正交試驗(yàn)法優(yōu)選參芪益氣口服液提取工藝

李 萍,韋祖巧,曾 金,肖 萍,歐人豪

(柳州市婦幼保健院;廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院,廣西 柳州545001)

我國(guó)每年有2 000多萬(wàn)產(chǎn)婦,約有70%存在著不同程度的產(chǎn)褥期縮復(fù)不良的情況[1]。超過(guò)70%的調(diào)查對(duì)象自報(bào)至少存在1種健康問(wèn)題[2]。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)通過(guò)研究顯示,產(chǎn)后益氣補(bǔ)血可以不同程度緩解和治療婦女產(chǎn)后氣血兩虛的相關(guān)癥狀[3-7]。參芪益氣口服液是柳州市婦幼保健院在研制劑,由黃芪、黨參、當(dāng)歸、熟地黃等11味中藥組成,主要用于婦女產(chǎn)后益氣消炎,提高產(chǎn)婦免疫力,預(yù)防產(chǎn)后病等。方中黃芪補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)固表,黨參健脾益氣、養(yǎng)血補(bǔ)氣,為君藥;當(dāng)歸血和營(yíng),助黃芪、黨參益氣生血,為臣藥;山藥、黃精平補(bǔ)肺脾腎三經(jīng),又能益氣養(yǎng)陰,氣陰雙補(bǔ),同為臣藥;山銀花清熱解毒、宣表透邪、芳香避穢為佐藥,甘草益氣和中,調(diào)和諸藥。參芪益氣口服液是在我院中醫(yī)專(zhuān)家多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,辨證施治總結(jié)出的有效方劑,通過(guò)益氣補(bǔ)中,治療婦女產(chǎn)后由氣血兩虛引起的產(chǎn)后氣虛、盜汗、排尿困難等癥,且該方在臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)可減少抗生素的使用。現(xiàn)代藥理研究表明,黃芪能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,抑制炎癥因子的分泌,還具有一定的抗菌作用[8]。黨參具有免疫調(diào)節(jié)作用,可提高體液免疫功能[9]。

本研究采用正交試驗(yàn)法篩選參芪益氣口服液中的11味藥材的水提取工藝,以有效成分綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸為主要指標(biāo)測(cè)定含量,優(yōu)選該制劑的最佳提取工藝,為該制劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號(hào)LC-20AT,日本島津);電子分析天秤(型號(hào)FA1004,上海天平儀器廠);數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)KQ-300DB,昆山市超聲儀器有限公司);臺(tái)式低速離心機(jī)(型號(hào)TDZ4-WS,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào):111920-201606)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-201716)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào):110773-201614)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;參芪益氣口服液樣品由柳州市婦幼保健院藥劑科制劑室提供;流動(dòng)相用甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和阿魏酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 采用Agilent HC-C18(250 mm×4.6mm,5μm)色譜柱,乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)溶液為流動(dòng)相,洗脫梯度(0~10 min,10%~10% A;20~60 min,10%~18%A),流速1.0m L/min,檢測(cè)波長(zhǎng)綠原酸、毛蕊異黃酮葡萄260nm(0~25min,45~60min),阿魏酸315nm(25~45 min),柱溫30℃,進(jìn)樣量20μL,檢測(cè)時(shí)間60min。在此色譜條件下,取“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)下溶液進(jìn)行測(cè)定,所得色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量,加流動(dòng)相溶解,制成母液濃度分別為2.008 mg/mL、0.464 mg/mL、0.896 mg/mL。精密量取綠原酸母液8.765 mL,阿魏酸母液0.732 mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷母液0.357mL,流動(dòng)相定容至25.0 mL,搖勻,即得混合對(duì)照品溶液(濃度分別為綠原酸0.704mg/mL、阿魏酸0.013 6 mg/m L、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.012 8 mg/mL),備用。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取參芪益氣口服液提取原液1.0mL,流動(dòng)相稀釋定容至10.0mL,振搖,離心(3 600 r/min)5min,上清液用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品母液0.5 m L、1.0 m L、2.0 m L、3.0 m L、5.0 m L,用流動(dòng)相定容至5.0 m L,得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣分析,記錄峰面積。以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得綠原酸的回歸方程為Y=15.586X+15.526(r=0.999 8),線(xiàn)性范圍70.4~704μg;阿魏酸Y=115 379X-18 029(R2=0.999 6),線(xiàn)性范圍1.36~13.6μg;毛蕊異黃酮葡萄糖苷Y=75 598X+4 974.9(R2=0.999 4),線(xiàn)性范圍1.28~12.8μg。表明綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷在一定范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取參芪益氣口服液樣品(批號(hào)20051301),按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品,再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果,綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.86%、0.75%、1.07%,表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液20μL,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下分別于0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、24 h進(jìn)樣,記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、峰面積的RSD分別為1.15%、1.08%、0.61%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品,按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6個(gè)供試品溶液,分別進(jìn)樣20μL,記錄峰面積,計(jì)算綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結(jié)果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的RSD分別為1.47%、1.30%、1.69%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批參芪益氣口服液樣品0.5m L,共6份,分別加入0.5m L已知濃度的混合對(duì)照品母液(含有綠原酸0.704mg/m L,阿魏酸0.013 6mg/m L,毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.012 8 mg/m L),加流動(dòng)相定容至10.0 m L,振搖,離心,上清液用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣分析,結(jié)果綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率分別為99.44%、101.06%、98.00%,RSD分別為2.54%、1.57%、2.09%,表明本方法加樣回收率良好。

2.2 提取工藝優(yōu)選

本制劑采用正交試驗(yàn)法,對(duì)加水量(A)、提取時(shí)間(B)及提取次數(shù)(C)3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(3)4正交試驗(yàn)。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交因素設(shè)計(jì)

按處方配比平行稱(chēng)取黃芪、黨參等11味藥材共9份,根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行提取,為提高煎煮效果,藥材加水浸泡1 h后再進(jìn)行煎煮。將正交試驗(yàn)得到的提取液過(guò)濾、合并、濃縮后,分別測(cè)定綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量,并進(jìn)行多指標(biāo)綜合分析。

2.3 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果

由表2直觀分析可知,根據(jù)極差R大小確定影響因素主次為:提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量;根據(jù)K值可知,A2>A3>A1,B2>B3>B1,C2>C3>C1,初步可得最佳提取工藝為A2B2C2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析可知,加水量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)對(duì)綜合評(píng)分均無(wú)顯著性影響,故從省時(shí)節(jié)能、降低成本和對(duì)綜合評(píng)分影響大小三方面考慮,選擇A2B1C2因素水平。即最佳提取工藝為加7倍量水,提取2次,每次1h。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為確定優(yōu)選工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性,按照處方量稱(chēng)取藥材3份,加入7倍量水,浸泡30 min,沸騰后小火煎煮1 h,趁熱過(guò)濾。濾渣加入7倍量水煎煮1 h,趁熱過(guò)濾,合并兩次濾液,濃縮至100 m L。按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品,再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定綠原酸、阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。由表4結(jié)果可見(jiàn),此工藝穩(wěn)定可靠,重復(fù)性佳,合理可行,可用于參芪益氣口服液的提取制備。

表4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (μg/m L)

3 討論

在前期研究設(shè)計(jì)時(shí),擬將干浸膏提取率納入評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),但在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),其結(jié)果對(duì)綜合評(píng)分影響不大,故未將其排在考察范圍。

由于實(shí)驗(yàn)條件的限制,以及對(duì)照品貨源的短缺,故將黃芪中的主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、當(dāng)歸的主要有效成分阿魏酸、山銀花的主要有效成分綠原酸作為含量測(cè)定指標(biāo),對(duì)參芪益氣口服液的水提取工藝進(jìn)行研究。本組方含11味藥材,成分較復(fù)雜,樣品的處理方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大,筆者分別用甲醇、50%甲醇、1%鹽酸甲醇、流動(dòng)相稀釋,使用乙酸乙酯、丙酮等液液萃取法,以及固相萃取法,結(jié)果表明使用流動(dòng)相(乙腈∶0.1%磷酸溶液=1∶9)稀釋操作簡(jiǎn)單,得到的目標(biāo)成分含量高且雜質(zhì)少。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)L9(3)4正交試驗(yàn),采用多指標(biāo)評(píng)分法,對(duì)參芪益氣口服液的制備工藝進(jìn)行優(yōu)選,最后得出其最佳提取工藝為加7倍量水,提取2次,每次1 h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí),該方法穩(wěn)定、可靠。