三陰性乳腺癌發生發展相關環狀RNA研究進展

戴嘉婧 韓馨樂 鐘福波 林哲廣 江淑琪 韋偉 方征宇

據2018年全球癌癥數據統計，乳腺癌仍然是女性最常見的癌癥，也是女性患癌導致死亡的主要原因，2018年約有209萬新發診斷的乳腺癌病例和63萬的乳腺癌死亡病例，分別占女性癌癥總發病率的24.2%和女性癌癥死亡率的15%[1]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)因免疫組化特征缺乏雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及表皮生長因子受體2(HER2)而得名，占所有乳腺癌的15%～20%[2]。TNBC侵襲性高，復發率高，對內分泌治療反應不敏感，缺乏有效個體化治療方案。有研究發現，年齡作為評價TNBC預后的獨立危險因素，因TNBC的高異質性而呈現出手術后年齡越小，預后越差的臨床特征[3]。隨著非編碼RNA研究的深入，越來越多的非編碼RNA因為其與TNBC的密切相關性而有成為潛在靶點的可能性。最近幾年，關于環狀RNA(circRNA)異常與TNBC相關性的研究和報道迅速增加。本文對TNBC和circRNA相關內容進行綜述。

一、TNBC的分子靶點研究進展

分子靶點的確定是研發治療TNBC藥物的基礎，目前針對TNBC分子靶點的研究主要圍繞乳腺癌發生發展的易感基因及其表達產物、信號通路相關的轉錄因子、非編碼RNA等。首先，基因組學、轉錄組學及蛋白質組學的研究在不斷擴大我們對TNBC生物異質性和復雜性的認識。例如，核受體家族的雄激素受體(androgen receptor,AR)在TNBC中的表達率約為20.7%，其作用于靶基因在乳腺癌的發生發展中扮演著重要角色，AR陽性的TNBC病人有更好的總生存率，提示AR有成為TNBC新的預后指標的可能性[4]。其次，FDA批準的治療方案包括針對BRCA基因突變和表達PD-L1的TNBC病人分別使用PARP抑制劑(poly-ADP-ribose polymerase)和阿特珠單抗聯合紫杉醇治療[5]。其他常見分子靶點包括EGFR、VEGFR/VEGFR、PI3K/mTOR等，然而這些都是在腫瘤治療中廣泛應用的分子靶點，特異性不高。值得一提的是，有研究發現TNBC信號通路下游的核心轉錄調控分子TAZ和YAP的表達與TNBC腫瘤大小、分級呈正相關，且在促腫瘤發生方面二者具有協同作用[6]，提示其潛在應用性。

近年來，隨著非編碼RNA研究的廣泛深入，與TNBC發生發展相關的非編碼RNA研究也不斷見于報道。其中，很多微小RNA(microRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA)都與TNBC發展密切相關而且可作為分子治療的靶點[7-9]。circRNA作為一類特殊的非編碼RNA，也已有不少報道與TNBC的發生發展密切有關。

二.circRNA及其在腫瘤發生發展的作用

circRNA是非編碼RNA家族中最晚發現的RNA，通常是由蛋白質編碼外顯子的反向剪接產生的，其特征是存在通過反向剪接連接3'和5'末端的共價鍵，如由內含子反向重復序列如Alu元件或RNA結合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)如QKI蛋白介導的反向剪接機制生成了circRNA[10]。circRNA具有共價閉合環形結構且無5'端帽子結構和3'端多聚A尾結構，這使circRNA能耐受核酸外切酶的消化而保持相對穩定[11]。circRNA在組織和發育的特定階段中差異性表達，并且顯示出跨物種的保守性。

據文獻報道，在腫瘤發生發展過程中，circRNA主要是通過影響腫瘤細胞的增殖、上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等過程調控腫瘤細胞的生物學行為[12]。具體來說，circRNA可通過影響MAPK/ERK通路、PI3K/AKT通路或影響周期調控點等來調控腫瘤細胞增殖。例如在PI3K/AKT通路中，配體與受體酪氨酸激酶結合，激活PIK3進而使AKT磷酸化促進細胞增殖，在這一過程中，CDR1as和circNT5E通過促進PIK3的表達來調控肝癌細胞的增殖進程[13]。

三、TNBC病人癌與癌旁組織中差異表達的circRNA

1表達上調的17個circRNA ：高通量測序技術的發展使得TNBC中的大量異常表達的circRNA被發現。與正常癌旁組織相比，表達上調的circRNA有circGFRA1、circEPSTI1、circUBAP2、circANKS1B、circPLK1、circKIF4A、circTFCP2L1、circAGFG1、circRNA_069718、circRAD18、hsa_circ_0091074、circGNB1、circIFI30、circSEPT9、hsa_circ_0005320、hsa_circ_0058514、ciRS-7。其中，ciRS-7作為最早被發現的circRNA，廣泛地在各種不同腫瘤中發揮作用，如ciRS-7高表達可以促進乳頭狀甲狀腺癌的增殖[14]，且高表達ciRS-7宮頸癌病人其腫瘤浸潤程度和淋巴結轉移可能性都更高；孟令嬌等[15]研究表明，在TNBC病人中，ciRS-7的高表達也與腫瘤浸潤和淋巴結轉移明顯相關，但ciRS-7在TNBC中是通過何種下游分子靶點發揮作用有待進一步實驗證實。

2.表達下調的4個circRNA ：與正常癌旁組織相比，TNBC中表達下調的circRNA有circITCH、circAHNAK1、circTADA2A-E5 / E6、circFBXW7。其中，circITCH作為腫瘤抑制因子在其他的腫瘤中的表達水平也顯著下調，如結直腸癌、神經膠質瘤、肺癌[16]。而circFBXW7通過編碼蛋白質來抑制TNBC細胞的增殖和遷移能力[17]。

四.circRNA調控TNBC發展的不同分子機制

1.circRNA主要通過miRNA海綿作用在TNBC中調控下游靶基因：其中 ，與表達上調的circRNA結合的miRNA在TNBC中的表達水平都為下調，相反，與表達下調的circRNA結合的miRNA在TNBC中的表達水平都為上調，即miR-214、miR-17、miR-421、miR-203a-3p、miR-197-3p在TNBC中為促腫瘤因子，而與TNBC中表達上調的circRNA所結合的miRNA為TNBC中的抑癌因子。值得注意的是，miR-7在很多其他研究中證明不只可以結合circRNA，如第一個被發現的ciRS-7,還可以結合其他非編碼RNA如長非編碼RNA LINC00115進而促進乳腺癌的轉移[18]。盡管hsa_circ_0005320、hsa_circ_0058514、ciRS-7都有實驗證明其高水平可以促進TNBC的增殖等腫瘤生長效應，但其機制是否是通過結合miRNA分子有待進一步實驗證實。

2.circRNA直接翻譯蛋白質調控TNBC：FBXW7-185aa被證實有抑制神經膠質瘤細胞增殖和遷移的功能，隨后研究發現circFBXW7編碼的FBXW7-185aa蛋白也可以有效地抑制TNBC的發展[17]。通過熒光素酶報告基因實驗和RNA免疫沉淀實驗顯示，circFBXW7不僅可以充當miR-197-3p的海綿進而上調FBXW7表達來抑制TNBC的生長和轉移，其編碼的FBXW7-185aa蛋白通過增加FBXW7的豐度并誘導c-myc降解也可以抑制TNBC細胞的增殖和遷移能力[17]。

3.circRNA間接調控其親本基因或非親本基因 ：目前報道的circRNA中有5個通過結合miRNA后調控的下游靶基因為該circRNA的親本基因。circGFRA1可通過結合miR-34a來調控其親本基因GFRA1促進TNBC的細胞增殖[19]；circITCH是通過結合miR-214和miR-17來調控其親本基因ITCH的表達[16]；circKIF4A發揮miRNA海綿功能結合miR-375來調控其親本基因的KIF4A的表達[20]；circPLK1發揮miRNA海綿功能結合miR-296-5p來調控其親本基因的PLK1的表達[21]；circFBXW7結合miR-197-3p來上調其親本基因FBXW7的表達[17]。

受到circRNA間接調控的非親本基因中，circIFI30通過circIFI30-miR-520b-3p-CD44軸調節CD44，在乳腺癌細胞中，CD44的丟失會導致腫瘤形成延遲[22]。因此，circIFI30激活CD44的表達進一步促進TNBC的進展。circAGFG1通過circAGFG1-miR-195-5p-CCNE1軸調節靶基因CCNE1，研究證實circAGFG1的過表達會增加其靶基因CCNE1的mRNA和蛋白質水平，而CCNE1為細胞周期蛋白E基因，研究發現其與腫瘤如子宮內膜癌的發生密切相關[23]，因此該軸的激活與促進TNBC細胞增殖有關。

4.circRNA參與調控腫瘤相關信號通路：據文獻報道，TNBC相關的circRNA參與調控的信號通路有經典Wnt/β-catenin通路、LIF/Stat3通路等。其中，低表達的circITCH通過circITCH-miR-214/17-ITCH軸激活其親本基因ITCH，而ITCH是Nedd4樣E3家族的一部分，它可以降解磷酸化后的無序結構，從而使得經典的Wnt信號通過失活[16]。而circTADA2A-E6可能參與調控了PI3K-AKT和mTOR信號通路[24]，但研究只是通過敲低或過表達circTADA2A-E6引起的細胞功能改變作以推測，具體是否引起該信號通路相關分子水平的變化需進一步實驗證實。

EMT受到信號通路的精確調控以確保不同分化的細胞在正確的時間內正確定位，在癌癥發生的在早期如果EMT激活不當，就會導致癌細胞發生遷移和侵襲。EMT主要由TGF-β家族配體誘導，它刺激R-SMADs和co-SMADs的磷酸化和核易位以激活SNAI，bHLH和ZEB轉錄因子[25]。在TNBC中，circANKS1B通過海綿作用結合miR-148a-3p和miR-152-3p的作用，增加轉錄因子USF1的表達，并上調TGF-1的表達，從而激活TGF-1/Smad信號通路來促進EMT的發生[26]。

五、circRNA有望作為分子標志物輔助診斷和治療TNBC

研究發現，血液或唾液中的外泌體可以分泌出circRNA，因其具有共價閉合結構不易被核酸外切酶消化，表達水平保持相對穩定。因此circRNA可以作為生物標志物，對診斷包括腫瘤在內的很多疾病有重要的意義[27]。同時，血液或唾液中的circRNA相較易降解的miRNA更適合作為分子標志物監控TNBC的腫瘤負荷。例如有研究報道，血漿外泌體中高表達的circPDE8A與胰腺導管癌病人的生存及預后呈負相關，而通過血液外泌體可以檢測到病人circPDE8A的表達量[28]。而關于TNBC病人血液外泌體中circRNA的研究，目前只有腫瘤抑制因子circFBXW7可以在外泌體中被檢測到的相關報道[17]。

在治療方面，有研究指出細胞外囊泡作為生物分子的內源性載體，參與到細胞間物質的運輸及信息的交換，細胞外囊泡有可能將抑癌circRNA作為血液中循環生物標志物，準確地傳遞到作用位點，因此抑癌circRNA可能將作為工具在臨床上用于TNBC的治療[29]。