基于“藥物-靶點-通路”網絡的血必凈注射液治療COVID-19作用機制研究

楊冬梅,霍艷杰,陳臨江,曾 陽,袁志鷹,庹勤慧,趙洪慶

(湖南中醫藥大學,湖南 長沙410208)

由2019新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCo V)引發的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)在全球范圍內流行,嚴重威脅人們身體健康[1]。新型冠狀病毒肺炎的臨床分型根據病情危重程度主要為輕型、普通型、重型與危重型[2]。研究發現,在COVID-19重癥及危重癥患者血漿中中性粒細胞數量增加,淋巴細胞數量顯著降低,而多種促炎因子表達水平明顯上升[3-5]。其中,危重型患者免疫系統已經完全紊亂,因炎性因子大量產生而出現細胞因子風暴[6-7]。而細胞因子風暴發生迅速,是新型冠狀肺炎重型患者發展為危重型患者的主要原因。

血必凈注射液作為國家中藥二類新藥,于非典時期上市,主要應用于膿毒血癥、多臟器功能衰竭綜合征、肺心病急性加重期、急性肺損傷與急性呼吸窘迫綜合征、急性胰腺炎等疾病的治療[8-11]。2020年4月12日,經國家藥品監督管理局批準,血必凈新增適應證:“可用于新型冠狀病毒肺炎重型、危重型的全身炎癥反應綜合征或/和多臟器功能衰竭”[12]。本研究擬采用網絡藥理學方法分析血必凈注射液活性成分通過調節免疫與炎癥反應治療COVID-19的作用機制,為其臨床運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

數據庫:中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php);Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/);STRING數據庫(https://string-db.org/)TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/);DisGeNT數據庫(https://www.disgenet.org/);DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)。

軟件:可 視 化cytoscape3.5.1軟 件、pymol軟 件 與Autodock4.2分子對接軟件,易漢博作圖軟件(http://www.ehbio.com/ImageGP/index)。

1.2 藥物活性成分收集與篩選

利用TCMSP收集血必凈注射液:丹參、赤芍、紅花、川芎、當歸五味中藥的主要化學成分。根據人體對藥物吸收、分布、代謝及排泄/毒性的藥動學參數,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為篩選條件,初步篩選出血必凈注射液潛在具有較高活性的化合物。

1.3 血必凈注射液作用靶點的預測

基于篩選的活性成分預測化合物的作用靶點,經Drug-Bank數據庫將化合物分子結構與測出的靶點,經Uniprot數據庫轉化為基因簡稱命名。

1.4 篩選血必凈注射液關鍵活性成分

將血必凈注射液潛在具有較高活性的化合物與成分導入cytoscape 3.5.1軟件進行可視化,通過Network Analyzer功能對網絡節點中心性進行分析,設置節點度(degree)值大于所有節點連接度2倍中位數為標準進行篩選,確定關鍵節點。

1.5 COVID-19相關靶點構建

本研究基于TTD、DisGeNT數據庫構建COVID-19免疫與炎癥相關靶點。利用在線韋恩圖工具,將COVID-19基因靶點與血必凈注射液活性成分靶點進行映射。

1.6 蛋白質相互作用網絡構建

將COVID-19基因靶點與血必凈注射液活性成分靶點進行映射結果導入STRING數據庫限定物種為Homo sapiens,設定最低要求互動分數為中度信度0.400得到蛋白相互作用(PPI)相關信息。導入Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化,并利用Network analyzer功能對PPI網絡圖進行拓撲分析,根據大于平均Degree值對共有靶點進行篩選分析。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析

篩選出關鍵作用蛋白導入DAVID數據庫,設定“Background”為“Homo sapiens”,P<0.05,分別導出細胞組分(CC)、分子功能(MF)、生物過程(BP)進行GO分析。根基P<0.05,KEGG富集分析,篩選免疫與炎癥反應相關通路。

1.8 成分-靶點分子對接

從PDB數據庫下載SARS-Co V-2 3CL水解酶的3D結構pdb格式文件,移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子,保存為pdb后綴的文件。從PubChem數據庫下載化合物2D結構的sdf格式文件。利用pymol軟件先上傳去水加氫后的蛋白質文件,將其轉化為pdbqt格式文件,采用Auto Dock4.2進行分子對接,選取結合能<-5 kJ?mol-1且構象較好的結果作為分子對接結果。

2 結果

2.1 血必凈注射液活性成分收集與篩選

血必凈注射液中丹參65個活性成分、赤芍29個活性成分、紅花20個活性成分、川芎7個活性成分、當歸2個活性成分,剔除重復數據,血必凈注射液共有116種活性成分,見表1。

2.2 血必凈注射液活性成分-靶點網絡圖

以網絡節點中的拓撲結構特征值“連接度(degree)”成分-靶點網絡圖中,364個節點,1 687條相互作用關系(圖1),即選擇degree大于其中位數值2倍以上的節點作為關鍵候選靶點(degree≥18),得到關鍵靶點59個節點,595條相互作用關系,其中關鍵成分29個。以degree排序前10進行展示(表2),分別是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、山柰酚、丹參酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亞甲丹參新酮、二氫異丹參酮。

2.3 基于抗炎,調節免疫作用血必凈注射液治療COVID-19的潛在靶點

基于TTD、DisGeNT數據庫構建COVID-19的免疫與炎癥反應靶點541個。利用在線韋恩圖工具,將COVID-19基因靶點與血必凈注射液活性成分靶點進行映射得到血必凈與COVID-19共同靶點75個(圖2A)。通過構建成分-炎癥、免疫靶點網絡(圖2B),得到159個節點,1 438條相互作用關系。經degree大于中位數值2倍進行篩選,得到關鍵蛋白靶點55個,關鍵活性成分4個,864條相互作用關系。其中大于平均中介中心性0.014 5的關鍵靶點9個(圖2C)。

圖2 活性成分-炎癥、免疫靶點網絡

2.4 GO富集與KEGG通路分析

利用DAVID數據庫對篩選出的55個關鍵作用靶點進行GO富集分析及KEGG信號通路富集(P≤0.05)分析。GO富集分析得到GO生物進程(biological process,BP)93個,包括RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、內毒素調節信號通路、血管生成、免疫反應、調節細胞增殖等生物過程,分子功能(molecular function,MF)17種,細胞組分(cellular component,CC)11種。根據P值進行排序,選擇前10個進行展示(圖3)。

圖3 GO富集分析

KEGG通路分析得到通路87條,與炎癥免疫相關27條,包括toll樣受體信號通路、甲型流感、T細胞受體信號通路、HIF-1信號通路、炎癥性腸病(IBD)、NF-κB信號通路、細胞因子間受體的相互作用、PI3K-Akt信號通路、RIG-I樣受體信號通路(表3、圖4)。

圖4 KEGG通路分析氣泡圖

表3 KEGG通路分析

2.5 核心成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶分子對接

將“2.2”與“2.3”關鍵活性化合物與SARS-Co V-2 3CL水解酶對接,選取結合能<-5 kJ?mol-1,篩選出12種活性化合物,見表4與圖5。

圖5 部分關鍵活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶對接結果

表4 關鍵活性化合物對接結果

3 討論

COVID-19患者大多表現為發熱、乏力和干咳等癥狀,預后良好。但少數重型和危重型患者可快速進展為膿毒癥休克、出凝血功能障礙及多器官衰竭等,往往預后不良。而研究發現SARS-Co V-2感染導致的免疫反應過激與炎癥因子風暴是上述并發癥產生,以及患者死亡的罪魁禍首[3]。血必凈注射液是我國被批準治療膿毒癥、全身炎癥反應綜合征及多器官衰竭的中成藥,由丹參、紅花、當歸、赤芍、川芎組成,起效迅速、療效顯著[13]。自COVID-19暴發以來,血必凈注射液在治療危重型肺炎患者中發揮重要作用[14]。但其具體作用于SARS-Co V-2的分子機制尚不十分清楚。因此,本研究采用網絡藥理學方法結合分子對接技術,從“藥物-靶點-通路”角度入手,探討血必凈注射液治療SARS-Co V-2的分子機制,為臨床合理應用提供科學依據。

利用TCMSP收集血必凈注射液共有116種活性成分。經TCMSP、DrugBank數據庫篩選關鍵靶點59個節點,595條相互作用關系,其中關鍵成分29個。排序前十的核心化合物分別為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、山柰酚、丹參酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亞甲丹參新酮、二氫異丹參酮。經TTD、DisGeNT數據庫篩選出COVID-19相關的免疫與抗炎相關靶點541個,在這些靶點中,血必凈與COVID-19交集有75個共同靶點。構建中藥-成分-靶點網絡圖;利用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖,篩選出關鍵蛋白靶點55個,關鍵活性成分4個,864條相互作用關系。其中大于平均中介中心性0.014 5的關鍵靶點9個,分別是PTGS2、IL6、PTGS1、ADRB2、NR3C1、PPARG、VEGFA、TP53、HSP90AA1。

GO富集分析結果顯示,與關鍵靶基因相關的生物過程主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、內毒素調節信號通路、血管生成、免疫反應、調節細胞增殖等生物過程,提示血必凈注射液通過調控這些生物過程從而抗COVID-19。KEGG通路分析關鍵靶點與免疫炎癥相關27條,包括toll樣受體信號通路、甲型流感、T細胞受體信號通路、HIF-1信號通路、炎癥性腸病(IBD)、NF-κB信號通路、細胞因子間受體的相互作用、PI3K-Akt信號通路、RIG-I樣受體信號通路,其中NF-κB信號通路在炎癥反應和免疫調節中發揮重要作用[15-16],可減輕SARS-Co V-2引起炎性因子釋放和異常增多,減少肝、肺、腎等組織的損傷[17-18]。同時發現,IL6、PTGS2等靶點參與上述多條炎癥信號通路,表明血必凈注射液可通過免疫調節,抑制細胞釋放炎性因子,從而降低SARS-Co V-2對肺組織的損傷,促進肺部細胞的修復與再生,達到緩解肺炎癥狀的效果[19]。分子對接結果顯示,血必凈注射液主要活性成分與SARSCo V-2 3CL水解酶這一具有較好的結合活性,分子構象結合穩定,進一步驗證了血必凈注射液可通過與SARS-Co V-2靶蛋白結合起到抗COVID-19的作用。

綜上,本研究以血必凈注射液的活性成分、靶蛋白、信號通路的調控網絡為基礎,通過網絡藥理學、分子對接揭示血必凈注射液對COVID-19免疫調節與抑制炎癥的作用機制,為臨床應用血必凈治療重癥COVID-19患者提供理論參考。