作用信號通路、NF-κB 信號通路）、細胞凋亡通路（MAPK 信號通路）、病毒感染等通路相關。其中，免疫炎癥反應和細胞凋亡是抑郁癥的重要發病機制。抑郁癥患者的相應腦區存在炎癥反應，而介導炎癥反應的趨化因子在其中發揮著重要的作用。在LPS 誘導的抑郁動物模型中，大鼠前額皮質的趨化因子CXCL1 和CCL2 水平明顯升高[20]。另外，在LPS 誘導的外周急性早期炎癥動物模型中，Col1a1或Rgs5 亞型的PDGFRβ 細胞能夠介導中樞神經系統中的CCL2 迅速高表達，進而導致中樞神經系統炎癥反應[21]，從而誘發模型動物出現抑郁性癥狀。細胞因子與相應受體結合后，具有調節細胞生存和死亡的作用，如TNF-α 可使NF-κB 的抑制蛋白磷酸化、泛素化從而發生降解，并從NF-κB 脫離而激活NF-κB 轉移到核內與特定的DNA 序列結合，啟動或抑制基因的轉錄，從而影響細胞生存或死亡。最近陸梅娟等[22]研究表明，抑郁癥患者血清NF-κB 水平升高，其表達量影響抑郁癥的發病過程。在劉麗珠等[23]研究中，發現APS 可通過抑制NF-κB 信號通路的磷酸化反應，穩定模型動物腦海馬CA1 區自發性動作電位和群峰電位電壓，可顯著改善大鼠腦卒中后抑郁行為。MAPK已被證實具有調節行為、學習、記憶等方面的作用，MAPK 信號通路包括：ERK1/2、ERK3/4、ERK5、p38、JNK/SAPK，其中ERK1/2 通路與抑郁癥關系最為密切。覃斌等[24]通過構建慢性不可預知刺激抑郁模型來探討氯胺酮抗抑郁的作用機制，發現氯胺酮可通過抑制ERK1/2、NF-κB 信號分子，抑制炎癥反應，顯著改善抑郁大鼠的行為學。張世嬌等[25]發現逍遙合劑可上調產后抑郁大鼠下丘腦內ERK1/2 信號通路上的p-MEK1、MEK1 蛋白表達水平，改善大鼠產后抑郁癥狀。以上研究均提示，ERK1/2 通路與抑郁癥發病機制密切相關。綜上所述，染料木素可能通過上述多種信號通路來調節各種生理活動，從而到達治療抑郁癥的目的。

本研究采用網絡藥理學的方法，對染料木素抗抑郁癥作用的靶點和機制進行了系統的預測和分析，共篩選出核心靶點6 個、GO 生物信息33 條及相關信號通路23 條，為后續深入研究染料木素抗抑郁的作用機制提供了新思路。但本研究未對關鍵靶蛋白進行分子對接驗證，因此染料木素抗抑郁的具體作用機制還需進一步實驗驗證。